がん悪性化-2015 May27

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nj-150527
細胞周期と癌の悪性化
Cell cycle and tumor malignancy
～ゲノムの不安定性が癌を悪性化させる～
～Genome instability augments malignancy～
Title
大阪大学・微生物病研究所：野島博
RIMD, Osaka Univ. Hiroshi Nojima, Ph.D.
生命機能研究科講義: 平成27(2015)年5月27日(水)
レポート課題(Report subjects)
1
（１）講義の内容から１つのキーワード（あるいはテーマ）を選
び、その解説を６００～８００字の日本語で記せ
（解説図を必ず１枚含めること）。
Select one key word in my lecture and explain it with 600-800 words in
English; never forget to attach at least one figure.
（２）４つのパートごとの講義内容理解度を数値で示せ :
Evaluate how well you understood each part of the lecture (4 parts):
極めてよく理解できた (+5) ～殆ど理解できなかった (-5)
Very well understood (+5) ～ Very poorly understood (-5)
（３）講義の感想を２００字以上で記せ。
Describe about the impression of this lecture with >200 words in English.
#1 図1-1
本日の講義内容
Contents of today’s lecture
Part 1
癌の悪性化とは何か？ What is tumor malignancy?
Part 2
がん治療薬としての分子標的薬（イレッサなど）
Molecular-targeted drugs such as iressa
as a useful anticancer therapy
Part 3
新しい癌の治療法
Future aspects of cancer therapy
2
癌におけるゲノムの不安定性とそれを標的とした診断・治療の可能性
Genome instability in cancer cells; possible diagnosis and
therapy that targets the genome instability
.
Part 4
研究紹介： ELAS1ペプチドの同定と抗癌作用
Introduction to one of our research projects:
Identification and anti-cancer effects of ELAS1 peptide.
Part 1
3
癌の悪性化とは何か？
What is tumor malignancy?
癌におけるゲノムの不安定性と
それを標的とした診断・治療の可能性
Genome instability in cancer cells; possible diagnosis and
therapy that targets the genome instability
#.
Human body consists of ~ 6 x 1013 cells
Diameter of human cell is
about 40 micrometer in
average.
Human
4
Size of human body is
about 1.6 meter.
= 6.4 x 1013
One dimensional ratio between
these values is 40,000.
Thus, three dimensional size
difference is 6.4 x 1013.
This means that human body
may consist of 6.4 x 1013 cells.
Tumor is derived
from a single
cancer cell.
Four kinds of malignant tumors
「癌」は皮膚や内臓の表面など上皮性の悪性腫瘍
Carcinoma is
tumor tissue
derived from
putative epithelial
cells that contact
with external
environment.
5
Leukemia is a
malignant disease,
or cancer, of the
Leukocytes in
blood and bone
marrow.
、神経性腫瘍
Sarcomas (Greek for
“fleshy tumors”) are
derived from
mesenchymal (間葉
系) tissue, the tissue
forming the structure
of the body.
Lymphoma is a
cancer that starts
in cells called
lymphocytes.
悪性腫瘍（malignant tumor）
癌腫（carcinoma）：上皮組織由来の悪性腫瘍
肉腫（sarcoma）, 神経芽細胞腫（neuroblastoma）：非上皮組織由来の悪性腫瘍
白血病（leukemia）
リンパ腫（lymphoma）
Cancer is a disease of the genome (DNA)
「がん」はゲノム(DNA)の病である
6
Most of the tumors are due to acquired, but not inherited, abnormality in a
specific gene; a proto-oncogene or a tumor suppressor gene.
大部分のがんは後天的な特定遺伝子の異常に起因する。
原癌遺伝子の過剰発現や癌抑制遺伝子の欠損による場合もあるが、これらは遺伝性ではない。
Rarely, the following cases are hereditary cancers.
ただし、ごくまれに遺伝的原因に起因する遺伝性のがんもある。
１）遺伝性の乳癌、子宮癌：BRCA1遺伝子の欠損。Hereditary breast and uterine cancers; defects in BRCA1
gene.
DNA diagnosis of BRCA1 gene is practically available.
２）多発性内分泌腺腫（multiple endocrine neoplasia; defects in MEN types 1, 2a, 2b genes）
- 遺伝子MEN types 1, 2a, 2bの欠損による種々の内分泌腺の腫瘍
３）Li-Fraumeni症候群（Li-Fraumeni syndrome; defects in p53 gene）
- p53遺伝子の変異による骨肉腫、乳がん、軟組織肉腫、脳腫瘍など種々の腫瘍。
４）家族性大腸腺腫症（Familial adenomatous polyposis; defects in APC gene）
- APC遺伝子の変異による若年期の大腸癌の発症。
５）遺伝性非ポリポーシス大腸癌（Hereditary nonpolyposis colorectal cancer; defects in hMLH1, 2, 6 genes）
- hMLH1, hMSH2, hMSH6などDNA修復遺伝子の変異による若年期の大腸癌の発症。
６）網膜芽細胞腫（Retinoblastoma; defects in Rb gene ）
- Rb遺伝子の変異による幼少期で網膜内に発生する癌。
７）フォン・ヒッペル・リンドウ病（von hippel Lindau disease; defects in VHL gene ）
- VHL遺伝子の変異により若年期に高頻度に多発性嚢胞腎を発症し、後に腎癌を発生する。
DNA damage is caused by environmental stimuli and aging.
7
DNAは環境からの刺激や加齢により損傷する
UV or gamma ray
from the Universe
or nuclear accident.
Various causes of DNA damage
Spontaneous mistakes in DNA
replication and repair
Pathogen
Inhaled chemical
carcinogen
Exhaust gas
Virus,
Helicobact
er pylori
Spontaneous cellular
dysfunction
Chemical carcinogen
dissolved in food
Cancer cells divide and grow uncontrollably, forming malignant tumors, and invade
nearby parts of the body.
Cancer cells require
no scaffold for their
growth; they cannot
arrest growth due
to lack of contact
inhibition.
接触阻害異常は Lats2欠損に由来する
Loss of contact inhibition in
cancer cell is due to the defect in
the Hippo pathway where Lats2
kinase is one of the major players.
がん細胞は足場が不
要なため
接触阻害が起きず、増
殖停止できない
Malignant tumor cells
invade and metastasize
nearby parts of the body.
悪性化すると浸潤・転移する
Chromosomes are unequally
distributed into daughter cells
がん細胞の染色体は不均等に
分配される
8
Cancer cells are
immortalized and
continue their endless
growth
がん細胞の増殖は不死化
されていて際限なく増殖し
てゆく
Cancer cells show
chromosome
instability
染色体不安定性の
獲得
Vogelstein’s model for multi-step tumorigenesis of colon cancer
Cancer is caused by sequential mutations of specific
oncogenes and tumor suppressor genes.
Normal epithelial cell
Mutation in a proto-oncogene
Cell hypertrophy
Demethylation of DNA
Adenoma
K-ras mutation (Chr-12)
ゲノムの不安定性
と癌の悪性化
が始まる境界線
P53の欠損
This is the
boundary where
chromosomal
instability
begins to form
malignant tumor
Loss of DCC
(Chr-17)
Loss of p53
Loss of p53
(Chr-18)
Metastasis
9
Cancer cells show abnormal
M phase progression during the cell cycle
10
がん細胞は細胞周期の進行が異常となっている
静止期
（Go phase）
M phase
progression is
abnormal
In particular, abnormal regulation in the spindle assembly checkpoint (SAC) of cancer cells causes
chromosome instability, thereby leading to augmented malignancy of cancer cells.
とくにＭ期の紡錘体チェックポイント制御の異常が染色体不安定性を介した癌の悪性化を引き起こす
What is cell cycle checkpoint ?
A
11
Normal progression of cell cycle
a
b
Checkpoint factor
DNA damage
B
a
c
b
Checkpoint factor arrests cell cycle progression until
the defect is properly repaired.
図29；チェックポイント制御の原理。(A)通常は細胞周期は順調に進行しています。（B)もし、ある過程に異
状が生じると、その信号がチェックポイント因子（ｃ）に伝えられます。活性化されたチェックポイント制御
機構因子は異常が修復されるまで細胞周期の進行を停止させておきます。
.
What is chromosomal instability of cancer cells ?
12
DNA replication
of cancer cells is
retarded
Chromosome of
normal cells
Normal
segregation
Chromosome
segregation
Abnormal M phase
checkpoint regulation
initiates premature
chromosome segregation
Ｍ期の紡錘体チェックポイント制御の
異常によりDNA 複製の途中で染色
体分配が開始してしまう
Chromosome
is torn off
Only ~1000 genes are required for cellular growth
Unicellular
organism
Normal
cell
13
Essential genes for
cell growth
Required genes for
coordination with
other cells
Deletion of nonessential genes are
OK for growth of
cancer cells
Cancer
cell
What is proto-oncogene?
14
がん原遺伝子（原型がん遺伝子：Proto-oncogene）とは？
Normal expression
Normal gene
Normal growth
Over-expression
Cancer cell
Mutated proto-oncogene
Over-expression of
mutated protooncogene
Cancer cell
Proto-oncogene
causes cancer
when it is overexpressed.
Mutated protooncogene is a
potent cancercausing gene,
particularly
when it is overexpressed.
The experiment that lead the discovery of proto-oncogene.
15
Grind the tumor
Inject it into a
healthy chicken
Tumor
Tumor formation
was observed at
the injected site
Oncogenic virus discovered from avian sarcoma.
Genome structure of retrovirus
16
Src-carrying retrovirus
Infection
Infection
Transformation
v-src
=viral src
Infection and steal c-src (cellular
src) from the genome
Over-expression of activated c-src (v-src)
Classification of proto-oncogenes
がん原遺伝子（原型がん遺伝子：Proto-oncogene）の分類
Growth factor
Steroid hormone
Growth factor
Cys rich
region
Growth signal
Protooncogene
products
transmit
growth signals.
Transcriptions of growth promoting genes
EGFR
EGF
17
Two hit model of Knudson lead the discovery of Rb gene
癌抑制遺伝子（pRB）の発見を導いたクヌーツソンのツーヒットモデル
In babies from normal
parents, two hits (second
mutation), but not a single
hit, induces cancer.
Single hit
Two hits
Normal
Cancer
Rb: retinoblastoma
In babies from a carrier
mother or father, a single
hit induces cancer.
Single hit
18
From a carrier mother/father (y=ax)
Two hits
Time lag
From normal parents (y=ax2)
Normal
Cancer
Loss of Rb gene leads to tumor formation
癌抑制遺伝子（たとえばpRB）が欠損すると細胞は癌化する
Normal
pRB inhibits
activation of DP-1/EF2
transcription factors
that induce
transcription of S
phase promoting
genes.
Normal
pRB
Abnormal pRB
G1/S phase
19
Abnormal
pRB fails to inhibit
activation of DP1/EF2, thereby
constantly inducing S
phase initiation,
namely, continuous
cell cycle
progression.
Loss of Rb protein (pRB) fails to stop the cell cycle at G1/S phase
pRBの欠損により細胞周期（S期開始）が停止できなくなる
Mutations of p53 tumor suppressor gene is
frequently observed in cancer patients
20
多くのヒトの癌細胞で欠損が見つかるp53も癌抑制遺伝子で、
多彩なp53の機能が正常に働かないため細胞は癌化する
p53 is the
guardian of
the genome
p53はゲノムの
守護神と呼ばれ
ている
p53 plays multiple
important roles
p53は数多くの重要
な役割を果たす
Defects in p53 gene cause dysregulation of checkpoint control, thereby inducing
genome instability of cancer cells.
p53の欠損によりチェックポイント制御が効かなくなり染色体不安定性が増悪する
p53 regulates replication and maturation of centrosome
p53は中心体の複製や成熟を制御する
21
Mitosis
細胞分裂
Cell death
細胞死
Three centrosomes are observed in
p53 defective cells
３極/５極紡錘体を持つp53欠損細胞核
Mitosis
細胞分裂
多極紡錘体を
持つp53欠損
細胞核
Abnormal number of centrosome
causes chromosome instability
中心体数の異常は
染色体不安定性を引き起こす
Malignant
tumor
悪性化した
がん細胞
Malignant
tumor
悪性化した
がん細胞
Cell death
細胞死
Multiple centrosomes are observed
in p53 defective cells
図89；ｐ53は中心体の複製や成熟も制御します。そのためp53の欠損した細胞では紡錘体極の数が異常になり、細胞
分裂ごには細胞は異常な染色体を持ちます。それらの細胞の多くは死滅しますが、なかには染色体不安定性を獲得
.
したまま生き延びて悪性のがん細胞となるものも出てきます。
Life style to inhibit carcinogenesis
癌を防ぐ生活習慣
22
Anti-mold agents included in
imported fruits may cause cancer
輸入フルーツに含まれている防かび剤も
発がん性が疑われている。
ポストハーベスト農薬： post-harvest chemicals
Anti-mold agent; 防カビ剤
オルトフェニルフェノール
orthophenyl phenol; OPP
ポリ塩素化ビフェニル
polychlorinated biphenyl; PCB
チアベンダゾール
Thiabendazole:TBZ
Insecticide （Piperonyl butoxide, PBO）
防虫剤（ピペロニルブトキシド）
Nitrous acid may induce cancer
Lemons, grapefruits, banana, potato and grains
レモン、グレープフルーツなどの柑橘類、
バナナ、ジャガイモ、穀物
UV light is classified into UV-A, -B and -C
23
It is recommended to avoid from UV light (UV-A and –B).
Part 2
24
Molecular targeted drug
is useful as anti-cancer therapy
有用ながん治療薬としての
分子標的薬
.
Conventional anticancer drug kills both
normal and cancer cells, so far as they
are growing.
従来の抗がん剤はがん細胞の増殖が速いと
いう特徴に注目しているので
増殖する細胞を無差別に殺す。
25
This causes severe side effects, damaging
immune cells, intestine cells, hair matrix cells etc.
増殖している正常細胞（免疫系、小腸細胞、毛根
細胞など）も無差別に殺すので副作用がきつい。
.
Conventional anticancer drug inhibits S phase or M
phase progression of both normal and cancer cells
26
従来の抗がん剤は、がん細胞と正常細胞のS期またはM期の進行を阻害する
静止期
（Go phase）
Inhibition of
S phase
S期進行阻害
Inhibition of
M phase
M期進行阻害
Inhibition of M phase
M期進行阻害
27
Inhibition of S phase
S期進行阻害
Inhibition of S phase
S期進行阻害
図8-1：がんの化学療法に使われる薬剤。(a)メソトレキセートは核酸の前駆体である葉酸代謝酵素の基質のひとつに構造が類似し
ているが役立たないため、間違って取り込んだ細胞のDNAの複製を阻止することで細胞増殖をS期で停止させる。(b)フルオロウラ
シル(5-FU) は構造がウラシルと似ているが機能できないため、間違って取り込んだ細胞の増殖を阻害する。(c)シスプラチンは中央
に白金を含み、DNAの中にはまり込んで、DNAの複製と分配を阻止することで細胞増殖をS期で停止させる。(d)パクリタキセルは
植物アルカロイドで、DNAを細胞分裂の時に分配する微小管の微小管の脱重合を阻害することで、細胞増殖をM期で停止させる。
(e)マイトマイシンCはDNAの小溝に沿うようにはまり込んでDNAの動きを封じることで細胞増殖を阻害する。(f)アンスラサイクリン
類はDNAの塩基対間の隙間に挟みこまれる形で挿入されることで、DNAの複製と分配を阻止することで細胞増殖を阻害する。
分子標的薬は
28
一つの異常分子のみを特異的
に阻害する薬剤である。
Molecular targeted drugs
specifically inhibit the
function of targeted
proteins
.
List of molecular target drugs presently used at the bedside
29
…mab means （Monoclonal
Antibody）
抗体製剤（青字）はマブ
という略称を持つ。
Iburitumomab
omab(o=mouse) means mouse
Mab
Gefitinib (iressa) will be
explained in detail.
rituximab
ximab（xi=chimeric） means
chimera of mouse and human
Mab
alemutuzumab (anti-CD52)
（zu=humanized）
means humanized Mab
Panitumumab
umab(u=human) means
complete human Mab
…nib comes from （inhibitor）
ニブという略称はプロテインキ
ナーゼ阻害薬(化学製剤)を意味
する。
Herceptin (trastuzumab) inhibits dimerization of HER2
30
Herceptin
= antibody
Ligand
binding is
inhibited
HER2
No more
signaling
Herceptin = antibody
HER2
Apoptosis of cancer cell
NK cell
HER2
図44：トラスツズマブ（ハーセプチン）の作用の仕組み。(a)上皮性細胞成長因子受容体は膜貫通型受容体チロシンキ
ナーゼであり、構造が類似したHER1(EGFR),HER2,HER3,HER4の４種類が知られている。それに結合して細胞外の
増殖信号を細胞内に伝える働きをするリガンドにはEGF,TGF-α,アンフィレギュリンなど１３種類も知られているが、HER2
には未だリガンドが見つかっていない。またHER3はチロシンキナーゼ部位が失活している。(b)トラスツズマブはこのうち
HER2の細胞外領域に結合してHER2の機能を阻害するモノクローナル抗体製剤である。(c)トラスツズマブの薬効の一
部は抗体依存性細胞障害によって説明される。
Iressa (gefitinib)
31
Anticancer drug especially for non-small cell lung cancer
an epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor
Crystal structure of
EGFR kinase domain and Iressa
EGF
EGF receptor
Iressa
ATP
ATP
Yun CH et al., Cancer Cell (2007), 2ITY
Gefitinib (Iressa)
Induction of apoptosis
Growth suppression
Function of EGF receptor (ErbB) and erbB (a proto-oncogene)
32
Growth signal;
Always ON!
Phosphorylation target
Enhanced expression of target gene
Iressa (gefitinib); Good or Bad?
Good for;
Bad for;
Super-responder
Adverse effects
Asian, female,
and non-smoker.
33
(~0.7% of patients)
Acute lung injury
Interstitial pneumonia
Iressa (gefitinib) potently inhibits tumor cells harboring
mutations of EGFR gene.
EGFR
gene
34
Gefitinib is supereffective to the
patients whose
EGFR genes of
cancer cells
harbor these
mutations.
EGFR
protein
図８－３：ゲフィチニブ(商品名イレッサ)の構造と働く仕組み。(a)ゲフィチニブはEGFRの細胞質側にあるチロシンキナーゼ
（TKATP）領域に特異的に結合する阻害剤で、EGFRの自己リン酸化を阻害する事でシグナル伝達を妨害し、EGFRを過
剰発現しているがん細胞の増殖を阻止してアポトーシスにより殺傷する。(b)ゲフィチニブが薬効を示す非小細胞肺がん患
者において頻繁に見つかるEGFR遺伝子の変異点。Δ746-750はこの位置で５個のアミノ酸が欠失しているしていることを
示す。Ins747-753はこの位置にアミノ酸の挿入が見つかることを意味する。これらの変異が見つかった場合にはゲフィチ
ニブが劇的に効くことが期待できる。
Imatinib mesylate (Gleevec®) inhibits ABL kinase
ABL kinase
Tyr phosphorylation
経口化学製剤
Oral formulation
Growth
Application of imatinib
causes cell death of
cancer cells with
enhanced expression of
ABL kinase.
35
Molecular mechanism how Gleevec (Imatinib)
functions as an anti-tumor drug
36
図36：イマチニブ（グリベック）の
働く仕組み。
Fusion of Bcr-Abl genes
causes overexpression
of Abl protein.
(a)殆どの慢性骨髄性白血病患
者では、がん化した白血球細胞
の９番目（Ablが配座）と２２番目
（Bcrが配座）の染色体が相互
転座したフィラデルフィア染色体
（Ph）を持って異常Bcr-Abl融合
タンパク質を発現している。
(b)イマチニブはATP の入るポ
ケットをふさぐように入り込み、
キナーゼ活性発動を妨害する。
(c)移行期や急性転化期の患者
では新たな変異によりイマチニ
ブ耐性となる。それを乗り越え
るために新規な薬剤が開発され
ている。
Part 3
新しい癌の治療法
Future aspects of cancer therapy
1) ミアとオンコミア miRNA and OncoMiR
2)エクソソーム Exosome
3)がん幹細胞 Cancer Stem Cells（CSCｓ）
4) がんの遺伝子治療 Gene therapy of cancer
37
ミアとオンコミアとは何か？
What is miRNA and OncoMiR?
38
Transcription of OncoMiR
miRNA
(A)n
癌抑制遺伝子から転写されたmRNAの翻訳抑制
Suppression in translation of mRNA
transcribed from tumor suppressor gene
Same as disruption of tumor suppressor gene
癌抑制遺伝子の欠損と同じ効果
腫瘍形成 Tumor formation
エクソソーム（exosome）とは何か？
39
What is exosome?
**
直径30-100nmの小型膜小胞
Small vesicles (diameter: 30-100 nm)
エクソソーム（exosome）
＝エクソゾーム
＝エキソソーム
エクソソーム
Endocytosis
エンドサイトーシス
初期エンドソーム（EE）
Early Endosome
エキソサイトーシス
Budding
出芽
多胞体（MLV）
Multilamellarvesicle
ライソゾーム
エクソソームの形成と放出の仕組
み。
Exosome formation and release
.
エクソソームの中には多彩なmRNAやタンパク
質のみでなく、miRNAも多種類存在する。
Exosomes include not only mRNAs and
proteins but also miRNAs.
Exosomal miRNAs
40
エクソソームは分泌細胞とその標的細胞の間で
蛋白質や脂質を交換する重要なメッセンジャー
である。
Exosomes are important messengers that
exchange proteins and lipids between
secretary cells and target cells.
血清からは４億個以上の
細胞培養液からは約６８億個の
エクソソームが採取できる。
Serum contains > 4 x 10 8 exosomes.
Cell culture supernatant contains
> 6.8 x 109 exosomes.
.
エクソソームは腫瘍細胞による免疫抑制誘導に関
与する可能性が示唆されている。
Exosome may cause immunosuppressive
effects induced by tumor cells.
41
腫瘍由来のエキソソームは、腫瘍形成
メディエーターである。
Exosomes derived from tumors
are the mediators of tumor
formation.
がん幹細胞とは何か？
What is Cancer Stem Cells（CSCｓ）?
42
X-ray
Chemicals
X線治療
抗がん剤治療
Cancer cells die
普通のがん細胞
は死滅する
Non-growing
CSC remain alive
増殖していない
CSCは健在
Relapse of cancer
がんの再発
CSC
Cancer cell
普通のがん細胞
Gradual death of cancer cells
普通のがん細胞は徐々に減少する
Application of CSC-specific
anti-CSC drug
CSCのみを殺す薬剤の投与
Annihilation of
cancer cells
がんは全滅！
がんの遺伝子治療とは何か？
What is gene therapy of cancer?
43
血中循環がん細胞
（Circulating Tumor Cell: CSC）
の早期発見
TelomeScan detects small tumors and
circulating tumor cells (CSC).
Telomelysin specifically kills cancer cells
ヒトの逆転写酵素（hTERT）を発現するテ
ロメスキャンの構造。
Structure of TelomeScan that can
expresse hTERT (Telomerase reverse
transcriptase).
がん細胞の中だ
けで増えてがん
細胞を破壊する
ことが
Gene therapy of cancer
がんの遺伝子治療
44
岡山大学・
藤原俊義教授
Prof. Fujiwara;
Okayama Univ.
テロメスキャンで腫瘍を視覚化する
Vusualize the tumors by
telomescan
テロメライシンで癌細胞のみを殺す
Only cancer cells are killed by
telomelysin
がん細胞の中だ
けで増えてがん
細胞を破壊する
Viruses grow
rapidly in
cancer cells
alone, thereby
killing them
efficiently.
単純ヘルペスウイルス1型（HSV-1）
Herpes Simplex Virus; HSV-1（G47Δ）
45
東大医科学研究所・藤堂具紀教授; Prof. Tomoki Todo, Tokyo Univ.
HSV-1（G47Δ）は
がん細胞の中でのみ
増殖して、がん細胞を
選択的に殺す
HSV-1（G47Δ）
specifically kills
cancer cells
Since HSV-1（G47Δ）lacks
γ34.5 gene, it can synthesize
protein only in cancer cells
because they produce
proteins (e.g. GADD34),
which complements the lack
of γ34.5.
Since ICP6 gene of
HSV-1（G47Δ）is
inactivated, it can
synthesize viral DNA
only in cancer
(growing) cells.
Since α47 gene of HSV-1
（G47Δ）is deleted, it can
efficiently replicate only
in cancer cells.
Moreover, this deletion
enhances antitumor
immunity.
単純ヘルペスウイルス1型（HSV-1）
第3世代HSV-1（G47Δ）
東大・藤堂具紀教授
平成21年より悪性脳腫瘍患者を対象に臨床試験を開始
平成25年より前立腺癌患者を対象に臨床試験を開始
HSV-1（G47Δ）は
がん細胞の中でのみ増殖し
たのち、周辺に存在する
がん細胞を次々と殺してゆく
HSV-1（G47Δ）
are distributed
to the
surrounding
cancer cells by
infection
46
E. coli competent cells
Plasmid DNA cannot
enter into an E. coli cell
Preparation of an E.
coli competent cell
Plasmid DNA enters
into a competent E.
coli cell
Loosened membrane of
competent cell is repaired
after incorporation of DNA
competent
47
The essential point of this technique is to vigorously
shake E. coli cells at 18oC for >32 hours.
48
Overnight
culture
Shake at 37oC
for ~12 hours
Pick up a
single colony
3 x 109 cfu/mg plasmid
Streak E. coli stock
on LB plate
Safely stocked for >2 years
in liquid nitrogen
Liq N2
Less than
250 ml
in 5 liter flask
Shake vigrously
>200 rpm
at 18oC for 32 hours
Treatment with
TB solution
Quick chill.
Immerse in
liquid nitrogen
.
This competent cell is cited as
Ultra-Competent cells in “Molecular Cloning”
49
Sambrook
3 x 109 cfu/mg plasmid
Page 1.112-115
Sambrook
大腸菌コンピテントセルの調整と形質転換の手順。
Ultra competent cell
Molecular Cloning: Page 1.112-115
１. 準備するもの：
1) SOB培地
最終濃度
Bacto Tryptone
20g
2.0％
Bacto Yeast extract 5g
0.5％
5M NaC1
2ml
10mM
2M KCl
1.25ml
2.5mM
ミリQ水約990mlを加え全量を 1L に調整してよく混ぜてからオートク
レーブにて滅菌する．使用前に，別滅菌しておいた2M Mg2＋溶液
(1M MgSO4・7H2O＋1M MgCl2・6H2O)を10ml加える。
2) SOC培地
SOB培地に滅菌済み2Mグルコースを1／100量加え，0．22mmを用
いてフィルター滅菌する．保存は4℃。
3) Transformation Buffer <TB>
最終濃度
PlPES
3.0g 10mM
CaCl2・2H2O
2.2g 15mM
KCl
18.6g 250mM
これらを約950mlの滅菌水に懸濁した後，5N KOHにてpHを6.7～6.8
に合わせる(低pHでは白濁状態．pH調整によって溶解する)．
次いで，最終濃度が55mMとなるようMnCl2・4H2O (10.9g)を添加・溶
解し，液量を1Lに調製後，0.22umを用いてフィルター滅菌する．保存
は4℃
4)ＳＯＣ：ＳＯＢ培地に２Ｍグルコースを1/100加える。
5)ＬＢ+アンピシリン寒天培地
6)液体窒素
50
２．コンピテントセルの調製法：
(1) 液体窒素（またはー８０℃ ）保存から取り出した大腸菌をＬ
Ｂ培地にストリークし、３７℃で１～２昼夜培養。
(2) １～３mm径のコロニーをまず、１mlのＳＯＢに懸濁し、一夜
(約12時間）培養する。
(3)この全量を２５０mlのＳＯＢ培地の入った５Ｌの三角フラスコに
移す（１Lのフラスコなら 50ml SOB）。
(4)回転型シェーカーで激しく(>200rpm)振とうし、１８℃（無理なら
室温でも良い）で１９～５０時間培養する。
(5) 培養液が濁ってきたら（ＯＤ600＝０.４～１.５のどこでも良
い）に達したら、培養を止め直ちに氷中にて、１０分間冷却する。
(6) 培養液を５００mlの遠沈管に移し、４℃で３０００ｒｐｍ、１５分
間遠心する。
(7) 上静を再使用のため元の三角フラスコに戻す。沈殿物は
80mlの氷冷ＴＢに懸濁し、さらに氷中で１０分間冷却する。
(8) ４℃で３０００ｒｐｍ、１５分間遠心する。
(9) 上澄みは捨て、沈殿物を２０mlの氷冷ＴＢに懸濁した後、１.
５mlのＤＭＳＯ（最終濃度７％）を添加し氷中で１０分間冷却する。
(10) ０．１～０.５mlずつ１.５mlチューブに分注し、直ちに液体窒
素に浸し凍結させる（コールドショックは必須）。
(11)そのまま液体窒素あるいはー８０℃冷凍庫で保存する。
３.形質転換操作
(1)冷凍庫から取り出したコンピテントセル手のひらの中で融解
後、氷中に置く。
(2)１０～５０μｌずつ１.５mlチューブに分注し、１～２０μｌのＤＮＡサ
ンプルを加え、氷中で３０分間冷却する。
(3) ４２℃のヒートブロック中で３０秒間保持し、氷中で２分間冷
却する。
(4) ４０～２００μｌ（4倍量）のＳＯＣ液体培地を加え、３７℃で１時
図４
間ほど振とう培養する。
(5) ＬＢ+アンピシリン寒天培地にストリーク、あるいは軟寒天培
地によって撒いたあと、３７℃で一晩培養する。
注意点
大腸菌コンピテントセルの調整と形質転換の手順（注意点）。
250mL/5Lあるいは
５０ｍL/１Lの割合は厳
守すること！
濁っていれば良いので
OD600を測定する必要
なし。
上済みを再度振とう培養し、数時間
たって濁った時点で同じ調整をすれば
同等なコンピテントセルが調整できる。
その上澄みを再度、調整することも可
能である。
液体窒素保存では１年以上は効率
は変化しないが、-80℃冷凍庫の
保存では１ケ月に１０分の１位に
効率が低下する。その場合には簡
単なので作り直しましょう。
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Ultra competent cell
２．コンピテントセルの調製法：
(1) 液体窒素（またはー８０℃ ）保存から取り出した大腸菌をＬ
Ｂ培地にストリークし、３７℃で１～２昼夜培養。
(2) １～３mm径のコロニーをまず、１mlのＳＯＢに懸濁し、一夜
(約12時間）培養する。
(3)この全量を２５０mlのＳＯＢ培地の入った５Ｌの三角フラスコに
移す（１Lのフラスコなら 50ml SOB）。
(4)回転型シェーカーで激しく(>200rpm)振とうし、１８℃（無理なら
室温でも良い）で１９～５０時間培養する。
(5) 培養液が濁ってきたら（ＯＤ600＝０.４～１.５のどこでも良
い）に達したら、培養を止め直ちに氷中にて、１０分間冷却する。
(6) 培養液を５００mlの遠沈管に移し、４℃で３０００ｒｐｍ、１５分
間遠心する。
(7) 上静を再使用のため元の三角フラスコに戻す。沈殿物は
80mlの氷冷ＴＢに懸濁し、さらに氷中で１０分間冷却する。
(8) ４℃で３０００ｒｐｍ、１５分間遠心する。
(9) 上澄みは捨て、沈殿物を２０mlの氷冷ＴＢに懸濁した後、１.
５mlのＤＭＳＯ（最終濃度７％）を添加し氷中で１０分間冷却する。
(10) ０．１～０.５mlずつ１.５mlチューブに分注し、直ちに液体窒
素に浸し凍結させる（コールドショックは必須）。
(11)そのまま液体窒素あるいはー８０℃冷凍庫で保存する。
３.形質転換操作
(1)冷凍庫から取り出したコンピテントセル手のひらの中で
融解後、氷中に置く。
(2)１０～５０μｌずつ１.５mlチューブに分注し、１～２０
μｌのＤＮＡサンプルを加え、氷中で３０分間冷却する。
(3) ４２℃のヒートブロック中で３０秒間保持し、氷中で
２分間冷却する。
(4)
４０～２００μｌ（4倍量）のＳＯＣ液体培地を加え、
３７℃で１時間ほど振とう培養する。
図４
(5) ＬＢ+アンピシリン寒天培地にストリーク、あるいは
軟寒天培地によって撒いたあと、３７℃で一晩培養する。
51
Protocol for preparation of E. coli competent
cell with extraordinarily high frequency
Ultra competent cell
Molecular Cloning: Page 1.112-115
１. prepare the following solutions
1) SOB
Final concentration
Bacto Tryptone
20g
2.0%
Bacto Yeast extract 5g
0.5%％
5M NaC1
2ml
10mM
2M KCl
1.25ml
2.5mM
Fill up to 1,000 ml by addition of pure water ~990ml. Mix it well by
stirring bar, then autoclave it. When this SOB is cooled down after
autoclaving, add 10ml of 2M Mg2＋solution (1M MgSO4・7H2O＋1M
MgCl2・6H2O), which was separately autoclaved.
2) SOC
Add 0.01 volume of autoclaved 2M glucose to SOB, and filtrate it
using a filter unit with 0.22mm pore size. Store it at 4oC.
3) Transformation Buffer <TB>
Final concentration
PlPES
3.0g 10mM
CaCl2・2H2O
2.2g 15mM
KCl
18.6g 250mM
Mix them in 950ml pure water, then adjust pH6.7~6.8 by addition of
5N KOH This solution is turbid white at low pH, then turns to
transparent as pH value increase. Then, add MnCl2・4H2O (10.9g) to
the final concentration of 55mM. Subsequently, fill up to 1,000ml by
pure water and filtrate it using a filter unit with 0.22mm pore size.
Store it at 4oC.
4) SOC: Add 0.001 volume of 2M glucose to SOB.
5) LB + ampicillin agar plate
6) Liquid nitrogen
2. Preparation of E. coli competent cell
(1) Streak E. coli stock (in liquid nitrogen or deep freezer at
-80℃) on LB-Amp plate and incubate it at 37℃ for 1-2 days.
(2) Pick up a single colony of 1~3mm diameter, inoculate into
1ml SOB, then shake at overnight.
(3) Transfer it to 5L flask containing 250ml SOB
(4)Incubate it by vigorous rotor shaking (>200rpm) at 18℃
(room temperature may be OK) for 2-3 days (19-50 h).
(5) When SOB becomes turbid, anywhere with OD600=0.4~1.5),
stop shaking and cool it in ice water for 10 min.
(6) Transfer SOB into a centrifuge tube (500ml) and spin at
3,000rpm (Beckman) at 4oC for 15 min.
(7) Transfer back the supernatant into the original 5L beaker and
start shaking incubation for the 2nd preparation, if necessary. To
the precipitate, add 80ml ice cold TB and keep it cool in ice water
for 10 min.
(8) Spin at 3,000rpm (Beckman) at 4oC for 15 min.
(9) Discard the supernatant. Add 20ml ice cold to the
precipitate and gently mix it. Then add 1.5ml DMS (final 7%)
and keep it cool in ice water for 10 min.
(9) Divide this into 1.5ml microfuge tube (0.1ml per tube).
Then perform quick chill process (essential process) by
immersing them into liquid nitrogen.
(10) Store these tubes in into liquid nitrogen or freezer at -80℃.
3. Transformation process
(1) Take frozen competent cells and warm them by hand until
they dissolve, then put them cool in ice cold water.
(2) Divide them into 10~50μｌ into microfuge tubes and keep them
cool in ice cold water for 30 min.
(3) Heat them at 42℃ for 30 sec, then cool in cool in ice cold
water for 2 min.
(4) Add 4 x volume (40~200μｌ) of SOC and incubate by
vigorous shaking at 37℃ for 60 min.
図４at 37℃
(5) Streak or pour onto LB-Amp plate and incubate
overnight.
Technical notes
Keep the volume ratio
SOB vs flask size (20 x)
250mL/5L or 50ml/1L.
No need to measure
OD600 strictly.
Just confirm that
SOB is turbid.
You can repeat the preparation of
competent cell by incubating the
supernatant again. This time, it will
take only several hours before SOB
become turbid.
The transformation frequency of competent
cells thus prepared does not change in liquid
nitrogen for more than a year. However, when
stored in deep freezer (-80℃), the frequency
decreases down to only 10％ of the fresh one.
Molecular Cloning: Page 1.112-115
Ultra competent cell
2. Preparation of E. coli competent cell
(1) Streak E. coli stock (in liquid nitrogen or deep freezer at
-80℃) on LB-Amp plate and incubate it at 37℃ for 1-2 days.
(2) Pick up a single colony of 1~3mm diameter, inoculate into
1ml SOB, then shake at overnight.
(3) Transfer it to 5L flask containing 250ml SOB
(4)Incubate it by vigorous rotor shaking (>200rpm) at 18℃
(room temperature may be OK) for 2-3 days (19-50 h).
(5) When SOB becomes turbid, anywhere with OD600=0.4~1.5),
stop shaking and cool it in ice water for 10 min.
(6) Transfer SOB into a centrifuge tube (500ml) and spin at
3,000rpm (Beckman) at 4oC for 15 min.
(7) Transfer back the supernatant into the original 5L beaker and
start shaking incubation for the 2nd preparation, if necessary. To
the precipitate, add 80ml ice cold TB and keep it cool in ice water
for 10 min.
(8) Spin at 3,000rpm (Beckman) at 4oC for 15 min.
(9) Discard the supernatant. Add 20ml ice cold to the
precipitate and gently mix it. Then add 1.5ml DMS (final 7%)
and keep it cool in ice water for 10 min.
(9) Divide this into 1.5ml microfuge tube (0.1ml per tube).
Then perform quick chill process (essential process) by
immersing them into liquid nitrogen.
(10) Store these tubes in into liquid nitrogen or freezer at -80℃.
3. Transformation process
(1) Take frozen competent cells and warm them by hand until
they dissolve, then put them cool in ice cold water.
(2) Divide them into 10~50μｌ into microfuge tubes and keep them
cool in ice cold water for 30 min.
(3) Heat them at 42℃ for 30 sec, then cool in cool in ice cold
water for 2 min.
(4) Add 4 x volume (40~200μｌ) of SOC and incubate by
vigorous shaking at 37℃ for 60 min.
(5) Streak or pour onto LB-Amp plate and incubate at 37℃
overnight.
野島博／著（価格：2,200円）・講談社・ 2014年10月
遺伝子検査でどんな病気がわかるの？どこに行けば検
査できるの？費用は？
53
野島博／著（価格：2,100円）・講談社・ 2009年7月
「がん細胞って何？どうして転移するの？どんな治療
法があるの？」遺伝子から読み解くがんの成り立ち。
.
Thank you
Thank you very much
for your attention !

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