(２) 腎臓がん細胞株における Galectin の発現および分泌機構の解析本年度研究では、腎臓がん早期発見のための血中診断マーカーとして期待される種類のタンパク質に着目し、腎臓がん細胞株を用いて評価を行うとともに、高発現していた Galectin-1 について、分泌機構を解析することとした。 1) 培養細胞における各タンパク質の発現量比較腎臓由来の非がん細胞である 293 細胞と 4 種類の腎臓がん細胞株を比較した場合、4 種類の腎臓がん細胞株の全ての株において、Galectin-1 と Triosephosphate isomerase が高発現していた。Galectin-3 は、3 種類の腎臓がん細胞株において発現量が高かった。 2) Galectin 分泌量の解析 Galectin の細胞外分泌量の比較するために、細胞培養上清中に分泌されている Galectin-1 量を測定した。その結果、腎細胞のがん化により Galectin-1 の細胞内発現量の増加と共に細胞外分泌量も増加していることが示された。 3) Galectin-1 の細胞内分布 Galectin-1 の分泌メカニズムを調べるうえで、細胞内における Galectin-1 の局在を確かめることは重要であり、腎臓がん細胞株 OS-RC-2、TUHR4TKB を用いて細胞内 Galectin-1 の局在を確認した。その結果、2 種類の細胞ともに細胞全体が染色され、腎臓がん細胞株において Galectin-1 は細胞内全体に存在することが確かめられた。 4) 糖鎖合成阻害による Galectin-1 の分泌量変化 (1)ガラクトース含有 N 型糖鎖合成阻害剤による細胞内糖鎖の変化 Galectin-1 の分泌はガラクトースとの結合が関与している可能性があり、Ｎ型糖鎖合成阻害剤 dMM を用いて、N 型糖鎖末端へのガラクトース付加を阻害した。 dMM を終濃度 1 mM となるよう培養上清中に添加し、DSA(ﾀﾞﾂﾗｽﾄﾗﾓﾆｳﾑｱｸﾞﾙﾁﾆﾝ)-FITC と Con A-Alexa 594 の蛍光染色により 2 種類の細胞(OS-RC-2、TUHR4TKB)の細胞表面および細胞内糖鎖の観察した結果、コントロールと比較して dMM を添加した細胞の DSA-FITC の蛍光が減少した。 (2)dMM 添加による細胞内 Galectin-1 発現量への影響 2 種類の細胞(OS-RC-2、TUHR4TKB)において dMM は Galectin-1 発現量に影響を及ぼさないことが明らかになった。 (3)N 型糖鎖合成阻害による Galectin-1 分泌量の変化 DSA はガラクトースが末端に存在する糖鎖を認識するため、Galectin-1 のターゲットが減少したと考えられる。そこで、dMM を終濃度 1 mM となるように培養上清中に添加し、24 時間当たりの Galectin-1 分泌量を 2 種類の細胞(OS-RC-2、TUHR4TKB)を用いて測定した。その結果、コントロールと比較して OS-RC-2 と TUHR4TKB のどちらの細胞の場合にも、Galectin-1 の分泌量の低下が見られた。DSA に認識される N 型糖鎖が減少したことにより、Galectin-1 の分泌量が減少した可能性が示唆された。 1