第1日 12 月 4 日（木） 産学連携セミナー 16:35-16:45 糖タンパク医薬品の創製に向けた糖鎖改変技術 糖鎖産業化に向けたこれまでの取り組み： GLIT、グライコバイオロジスク研究会 産業技術総合研究所、幹細胞工学研究センター 平 林 淳 バイオ医薬品については、そもそも先行品と 同一物を作るのは不可能であり、そのことが 後続品製造認可に際し大きな問題となる。一 方、糖鎖が重要な要因となって薬効が顕著に 上昇したり、血中安定性が向上したりするケ ースも報告され、バイオ医薬品における糖鎖 の問題はますます顕在化している。また、先 行品のスペック（糖鎖構造など）が必ずしも適 切であるとも限らない。 今後、GLIT の活動の一部はバイオ医薬品開 発の糖鎖課題を議論するグライコバイオロジク ス研究会に引き継がれていく。グライコバイ オロジクス研究会は糖タンパク質医薬品の製 造と分析・解析技術の革新を目指す任意組織と 2006 年 12 月に産総研・糖鎖医工学研究センター して、2010 年 12 月に設立された。グライコバイ （成松久センター長）が設立された際、糖鎖研究成 オロジクス研究会の主テーマである均一糖鎖構図 果の産業展開を図るべく 「糖鎖産業技術フォーラム をもつ糖タンパク質製造技術の開発イメージを以 （ GLIT ： Glyco-innovation and Industr ia l 下に示す。これまで会員相互の技術交流をベース Technology）」が関係業界団体、および代表的研 に年一回のペースで研究会を開催、最近 3 年はオ 究者らによって結成された。GLIT は、当時まだ ープン形式でのシンポジウムを企画開催してい 糖鎖解析のためツールや経験の乏しかった産業界 る。多くのアカデミア、産業界からの積極的な参 に対し各種イベントを連続的に企画・開催すること 画をお待ちしている。 で、相互の技術交流や研究成果の普及を通 し、実のある共同研究の発展を支援した（上 図参照） 。その結果、肝線維化マーカー診断 キットの製造承認や幹細胞表層糖鎖検出プ ローブの発見など顕著な成果が見られるこ とを迎え、2014 年 7 月、その役目を終えた と判断し、本年度で閉会することを決めた。 一方、糖鎖産業化を睨んだ新たな課題と して 2015 年頃に特許切れを迎える各種バイ オ医薬品（いわゆるバイオシミラー）問題が 浮上した。低分子医薬と比べ構造が複雑な Reference 1） バイオ医薬品開発における糖鎖技術（監修：早川堯夫、掛樋一晃、平林淳）シーエムシー出版、2011 年 1） 転換期を迎えたバイオ医薬品∼成否のカギはオープンイノベーションと糖鎖制御、平林淳、MEDCHEM NEWS, 23 (2), 2013 34 ◉ 第1日 12 月 4 日（木） 糖タンパク医薬品の創製に向けた糖鎖改変技術 産学連携セミナー 第 16:45-17:05 日 産学連携セミナー 1 微生物のエンドグリコシダーゼを用いた 糖鎖の付加と改変 石川県立大学生物資源工学研究所 山 本 憲 二 生体内のさまざまな生命現象において多彩な働 は酸塩基触媒残基のみを有し、基質の GlcNAc の きをする複合糖質の糖鎖は真核細胞の小胞体やゴ 2- アセトアミド基が求核残基として機能する。す ルジ体で生合成される。その生合成はＡＴＰなど なわち、通常のグリコシダーゼが糖−酵素反応中 の高エネルギー化合物の関与によって生合成され 間体を形成するのに対してオキサゾリン反応中間 た糖ヌクレオチドを基質として、糖転移酵素の働 体が形成される。そこで、オキサゾリン反応中間 きにより行われ、その反応には数十にもおよぶ酵 体の形成に関与すると考えられる Asn-175 を部 素反応が関わっている。 位特異的変異した N175A を作成して、オキサゾ 我 々は 土 壌 より 単 離 同 定 し た 糸 状 菌Mucor リン反応中間体を基質とした糖転移反応を行った hiemalis が生産し、糖タンパク質の N- グリコシド 結果、長時間反応を行っても糖転移生成物はほ 結合糖鎖を加水分解して遊離するエンド型グリコ とんど加水分解されずに増加し高収率で得られ シダーゼの endo- β -N -acetylglucosaminidase が た。すなわち、このような変異酵素が「グライコ 加水分解活性のみならず、糖転移活性も有するこ シンターゼ」様に機能することが明らかになった。 とを見出し、その糖転移活性を活用することによ さらに、Asn 残基を Gln 残基に置換した変異酵素 って、さまざまな化合物に糖鎖が付加できること N175Q は高マンノース型糖鎖およびシアロ複合 を明らかにした。すなわち、本酵素（Endo-M）は 型糖鎖のオキサゾリン化合物を基質とした糖転移 糖転移活性によって、水酸基を有する化合物に糖 反応によって生成物が高収率で得られることが明 鎖供与体から糖鎖を付加することができるユニー らかになった。これらの成果によって、Endo-M クな酵素である。我々は Endo-M のこの特徴的な による糖鎖化合物の大量調製が実用化レベルで行 活性を利用することにより、生理活性ペプチドに えることが現実的になった。 糖鎖を付加した糖ペプチドやインフルエンザ ウイルス感染阻害剤などの化学 - 酵素合成 （chemo-enzymatic synthesis）に 成 功 し、 さまざまな機能性糖鎖化合物を合成した。 通 常、 グリコシダ ー ゼ の 糖 転 移 反 応 は 拮抗する加水分解反応が優先して起こる ため、生成物の量は非常に少なく、さら に、一度生成した糖転移生成物もグリコシ ダーゼの基質となるため、再び加水分解さ れ、糖転移生成物の収率はさらに減少す る。すなわち、グリコシダーゼの糖転移活 性によって糖転移生成物を高収率で得るた めには糖転移反応を促進して糖転移生成物 の加水分解反応を抑制することが重要であ る。 我 々 は Endo-M が substrate- assisted catalysis という機構によって働く酵素であ ることを見出しているが、このような酵素 図 Endo-Mの反応機構と変異酵素の糖転移反応 ◉ 35 第1日 12 月 4 日（木） 産学連携セミナー 17:05-17:25 糖タンパク医薬品の創製に向けた糖鎖改変技術 Endo-M を用いる糖鎖付与技術の工学的展開 東海大学工学部応用化学科、東海大学糖鎖科学研究所 稲 津 敏 行 36 ◉ 1990 年代に開発された Endo-M を用いる糖鎖転 ュガーリングタグと名付けた糖鎖修飾技術を報告 移反応は、N- グリカンを有する様々な糖鎖複合体 した。さらに、小分子の糖構造を持たない糖鎖修 を調製できる唯一の方法といっても過言ではな 飾剤ライブラリーの構築を進めている。また、最 い。その後の技術革新、特に、改変型酵素の誕生 近では天然型、並びに、改変型 Endo-M の固定化 と糖鎖供与体としてオキサゾリン誘導体を用いる を試み、マイクロリアクターを目指した研究を開始 化学の発展により、今や定量的に糖鎖複合体を得 した。マイクロフローシステムを含め、その連続合 ることは、難しいことではなくなっている。しか 成システムの確立を急いでいる。SGP から糖ペプ し、これまでの技術は研究室レベルであることも チドを得るまで工程を例に、バイオリアクターのコ 否めない。酵素が市販されるようになった今、そ ンセプトを図に示した。 の工業的な利用を考える時期が来たといえよう。 本講演では、こうした工学的な展開を指向し行っ 我々は、糖鎖受容体の必須構造を明らかにし、シ ている研究の一端を紹介する。 第1日 12 月 4 日（木） 糖タンパク医薬品の創製に向けた糖鎖改変技術 産学連携セミナー 第 17:25-17:45 日 産学連携セミナー 1 人工機能性糖鎖とエンドグリコシダーゼを利用する ネオグライコバイオロジクスの創製 徳島大学大学院ヘルスバイオサイエンス研究部・創薬生命工学分野 伊 藤 孝 司 近年、抗体医薬をはじめ、組換え糖タンパク質 サイトーシスによる細胞内取り込み、およびリソ を用いるバイオ医薬品の発展は目覚しく、その ソームへの輸送原理に基づいている。しかし、一 重要性が増大している。しかし哺乳類培養細胞 般に哺乳類細胞株による組換えヒトリソソーム酵 株による組換え糖タンパク質の大量生産は、抗体 素の生産性は低く、また上記のリソソーム酵素へ 分子のような一部のタンパク質を除き、一般的に の付加糖鎖における末端 M6P や Man 残基の含有 は困難で、製剤としても高コスト化する。また 量によりその有効性が左右される。 組換えタンパク質に付加される糖鎖の不均一性に 本講演では、開発途上ではあるが、この日本発 基く有効性低下、免疫原性や副作用等が臨床上 の糖鎖工学技術を用い、異種生物（カイコ等）で大 問題となる。一方、近年、山本らが発見した糸 量発現・精製した組換えヒトリソソーム酵素の付 状 菌 Mucor hiemalis 由 来 エンドグリコシダ ー ゼ 加糖鎖を均一な N 型糖鎖に置換したネオグライコ （endoM）のトランスグリコシレーション作用と、 酵素の創製と、糖鎖機能を利用する当該リソソー 正田らが調製法を確立した N 型糖鎖オキサゾリン ム酵素欠損症（リソソーム病）の酵素補充療法への 誘導体を利用する糖鎖挿げ替え法により、均一な 応用をふまえた、人工糖タンパク製剤（ネオグラ N 型糖鎖と生理活性をもつ人工糖ペプチドまたは イコバイオロジクス）の開発アプローチと有効性評 糖タンパク質の創製と医薬品開発への応用が可能 価系について紹介する。 になりつつある。 リソソ ー ム 病 は、 リソソ ー ム 酵 素の遺伝的欠損により、基質の過 剰蓄積と多様な臨床症状を伴う一 群の先天性代謝異常症（40 種程度 存在）である。近年、哺乳類培養細 胞株で生産した組換えヒトリソソ ーム酵素製剤を患者に投与する酵 素補充療法（Enzyme replacement therapy: ERT）が 6 種 の 疾 患 に 対 し臨床応用されている。この ERT は、リソソーム酵素に付加される 非 還 元 末 端 マンノ ー ス -6- リン 酸 （M6P）やマンノース（Man）含有高 マンノース N 型糖鎖と、これらに対 する標的細胞表面の糖鎖レセプター （M6PR や ManR）との結合、エンド ◉ 37
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