納豆菌(Bacillus subtilis var. natto)によるイチゴの灰色か び病に対する抑制効果 誌名 日本植物病理學會報 = Annals of the Phytopathological Society of Japan ISSN 00319473 著者 橋本, 俊祐 河村, 郁恵 中島, 雅己 阿久津, 克己 巻/号 78巻2号 掲載ページ p. 104-107 発行年月 2012年5月 農林水産省 農林水産技術会議事務局筑波事務所 Tsukuba Office, Agriculture, Forestry and Fisheries Research Council Secretariat 日植病報 7 8:1 04-1 0 7( 2 0 1 2 ) ] p n .J .P h y t o p a t h o . l7 8 :1 04-1 0 7( 2 0 1 2 ) 短 報 納豆菌 ( B α c i l l u ss u b t i l i sv a r .仰 t t o ) によるイチゴの灰色かび病に対する抑制効果 橋本 俊祐 1 ・河村 郁 恵 1・中島 雅己 l持・・阿久津克己 1 ABSTRACT ，S人KAWAMURA ，I 人NAKAJIMA，M.1*andAKUTSU，K .1( 2 0 1 2 ) .S u p p r e s s i v ee f f e c t so fsomei s o l a t e so fB a c i l l u s HASHIMOTO 抑 制l i sv a r .n a t めa g a i n s tg r a ymoldo fs t r a w b e r r y .] p n . ] .P h y t o p a t h o. l7 8 :1 04-1 0 7 . a c i l l ωs u b t i l i sv a r . ηa t t o， ab e n e f i c i a lf o o dm i c r o b e， wast e s t e da sac o n t r o lf o rg r a ymoldo fs t r a w b e r r y .Whenf i v e Thee f f i c a c yo fB i s o l a t e so fB a c i l l u ss u b t i l i sv a r .刀α t t owerec u l t u r e dw i t ht h eg r a ymoldf u n g u so np o t a t os u c r o s ea g a rp l a t e s， a l li s o l a t e si n h i b i t e d f u n g a lg r o w t h .I s o l a t eN o .2，whichwast h emosti n h i b i t o r yo ft h ef u n g u si nv i t r o，reducedd i s e a s ep r o g r e s si nb o t hd e t a c h e dl e a v e s a n df l o w e r s .Theser e s u l t ss u g g e s tt h a ti s o l a t eN o .2o fB .s u b t i l i sv a r .n a t t oh a sp o t e n t i a la sb i o l o g i c a lc o n t r o la g e n to fg r a ymoldo f s t r a w b e r r yp l a n t s . ( R e c e i v e dSeptember28， 2 0 1 1 ;A c c e p t e dNovember1 ， 2 0 1 1 ) B a c i l l u ss u b t i l i sva. rn a t t o，g r a ymold，s t r a w b e r r y Keywords:b i o l o g i c a lc o n t r o l， バイオコントロール技術の導入により，化学農薬の使用を 以上のことから ，B .s u b t i l i sに属する納豆蕗には植物病容 削減することができ，薬剤耐性菌の発生抑制などが期待され の防除に利用できる可能性があり，かつ食品由来の微生物で る.しかしバイオコントロール資材が利用されるかどうか あることから安全で消費者に受け入れられやすい妨除が可 r 化学殺菌剤に替わる安全な方 能になると考えられた.これまでに筆者らは納立菌がカンキ 法である j と 消 費 者 に 受 け 入 れ ら れ る か に も 影 響 さ れ る ツ緑かび病，イチゴ炭痘病，キュウリ褐斑病に対し抑制効果 は，その防除効果のみならず， ( C h a l u t za n dDrob ，y 1998). 細菌，酵母，糸状菌を含む食品微 を示すことを報告しているが(橋本ら， 2 0 1 0 a・2 0 1 0 b )，こ 生物と呼ばれる徴生物は，歴史的にパン，リンゴ酒，ビール， れらの他に納豆菌による植物病害の防除に関する研究報告 ワインなどの特殊な食品や飲物を製造する場合， または天然 はない.本研究では，市販の納豆から分離された納立直株を 防腐剤として発酵果物・野菜・肉・日用品に利用されており， バイオコントロール・エージェントの候補として用い このような有益な微生物は通常安全であるとみられ，消費者 ゴの灰色かび病に対する抑制効果を調査した. に長く受け入れられてきた. これまでに食品微生物を用いた バイオコントロールとしては チーズ製造に用いる培養ス ターターから分離された B a c i l l u s仰 z y l o l i q u 抑c i e n sC06がモモ 供試菌株 イチ 本試験では， 5種の市販納豆からそれぞれ単一 コロニーを分離・培養後，細爵河定検査用キット API50CH (ピオメリュ一社製)および納車製造試験(木内ら， 1 9 8 7 )に のポストハーベスト濡筈である灰星病を効果的に抑制したこ よって同定された納立菌 ( B .s u b t i l i sv a r .仰 t t o )5株 (No.1~ とが報告されている ( Z h o ue ta ， . l2 0 0 8 ).日本の代表的な食品 5 ) をバイオコントロール・エージェントの候補として用い l l u ss u b t i l i sv a r .n a t t o ) を挙げるこ 微生物の 1つ に 納 豆 菌 恒 例i 0 1 0 b ) . 納豆分離株 No.1~ 5の滅菌水怒潟液 た(橋本ら， 2 とができる.納豆菌は日本人が普段から口にしている身近な をT r y p t i c a s es o y寒天 (TSA) 平板培地 (DIFCO社製)に塗 細菌であることから，大きな抵抗感を感じることのない微生 布し， 2 80Cの恒温器で培養後， 40Cの冷蔵庫で培養した. 物である.さらに納車菌が属している B .s u b t i l i sには，トマト 試験の際には， TSA平板培地を用いて 2 80Cで 24時間前培 やイチゴの灰色かび病やうどんこ病などの横物病害の生物的 養した納立分離株を T r y p t i c a s es o y液体 (TSB)培地 (DIFCO 防除手段として生物農薬に用いられている種類も含まれてい 社製)に怒濁し， 2 80C，1 0 0rpmで 24時間接とう培養を行っ る (ボトキラー水和剤，インプレッション水和剤) た.振とう培養後，遠心分離 ( 3 0 0 0g，1 0分間， 240C ) によ 3 0 00 3 9 3茨城県稲敷郡阿見町 3 2 1 -1 ) I b a r a k iU n i v e r s i t yC o l l e g eo fA g r i c u l t u r e， 3 2 1 1Ami， I n a s h i k i， l b a r a k i3 0 0 0 3 9 3， ] a p a n *Correspondingauthor(Em a i l :mnakaji@mx i . b a r a k i . a c . j p ) 1茨城大学農学部(干 句 骨 ] p n . ] . り培地成分を除き，滅菌水に懸濁し，分光光度計を用いて懸 1 6 . 0 潟液を ODω0=1 .0に調整した. 1 4 . 0 対崎培養試験灰色かび病菌 ( B o t r y t i sc i n e r e a ) は薬剤感 1 2 . 0 受性の異なる TR3491 (ベノミル感受性，イプロジオン感受 E100 繍 u R 1 (ベノミル耐性，イプロジオン感受性)， TV335 性)， I (ベノミル耐性，イプロジオン耐性)の 3菌株を供試した. 1 .0 X 105個 I m lに調整した B .c i n e r e aの分生子懸濁液 100μi をP o t a t os u c r o s e寒 天 (PSA) 平板培地(ジャカ、、イモ 200g， スクロース 20g， 寒 天 15g， イ オ ン 交 換 水 1000mI)に広 げ ， 培 地 上 の 3ヵ 所 に 滅 菌 ペ ー パ ー デ ィ ス ク ( 径 5mm， ADVANTEC) を置床し，そこへ納豆蕗懸濁液 5μlを稿下し た.対照、区では滅菌水を滴下したペーパーディスクを置床し た.これを 25Cで 2日間培養し，阻止帯長(納豆菌コロニー 0 先端から阻止帯先端までの長さ)を測定した.その結果，供 1 0 5 2 0 1 2 ・ ロTR349-1 I u R 1 [ Jτ V335 車 8.0 言 6.0 4 . 0 2 . 0 0 . 0 No1 町 NO.2 NO.3 No. 4 No.5 納主主菌株 第 1図 PSA 培地における対的培養 2 B後の納豆菌 ( B a c i l l u s a r .n a t t o )5株 ( N o .1~ N o .5 ) による灰色かび s u b t i l i sv B o t r y t i sc i n e r e a ) の生脊盟寄. 病菌 ( 試したすべての納宣菌処理区において明瞭な阻止帯が認め られ， No.2株は最も大きな閉止帯を形成した(第 1関，第 2関 A ) . また，阻止帯付近の B .c i n e r e aの萄糸体を光学顕微 鏡 (OLYMPASBH2 ) を用いて観察したところ，すべての納 糾 豆菌処理区で菌糸先端部の膨張や菌糸内容物の鵡出が認め られ(第 2国 B) ，菌糸細胞壁に対する合成阻害か，あるい は分解作用が関与している可能性が考えられた これまでに .抑 制l i sは環状ペプチド抗生物質Itu r i n， A 納豆菌の属する B S u r f a c t i nなどの抗菌物質を産生することが明らかにされて いる ( G u e l d n e re ta ， . l1 9 8 8 ;日i r a o k ae ta ， . l1 9 9 2 ) 抗真菌リボ u r ・ inAは，酵母菌 ( S a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) の細 ペプチドIt 胸 膜 を 損 傷 す る こ と (Thimone ta ， . l1 9 9 5 ;Maget-Danaand Peypoux，1 9 9 4 ;Maget 心a n aandP t a k，1 9 9 0 )，またアカパンカ 持培養 2 日後の納豆菌 ( B a c i l l u s 第 2図 PSA 培地における対 l a r .n a t t o )No .2株による灰色かび病議 ( B o t r y t i s s u b t i l i sv c i n e r e a )菌糸体の生脊限寄 A:灰色かび病菌の生育阻 :生脊阻止帯付近の灰色かび病菌糸体の光学顕 止帯， B 微鏡写真 (x2 0 0倍)，黒矢印:菌糸先端総胞の膨張，自 矢印:菌糸先端紹胞の内容物漏出 N e u r o s t o r ac r a s s a ) の菌糸細胞壁の合成を組害すること ビ ( 0 0 9 ) が報告されている.これらのことから，納 (村山ら， 2 納豆菌懸濁液の代わりに滅菌水を用いた区を設定した.納豆 .c i n e r e aに 対 す る 菌 糸 伸 長 抑 制 効 果 に 立分離株が示した B 菌 処 理 24時間後に PSA培 地 で 6 日間培養した B .c i n e r e a菌 r i nA による菌糸体の細胞膜損傷及び細胞壁合成阻害 は ， I tu 糸体プラグ(径 5mm) を葉上に接種し，水を張ったプラス が関与している可能性が考えられた.今後，納豆分離株の チックトレーに置床して前述と問様に人工気象器内に維持 I t u r ・i nA産生・分泌について謂査を進める予定である した.接種 4日後に病斑径を測定し，納豆蔵による灰色かび 納豆菌のイチゴ植物体上における灰色かび病!こ対する抑 病に対する抑制効果を調査した.試験は各処理区あたり 1複 制効果納豆菌によるイチゴ植物体上における灰生かび病 ( 3小葉)を用いて， 5反復で行った.その結果，納豆分 に対する抑制効果について，前述の灰色かび病菌 3菌株を供 離 株 の う ち No.2株処埋援における抑制効果が最も高く， 試し，培土(スーパーミックス A) でポット(径 9cm) 栽培 TR349-1を接種した場合の病斑長が対照区で 9 . 8土 0.5mmに した 2~3 週齢のイチゴ植物(品種:さちのか)の 2 番目に . 3土 0.3mmであった(第 3図 ， 対して No.2株処理区では 5 新しい複葉を用いて調査した.滅菌水を注いだコニカノレビー u R lおよび TV335を用いた接種試験においても 第 4図). I 1 0 0mI)の口をパラフィルムで覆い，中央に霞径 1mm カー ( 同様の傾向が認められ， NO.2株によるイチゴ葉上での灰血 程度の穴を開けた後にイチゴ複葉の葉柄を挿し，実験に供試 かび病に対する抑制効果が確認された. 脚立1.0 ) をイチゴ複葉に 5ml噴 した.納豆菌懸濁液 (OD 次に，イチゴ植物の花器における No.2株の灰色かび病に 2 霧処理した後，これらをどニール袋で覆い， 250C，明期 1 対する抑制効果を調査した. No.2株の懸潟液を開花 1日後 時間/暗期 1 2時間の人工気象器内で維持した.対照として， のイチゴ花器に 3ml噴霧し風乾させた後， ピニーノレ袋で、種 1 0 6 日本植物病理学会報第 7 8巻 第 2号 平 成 2 4年 5月 第 5凶 イチゴ楽における納豆菌 ( B a c i l l u ss u b t i l i sv a r . η αt t o )N o . 2株の!噴霧処理による灰色かび病に対する抑制効果 A: 第 3関 イチゴ花器における納豆菌 ( B a c i l l l 俗 s u b t i l i 句v a r .n a t t o ) N o . 2株の噴霧処理による灰色かび病に対する抑制裁j巣. A:No.2株噴霧処理区， B:対照区 No.2株噴霧処理 I R . B:対照区. した.花器での発病程度は，指数 0:未発病， 1 :花器の 25 1 4 . 0 %以下の菌叢， 2:花器の 50%程度の菌叢， 3:花器全体に菌 1 2 . 0 叢 ， 4:花器の腐敗の基準で評価した. 1 0 . 0 擢病花器における分生子形成に対する抑制効果について は，花器 l i 悶当たりの分生子形成数を下記の方法で算出して t 脳 銀 察 同 6 . 0 評価した.各処理区の花器を水 2m!中でボルテックスミキ 4 . 0 サーを用いて 1分間懸濁し，懸i 勾液中に含まれる分生子数を 2 . 0 血球計算盤を用いて測定した.試験は各処理区当たり開花し た 1花器を持つ 3株の苗を用い， 3反復で行った.試験の結 0 . 0 N O . 1 N o . 2 4 No. N O . 3 N O . 5 対照区 果，対照区における供試花はすべてが発痛し，接種後 4 8と 納豆菌株処理区 第 4図 納 豆 菌 ( B a c i l l u ss u b t i l i sv a r .n a t t o )51 朱( N o .1~ N o .5 ) をi 噴霧処理したイチゴ葉における灰色かび病の病斑進 展.闘中のパーは標準誤差を示す 6日で発病指数 3以上を示した花数は 9花中それぞれ 7花と 8花であった.一方， No.2株処理区では 1花のみであり，対 照、区に比べて発病程度は有意 ( P<0 . 0 5 ) に低かった(第 5 I } ' S I ， 第 1表).また，接種 6日後に花器に形成された B .c i n e r e a い ， 2 5C，明期 1 2時間/暗期 1 2時間の人工気象器内で維持 4 分生子数を測定したところ，対照区では 4 4 . 0X 1 0 個/花器 した.対照として，納豆菌懸潟液の代わりに滅龍水を噴霧し であったが，NO.2株処理区では 1 0 . 3X 1 04倍/花器であり， た処理肢を設けた.処理 2 4時間後に B .c i n e r e aTR3491の分 対照区に比べて有意 ( P<0 . 0 5 ) に低い値を示した.イチゴ 0i 閲1 m ! ) を 2m!噴霧接種した後，前述 生子懸渇液(1.0X 1 植物において灰色かび病躍の主要な感染部伎であり，発病後 と同様に人工気象器内で維持した.接種 4 8後 ， 6日後に発 に第二次感染源となる分生子が大量に形成される花器で¥ 病程度，また 6日後に花器 1鵠当たりの分生子形成数を測定 No.2株による顕著な抑制効果が認められた.以上の結果か 0 時 6 B a c i l l u ss u b t i l i sv a r .n a t t o ) No .2株の噴霧処理によるイチゴ花器における灰色かび病抑制効果 第 1表 納豆菌 ( 接種後日数 4B 発病指数 a) 加花数 試験 I R 供試花数 No.2処理区 対照区 O 1 2 9 7 1 9 O l 3 4 O 1 O O 1 6 1 3 * 有意:位 c) 6臼 発病指数 代表値 b) No.2処理区 9 3 5 O O 1 1 対照区 9 O O 1 1 7 4 有意性 持 a ) 発病指数はそれぞれ 0 :未発病， 1 :花器の 25%以下の菌叢， 2 :花器の 50%程度の菌叢， 3 :花器全体に一蔚議， 4 :花器の腐敗 b ) 中央値を玉沢す c )M a n n W h i t n e yの U検 定 に よ り * は 5%水準で、有意差あり 1 0 7 2 0 1 2 おいて灰色かび病の発生を抑制する効果を有すことが示さ 6 1 0 N ￡ ぷ ε L コ ι れ，有用なバイオコントロール・エージェントに成り得る可 1 05 能性が示唆された.また，本研究ではバイオコントロール・ 1 04 。 10 エージェントの候補として納豆菌 5株のみを用いたが，さら 3 口 ま 話 円 に多種類の納豆菌株を用いることにより，より抑制効果の高 1 02 い株が選抜される可能性も考えられる. 1 01 引用文献 O O 4 1 2 8 N O . 2 株噴霧処理後 8数 第 6図 肋) イチゴ葉上に噴霧した納豆萄 C n a u b t i l i sv紅 : B a c i l l u ss No.2株の生息密度推移. 朱はイチゴ植物の花器において灰色かび病の発病 ら ， No.21 1 9 9 8 ) .B .( i o l o g i c a lc fp o s t h a r v e s t C h a l u t z， E .a n dDrob o n t r o lo ， yS l a n t M i c r o b eI i o l o g i c a lC o n t r o d i s e a s e . l nP . l n t e r a c t i o n sa n dB u y k e n d a l l，L p .1 5 0 1 7 0，M a r c e l .D ( B o l a n d，G .， .，e d sふ p . JK NewY o r k . Dekker ， 2 0 0 6 ) .B t t a c h m e n t， u b t i l i sa .( Demoz，T .B .a n dK o r s t e n，L a c i l l u ss n di t smodeo c o l o n i z a t i o n，a n ds u r v i v a lo na v o c a d of l o w e r sa f 8 7 4 . n dr o tp a t h o g e n .B i o l .C o n t r o l 3 7 :6 a c t i o nonsteme e i l l y r r e n f a l e， . L . ， C . C .，Pusey o s t e l l o，C， E . ，A G u e l d n e r .C .，R ，C ，P ，R EG.a n dC u l t e r .，Himmelshbach，D . S .，Crumley Rぷ ， Cox R .X ， ， ， 1 9 8 8 ) .I n t i f u n g a l s o l a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fi t u r i n sa sa H . G .( a c i l l u s i o l o g i c a lc i t hB p e p t i d e si o n t r o lo fp e r c hbrownr o tw nb A g r i c . F o o d C h e m 3 6 : 3 6 6 3 7 0 . s u b t i l i s .. J 2 0 1 0 a ).納豆菌 ( B a c i l l u s 橋本俊祐・中島雅己・阿久津克己 ( s u b t i l i s ) によるイチゴ炭療病とキュウリ褐斑病に対する抑 総病報 7 6 :2 1 8 . (談要) 制効果. 日i 2 0 1 0 b ).納豆 橋本俊祐・立吉野芳太郎・中島雅己・阿久津克己 ( u b t i l i s ) を用いた植物病容のバイオコントロー B a c i l l u ss 菌 ( ルについて. El植病報 7 6 :4 0 . (議要) n i n go 1 9 9 2 ) .M .a 10 fa H i r a o k aH .，AnoT n dS h o d aM.( o l e c u l a rc i o s y n t h e s i so i p o p e p t i d ea n t i b i gener e s p o n s i b l ef o rt h rb ft h el B i o e n g 7 5 ( 5 ) : 3 2 3 3 2 6 . F e r m . o t i c si n ds u r f a c t i n .. t u r i na J 1 9 8 7 ). 木内 幹・悶谷直俊・ジョコ スヲスチョ・舟根和美 ( 市販納豆麹の分離と伺定.食総研報 5 0 :1 8 21 . 1 9 9 4 ) .I 1a s so f p e c i a lc Maget 心a t u r i n s，as n a，R .andPeypoux，E( h y s i c o c h e m i c a l i p o p e p t i d e s :b p o r e f o r m i n gl i o l o g i c a l 昌nd p o x i c o l o g y8 p r o p e r t i e s .T 7 :1 5 1 1 7 4 . 1 9 9 0 ) .I i p o p e p t i d e s :i n t e r a c Maget 心a n dP t a k，M.( tu r i nl n a，R .a n d y c o s u b t i l i nw i t hl i p i d si np l a n a rmembranesa t i o n so fm 4 4 0 . o n o l a y e r s .B i o c h i m .B i o p h y s .A c t a .1 0 2 3 :3 mixedm 2 0 0 9 ) 抗真菌ワポペプチドを 村山肇子・工藤俊輔・近藤久王室 ( 7 :4 1 4 7 . 分泌する新規土壌細菌.関東学院大学工総研報 3 阪口義広・百町満朗・杖 8 2 0 0 3 ) .B a c i l l u ss u b t i l i s 3浩二・ J I I根 太 ( I K 1 0 8 0 のマルハナパチへの付表方法とトマト灰色かび病 の防除効果 日植病報 6 9 :9 4-1 01 . 1 9 9 5 ) .E e y p o u x，E， W a l l a c h， i c h e l，G f f e c to f . ，P Thimon，L n dM .( ] .a o r p h o l o g ya n dmemt u r i nA，onm i p o p e p t i d ea n t i b i o t i c，i t h el l t r a s t r u c t u r eo e a s tc i c r o b i ol .L e t t . b r a n eu fy e l l s . FEMSM 0 6 . 1 2 8 8 :1 0 11 2 0 0 8 ) . Developmento f .E .，S c h n e i d e r ，K .a n dL i，X . Z .( Zhou，T o n t r o l l i n g g e n t sf r o mf o rc b i o c o n t r o la o o dm i c r o b i a li s o l a t e sf r u c t i c o l a . e a c hbrownr yM o n i l i n i af p o s t h a r v e s tp o tc a u s e db I n t . ] .F i c r o b i ol .1 2 6 :1 8 0 1 8 5 . o o dM 句 および第ニ次感染源となる分生子の形成を抑制する効果を 有すことが示された 朱のイチゴ葉上における生息密度 No.2*: No.2株のイチゴ おける定着性を調査した. No.2株 の 懸 潟 液 (OD6∞= 1. 0) を，栽培 2~3 週間後のイチゴ箇の葉面上に 5m! 噴霧 50C，明期 1 2時間/時期 1 2時間の人工 し，風乾させた後， 2 2日に葉を直径 1cm 気象器内で維持した.処理後 0，4，8，1 のりーフパンチャーで打ち抜き リーフディスクを滅蕗水 1m!中で 1分間撹狩した.懸濁液を希釈した後， 100μiの各 希釈液を TSA培 地 に 広 げ 370Cで 1 5時開培養した.培地上 ;こ形成されたコロニー数から葉における No.2株の生息密度 を算出した.試験は 3株の商を用い，各調査段において各商品 の葉から 3枚のリーフディスクを打ち抜いて調査した.なお， 未接種のイチゴ苗葉面上における B .抑 制l i sの菌筏度は検出 2 0c 2未満)であった.試験の結果，処理 O 限界以下 ( f cm u / 日後から 1 . 8X 1 2臼後にかけて No.2株の生息密度は 3 04c f u ! 2から 1 2を推移し，イチゴ葉上で安定的に cm 05c f cm .4X 1 u / 維持されていることが明らかとなった(第 6図).また，試 2日開でイチゴ葉における No.2株処濯による 験を遂行する 1 影響は観察されなかった.本試験では，花器における No.2 株の定着伎の評価は行わなかったが，これまでにマルハナパ 芯1 チにより運搬された B .抑 制 的 I 080が訪花 21B後まで増 殖することが報告されており(田口ら， 2 0 0 3 )，また， Demoz 2 0 0 6 ) はアボカド花上で β.s u b t i l i sがアボカド andK o r s t e n( の花の雌ずい表面に定着できることを報告していることか ら，本試験においても花器において NO.2株が定着している 可能性が高く，抑制要因の 1つとなっていると考えられる 以上の結果から， No.2株はイチゴ植物の葉および花器に 日
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