Ins i t uハイブリダイゼーションのプロトコル •1 日目（所要時間： 2 時間～一晩） 1 . 作業を始める前に、 h y b r i d i z a t i o nb u f f e rを乾燥機を用いて 58°Cに加温して おく 。 1XPESTの入った洗びんにスライドガラスを入れ、 10分放置する 。 洗びん スライドガラス Point! 洗びんは事前に 10個オートクレーブにかけ ておく 。 1XPBST スライドガラス立て 2 .10分後、スライドガラスを取り出し、周囲の水分を取った後、パップペンで 縁取りをする 。少し放置してベンが乾いたら、 PEST中に戻す。 3 . 全てのスライドガラスの縁取りができたらスライドガラスを取り出 l、水分 を切った後、 ProK( 5μg/mLPEST)400μLをサンプル上に滴下する。その後、 5分放置する 。 4 .5分後、水分を切り、 グリシン （ 2mg/mLPEST ） を 400μL滴下し、 10分放 置する 。 5 .10分後、グリシンを除き、 4%PFAを 400μL滴下し、 10分放置する 。 6 . 10分後、 PESTの入った洗びんにスライドガラスを入れ、 5分放置する 。 こ れを 亘旦繰り返す。 7 .hy b r id i z a t i o n用の容器を用意する 。 h y b r i d i z a t i o n用の容器 ぺ−／ f ータオル 書j l り箸 8.PBSTでの 3回の洗浄後、サンプルに 58 ° Cに加温した h y b r i d i z a t i o nb u f f e r を 400μL滴下し、乾燥を防ぐためにパラフィノレムを被せた後に 7 .で用意した 容器に入れ蓋を閉め、ラップで包む。 これを 58° Cで 1時間放置する 。 P o i n t ! Hy b r i d i z a t i o n用の容器には一度にカバーガ ラスが 4枚までしか入らないので注意。 スライドガラス ｛パラフィルムを被せである） 9.この問、 l.5mLチューブに h y b r i d i z a t i o nb u f f e r400μLに対し 、RNAプロ ーブを 4μL加え、ヒ ー トブロックで 80° Cで 1 0分加熱した後、氷中で急冷さ せる 。 1 0 .8 .の操作の 1時間後、 h y b r i d i z a t i o nb u f f e rを捨て、 9 .で用意した RNAプロ .と同様にパラフィルムを被せて容器に入れ、蓋を 一ブ溶液 400μL滴下し、 8 閉めてラップで包んだ後、 58° C、 でオーバナイト 。 1 1.翌日の操作に際して、洗びんに 50%ホルムアミド／ 2X SSCTを入れたもの を 2つ用意し、パラフィルムで密閉した後、 58 ° C で加湿する（ 1 0 .と一緒にお オーバナイトで加温してもよし、）。 同様に、洗びんに 2XSSCT、0.2XSSCTを 180mLずつ入れたものをそれ ぞれ 2つずつ用意し、パラフィルムで、密閉した後、 58°Cで加温する（ 1 0 .と一 緒にオーバナイトで加温してもよしす。 •2 日目（所要時間： 2 時間 35 分～ 一 晩） 1 .5 0%ホルムアミド／ 2X SSCTの入った洗びんにスライドガラスを入れ、 58° C で 20分放置する 。 2.20分後、もう一つの 50%ホルムアミド1 2XSSCTの入った洗びんにスライド ガラスを移し、 58° Cで 15分放置する。 3 .1 5分後、2XSSCTの入った洗びんに移し、 58° Cで 1 5分放置する 。 この操 作をもう 1旦 繰り返す。 4 .2XSSCTでの 2回の洗浄後、 0 . 2XSSCTの入った洗びんにスライドガラス を移し、 58° Cで 15分放置する。 この操作をもう 王旦繰り返す。 5 .0 . 2X SSCTの 2回の洗浄後、 2%b l o c k i n gs o l u t i o nを 400μL滴下し、スラ イドガラスを容器に入れて 1時開放置する 。 P o i n t ! 2%b l o c k i n gs o l u t i o nは b l o c k i n gr e a g e n tを PBSTに溶かして作製する。その際に加温す ること 。 6 . この問、 a n t i ・D I G ・APを b l o c k i n gs o l u t i o nにより 2 ! i l l 旦盤希釈する 。 7 . 5. の操作の 1 時間後、 b l o c k i ngs o l u t i o n を捨て、 a n t i・DIG-AP/blocking s o l u t i o nを 400μL滴下し、容器に入れラップで包み 4° Cで、 オーバーナイト 。 . 3日目（所要時間： 3時 間 ∼ 一晩 ） 1 . スライドガラスに PBSTを 600μLほど滴下し、 1 5分室温で放置する。これ を 4回繰り返す。 この間に SBTを調製する。 P o i n t ! SB( 258室にある）4mLに対し、 t we en20を 4μL 。 2. 4回の洗浄後、 SBTを 400μL滴下し、 5分間放置する。この操作を 返す。 w繰り 3 .BMPm 下l eAPSubs t r a t e ,pr e c i p i t a t i ng（染色溶液） 400μL滴下し、発色する まで（3時間程度） 容器に入れて放置する。発色しなければオーバーナイト。発 色した場合は、引き続き 4日目の工程へ進む。 P o i n t ! RNAプロープの長さにもよるが、だいたい 3 ∼5時間程で染まる。 4.オーバーナイトする場合はさらに染色溶液を 400μL加え、容器をラ ップで 包んだ後、 4° Cで保存する。 ー ー ー ーー ー 』 『 』 一 一 . 4日目（所要時間：30分 ） 1 . 染色後（組織は紫色に染色されている）、 PESTを 600μL滴下し、 5分間放置 する 。 この洗浄操作を呈旦行う 。 2 .4%PFAを 400μL滴下し、 15分間 固定する。 3 . 固定後、 PESTを 600μL滴下し、 5分間放置して洗浄する 。この操作を 行う 。 m 4 . 洗浄後、 50%Glycerol/PESTを 5∼6滴、サンプルの周囲をまんべんなく滴 下し、気泡を入れないようにカバーガラスをかける 。 5 . カバーガラスから溢れた g l y c e r o lを拭き取った後、マニキュアで縁取りし、 密閉する。プレパラートは 4 °Cで遮光して保存する 。
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