FLAG®テクニカルマニュアル　3.-2.　プロトコール 3.-2.-3.　FLAG融合タンパク質の単離・精製・検出 b) 精製　バッチ法：抗FLAG M2アフィニティーゲル抗FLAG M2アフィニティーゲル(製品番号：A2220)によるFLAG融合タンパク質の精製法【操作手順】 ①タンパク質抽出液のｐHを7～8の間にあわせます。ゲルに非特異的に結合したタンパク質が多量になるのを防ぐため、少なくとも、0.15Mの濃度で塩（塩化ナトリウムか塩化カリウム）の使用が有効です。 ②FLAG融合タンパク質の抽出物に不溶性物質がある場合は、除去して下さい。タンパク質抽出液中を約10,000-20,000xgで15分間、遠心するか、または、0.45または0.22mmのフィルターでろ過することにより、カラムやフィルターを詰まらせてしまう細胞残渣や微粒子を除去できます。 ③FLAGM2抗体アフィニティーゲルは使用前に平衡化して下さい。ゲルの準備の項目をご覧下さい。 ④TBSでゲルを再懸濁してタンパク質抽出液を加えます。 ⑤FLAG融合タンパク質を捕捉するために、抗FLAG M2アフィニティーゲルとタンパク質抽出液を一緒に約1時間、やさしく混合しながら、インキュベーションします。混合はオーバーヘッドミキサーかプラットフォーム型シェイカーのどちらかを使います。ゲルビーズを壊す恐れがあるので磁気スターラーは使わないで下さい。このステップは2-8℃、または室温で行って下さい。このインキュベーションは短い時間で30分から、せいぜい2-3時間くらいまで行ってもかまいません。もし、インキュベーションを3時間以上行いたい場合は、その間に微生物の繁殖または、タンパク質分解を防ぐ為に、抗生物質やプロテアーゼインヒビターを加えて下さい。 ⑥結合ステップを終えた後、ゲルを回収して下さい。遠心（1,000xg、5分間）、または、ろ過によって、ゲルを回収します。 ⑦TBSでゲルを洗浄して、非特異的タンパク質をすべて除去します。これ以上タンパク質が流出しなくなるまで、カラムに新鮮なバッファーを通します。 ⑧ゲルから溶出されるタンパク質は280nmの波長で測定することによりモニターします。洗浄溶液ブランクに対して、カラムから出てきた溶液の吸光度の差が0.05以下になるまで、洗い続けます。 ⑨FLAGタンパク質のゲルからの溶出は、低ｐHでもFLAGペプチドによる競合どちらでも可能です。溶出ステップは、“FLAG融合タンパク質のカラムからの溶出”と同様に行って下さい。 ⑩ゲルは再生、保存できますので、抗FLAGM2アフィニテーゲルによる精製法（カラム法）の再生と保存の項目を参考にして下さい。