茶およびカテキンの百日咳菌に対する防御作用

599
茶およびカテキンの百日咳菌に対する防御作用
1)
Key
昭和大学医学部細菌学教室,2)三井農林株式会社食品総合研究所
堀内
善信1)戸
田眞佐子1)大
原
征彦2)島
村
words:
tea,
久保幸枝1).
忠勝1)
(平成3年12月9日
受付)
(平成3年12月17日
受理)
Catechin,
Bordetella
要
pertussis,
LPF,
cell adhesion
旨
茶およびカテキンの百日咳に対する感染防御の可能性を,百
日咳菌に対する殺菌活性,菌
への付着に対する抑制作用および百日咳毒素のリンパ球増多(Lymphocytosis
対する不活化作用を指標として検討した.殺
茶およびコーヒーは,そ
菌活性については,い
れぞれ常用飲用濃度(5%)で,百
アール茶も比較的弱いながら殺菌活性を示した.(-)エ
フラビンジガレート(TF3)
HeLa細
日咳菌に対して強い殺菌活性を示した.プ
およびテア
間以内に百日咳菌を完全に殺菌した.
れに対し,緑茶および紅茶は,培養細胞への菌の付着を強く抑制した.
性不活化作用は,細胞への百日咳菌の付着抑制とは逆で,1%で
さず,また紅茶でもわずかな不活化作用しか示さなかった.一方,EGCgお
不活化作用を示し,なかでもTF3の
には百日咳防御に関して,興
序
活性に
ずれも濃度依存的であり,緑茶,紅
胞への百日咳菌の付着能に対する抑制作用を検討したところ,EGCgやTF3
は全く抑制を示さなかった.こ
百日咳毒素のLP活
の培養細胞
LP)
ピガロカテキンガレート(EGCg)
の殺菌活性は強く,1mg/miで24時
胞およびCHO細
promoting,
緑茶が全く作用を示
よびTF3は100μg/mlで
不活化作用は顕著であった.以上の結果から茶,EGCgお
強い
よびTF3
味ある活性のあることが示された.
児の主要な感染症の地位を占めているのが現状で
文
くから重篤な乳幼児呼吸器感染症
ある1).これらの国の多くは,副反応低減のための
の一つとして,広く注目を集めてきた1).強い伝染
菌体成分ワクチン導入もさることながら,それ以
性や感染初期における診断の難しさから,1960年
前に,他
百日咳は,古
にも接種率および接種効果の向上などの
代に効果的なワクチンが実用化されるまで,その
ために解決すべき多くの問題を抱えているものと
実効的な疾病制御は困難であった.そ
考えられる.
の後も,ワ
クチンの副反応による接種率の低下に伴って罹患
ところで,近年,茶
およびカテキンの抗菌・殺
率が一時的に上昇する等の問題がみられた2)3).
菌活性や生理活性に関して,興
1981年に日本で,菌体成分ワクチンが実用化さ
れ,下痢原性消化器感染症原因-菌6)∼11),皮
膚糸状
れ4),こうした問題の解決に対する期待が高まっ
菌12),MRSA
た.そ
なウイルス性疾患においても防御効果を示す可能
れに伴い,ワ
クチンの改良に向けた研究が
世界的に活発化した5)にも関わらず,その後,未だ
新たな菌体成分ワクチンの本格的実用化の例はみ
られていない.百
日咳は,今なお多くの国で乳幼
別刷請求先:(〒142)東
平成4年5月20日
島村
13),さらにはインフルエンザ14)のよう
性を示唆する知見が報告された.
そこで,われわれはこの度,ワ
クチンによる制
御に加え,日常飲用に供されている茶類の百日咳
制御への応用の可能性を検討するための第一段階
京都品川区旗の台1.5-8
昭和大学医学部細菌学教室
味ある研究がなさ
忠勝
として,百
日咳菌に対する殺菌活性,培
養細胞へ
堀内善信他
600
の菌付着抑制能および百日咳毒素活性の不活化作
既報7)の方法で抽出してサンプルとした.カ
用について検討した.そ
ンは精製EGCg(緑
の結果若干の興味ある知
見を得たので報告する.
茶より精製17))を
20(w/v)%,コ
材料と方法
1) 使用菌株
Casamino
acid
USA)
7.0に溶解した.こ
pH
(CA,
Technical
grade,
れを20%牛
本生物材料センター)加Bordet
G)培
地(Difco.
USA)で37℃,48時
2.5×1010CFU/mlと
濁,バ
&
イアルに分注して-80℃
(B・
血清に懸
月以上にわたって安
実験の際には,そ
れぞれ新しいバ
イアルを融解して用いた.
2)
HeLa細
(CHO)
Hamster
Ovary
229細胞は,千葉県血清研究所の鈴木博士
た,CHO細
細胞株を用いた.培
養は,10%牛
Essential
Medium
胞は当教室保存
(MEM-FCS
緑茶(煎茶,宇
国茶)お
toxin;
日咳菌1相
(S
&
S)培
Sepharose
Cl-6B
Sweden)
PT)
東浜株をSteiner
地で37℃,5日
た上清から,Sekuraら18)の
間静置培養し
Fine
Chemicals,
によるゲル炉過によりさらに精製した.
リアクリルアミドゲル電気泳
雑の有無の検査の結果,高
1
5)
Structual
formulae
Epigallocatechin
a)
ァー
&
gallate
(EGCg),
S培
地で25倍
た緑茶,紅
ン酸緩衝液(glycerol-
濃度
し
アール茶の保存抽出液を
れぞれ20,
希釈溶液を調製した.さ
gallate
b)
東浜株を,2倍
に希釈して10gCFU/mlと
茶,プ
滅菌蒸留水で希釈,そ
v)%の
of Epigallocathechin
7の50(v/
で保存した.
上記凍結保存百日咳菌1相
を用い,
による
度精製標品で
殺菌活性
のS
茶(Lipton(R)),プ
よびコーヒー(UCC(R))
a)(—)
中に-20℃
た.ま
治山田),紅
Fig.
v) % glycerol加M/100リ
PBS)
&
方法に準じて精製し,
(Pharmacia
得られたPTは,ポ
10)中,
茶およびカテキン
ル茶(中
Schlte
胎児血清加・
37℃ で炭酸ガス培養法により行った.
3)
液
時希釈して用い
あることが確認された.このPTは,pH
より分与を受けた.ま
Minimum
百日咳毒素(pertussis
FHA夾
細胞
HeLa
出
動法による純度検定およびELISA法
胞およびChinese
茶は
は各々PBSで2mg/ml溶
に凍結保存し,用
PTは,百
に凍結保存した15).
この保存菌液の生菌数は6ヵ
定しており,各
4)
間培養した後,
なるように40%牛
照).各
た.
Difco,
血液(日
Gengou
よびTF3
を作成,-20℃
東浜株を少量の1%
用いた(Fig.1参
ーヒーは25(w/v)%のPBS抽
液,EGCgお
凍結乾燥百日咳菌I相
テキ
茶より精製16))およびTF3(紅
Teaflavin
and Teaflavin
digallate
10, 4.0,
1.0 (w/
らに,EGCgお
よ
digallate.
(TF3)
b)
感染症学雑誌
第66巻
第5号
601
茶,カテキンの抗百日咳作用
びTF3の
各溶液も同様に希釈,2.0,
ml,お
よび2.0,
製した.こ
を,組
1.0,
0.2mg/mlの
れら各希釈50μlと,上
養0,
1,
3,
希釈溶液を調
(96穴)の
潤箱中,37℃
各ウェ
々の
つを採取し,Miles
19)の方法によりB・G培
&
地で生菌数をカウ
ントした.
6)
地で37℃,24時
東浜株を1%
CAに
菌液100μlず
に対する殺菌活性
茶,コ
ーヒー,EGCgお
よびTF3の,百
緑茶,紅茶,プ
コーヒー,200μg/mlのEGCgお
ぞれ等量混和し,37℃
の
それ
で15分間処理した.こ
示すように非常に強い殺菌活性
菌液において,
も,48時
間目までに完全に
殺菌された.それ以下の濃度では,48時
の完全な殺菌には至らなかったが,茶
れら
Fig.
2
Bactericidal
against
B.
cultured
処理菌液および対照無処理菌液を15,000回
転で5
に希釈した.
前に培養液を除去し,PBSで
2×104/wellのHeLa細
洗浄した
胞およびCHO細
間以内で
の濃度に依
胞の各
in
containing
tea
or
activity
pertussis.
a
a)
d)
counted
at
geometric
0,
at
tea,
37•Ž.
1, 3, 24
mean
of
and
at
tea
108/ml
100,ul/well
green
coffee
of
5•~
of
b)
S
48
least
&
black
Viable
and
coffee
bacteria
tea,
cell
hr.
were
S
medium
c)
pu-erh
numbers
were
point
shows
Each
3
repeated
●;
0.5%,
experi-
ments.
4ウ
ェルに,こ
の処理希釈菌液各20μlを添加し,
37℃ で45分間接触させた.つ
づいてこれら各ウェ
ルに180μlの1%
CAを
菌を回収し,さ
添加して上清の浮遊百日咳
らに温和なTrypsin処
胞付着百日咳菌を回収した.回
○;
10%,
△;
5%,
□;
2%,
a)
Green
tea
b) Black
理により細
菌活性の場
れらの菌液を無細胞
ウェルに添加して同様に測定したところ,用
いた
条件下では殺菌活性による著しい生菌数の減少
や,ウ
7)
ェルへの非特異的な吸着はみられなかった.
百日咳毒素LP活
2%の
TF3を
緑茶,紅
茶,お
性に対する不活化作用
よび200μg/mlのEGCg,
それぞれ,10μg/mlお
c)
よび2μg/mlのPT
と等量混和した.5μg/mlと1μg/mlのPT溶
液,
生理食塩液の各対照および上記検体・PT混
液の
各々0.5mlを,1群5匹
4週
齢)の
腹腔内に投与,3日
のマウス(ddY,
♀,
後にメランジュールを
用いて各マウスの尾静脈から採血した.採
取した
血液を型通りにチュルク液に浮遊し,ノ
イバウ
アーの血球計算盤を用いて,鏡
検下,リ
および白血球数を併せてカウントした.
平成4年5月20日
ンパ球数
▲;
trol
収した上清浮遊お
よび細胞付着百日咳菌の生菌数を,殺
合と同様にカウントした.こ
間
まで継続的な菌の増殖がみられた.これに対し,
緑茶はFig.2aに
ァール茶,
よびTF3と
分間遠心洗浄した後,1%CAで100倍
日咳菌
2に示すように茶抽出液無添加対照では,48時
が認められず,5%で
濃度を分光光度計(日
際濁度単位に調整した.こ
つを,2%の
百日咳菌
10%の濃度では,培養1時間目で既に生菌の検出
間培養した百日咳菌1相
浮遊,菌
立,U-1100)で0.1国
そして,直
よびTF3の
を示し,出発時5×108CFU/mlの
培養細胞への菌付着抑制作用
B・G培
績
1) 茶,コーヒー,EGCgお
の増殖像に対する影響を検討した.その結果,Fig.
で培養した.培
24時間および48時間目に,各
ウェルから培養物20μlず
Misra
成
0.1mg/
記希釈菌液50μl
織培養用平底Microplate
ル中で等量混和,湿
0.4,
Pu-erh
tea
d) Coffee
tea
Con-
堀内善信他
602
存して生菌数の減少が認められた.
紅茶の場合,Fig.2bに
うに,1mg/mlで,EGCgで
示すように10%で
時間目で生菌の検出が認められず,そ
は,24
めなかった.そ
れ以下の濃
度でも,茶の濃度に依存して48時間まで継続的な
れ以下の濃度でも,茶同様,そ
れ
ぞれ濃度依存的な殺菌効果がみられた.
生菌数の減少がみられた.
2) 培養細胞への菌付着抑制活性
プァール茶の場合,Fig.2cに
みられるように,
48時間以内での完全な殺菌には10%の
た.そ
は24時間で,またTF3
では48時間で完全な殺菌に至り,生菌の検出を認
れ以下の濃度では,2%ま
次に菌定着に対する阻止の可能性を探るため,
濃度を要し
では,48時
培養HeLa細
間ま
胞およびCHO細
胞への百日咳菌の
付着に及ぼす緑茶,紅茶,EGCgお
よびTF3の
で濃度に依存した継続的な生菌数の減少が認めら
制能について検討した.こ
れたが,0.5%で
ンで処理した菌液の100倍希釈(103CFU/ml)に
は十分な殺菌活性ばみられなかっ
た.
れらの茶およびカテキ
いて細胞付着能を調べたところ,Table
コーヒーでは ,緑茶10%で
はみられなかったが,10%お
見られた急速な殺菌
Table
よび5%で
胞およびCHO細
目までに完全な殺菌が認められ,さ
は24時間
らに,2%の
抑
つ
1および
2に示したように,緑茶と紅茶は,HeLa細
胞のいずれに対する菌付着をも
強く抑制した.一方,EGCgお
よびTF3の
低濃度でも48時間目までに完全な殺菌が認められ
用いた条件下では,HeLa,
た(Fig.2d),す
への菌付着に対しても,顕著な抑制を示さなかっ
なわち,コーヒーの場合,殺菌有
CHOの
場合,
いずれの細胞
効濃度や殺菌速度からみて,これまで示した他の
た.さらに104CFU/mlの
茶とは,殺
ついても検討したところ,細胞付着および上清浮
菌活性の機作が異なる可能性が考えら
れた.
処理菌液を用いた場合に
遊の各菌数は,用いた菌濃度に依存してそれぞれ
茶成分のうちEGCgお
よびTF3が,既
菌性下痢症起因菌の場合と同様,百
ても殺菌活性を示すか否かを,茶
検討した.その結果,Fig.3aお
Fig.
3
or
b)
shows
の場合と同様な結果であった.
と同様の方法で
3) 百日咳毒素LP活
よび3bに示したよ
were
TF3.
約10倍に増加したが,付着抑制については103/ml
日咳菌に対し
Bactericidal
bacteria
報8)の細
activity
cultured
Viable
geometric
cell
mean
a)
○;
1mg/ml
EGCg,
b)
○;
1mg/ml
TF3,
a) EGCg
of
in
△;
△;
and
a 100ƒÊl/well
numbers
of
EGCg
百日咳毒素は,百
at
were
least
200μg/ml
500μg/ml
TF3
of
S
counted
S
at
3 repeated
B.
medium
0,
1, 3, 24
日咳発症の上で重要な役割を
pertussis.
5•~
108/ml
containing
a)
EGCg
Each
point
and
48
hr.
experiments.
EGCg,
TF3,
against
&
性に対する不活化作用
□;
□;
50μg/ml
100μg/ml
EGCg,
TF3,
●;
●;
Control.
Control.
b) TF3
感染症学雑誌
第66巻
第5号
茶,カテキンの抗百日咳作用
Table
1
EGCg
Inhibitory
and TF3
tussis to HeLa
1):
Geometric
2):
Significantly
1%CA
tions
37•Ž
of
1%
black
for
B. pertussis
were
100ƒÊg/ml
and
min.
and
as
2
Inhibitory
EGCg and TF3
1): Geometric
from
tea,
supernatant
expressed
Table
per-
of green tea, black tea,
of Bordetella
viable
adherent
with
100
229
number
of
to
the
cells
green
TF3
times.
HeLa
mean
1%
100ƒÊg/ml
The
cells
was
of two
at
in
four
the
結果,Table
and
wells.
3に示したように5μg/mlのPTに
対して,1%緑
びTF3は
担うものと考えられている.そ
て,緑茶,紅茶,EGCgお
茶,紅
茶は全く不活化作用を示さ
ついて,百
日咳毒素に対する不活化能の検討を行った.そ
3
Inhibitory
1):
Geometric
5ƒÊg/ml
the
expressed
平成4年5月20日
mean
of five
PT, 1ƒÊg/ml
concentrations
injected
with
as
action
of
promoting
PT
0.5ml
geometric
mice
in the
of each
mean
tea,
(control)
table.
mixture
counts
不活化作用を示した.一
black
of pertussis
2):
or saline
shown
green
activity
Five
and
95%
was
mixed
bled
of leuco-lymphocytes
EGCg
and
TF3
on
the
leuco-
interval
with
old
3 days
green
female
later.
per
tea,
ddY
The
,al
black
mice
tea,
were
residual
of the
blood
EGCg
or TF3
intraperitoneally
LP
匹敵する
方,EGCgは5μg/mlの
toxin
confidential
of 4 weeks
were
tea,
ころが,
用いた場合,緑茶はやはり不活
化作用を示さなかったが,紅茶はTF3に
の
よ
ともに顕著な不活化作用を示し,特に
強い不活化作用が認められた.と
1μg/mlのPTを
性を指標とし
よびTF3に
lymphocytosis
TF3に
こで,代表的な百
日咳毒素活性の一つであるLP活
as
1. except for using CHO cells.
dilu-
counted
or
in Table
or
in wells
bacteria
mean
なかった.これに対して,100μg/mlのEGCgお
Table
per-
2): Significantly different from control (p= 0.05)
The experiment was carried out in the same manner
(p=0.05)
treated
diluted
with
a geometric
control
EGCg,
were
The
action
on adherence
tussis to CHO cells
co-incubated
45
tea,
of Bordetella
cells
different
(control)
were
of green tea, black
mean
106CFU/ml
tea,
action
on adherence
603
activities
samples.
were
at
堀内善信他
604
PTの
場合と異なり僅かな不活化作用しか示さな
かった.
しかし,殊に紅茶とEGCgの
が,PTの
考
近年,健
濃度によっては逆転をみせたことから,
これらのLP活
察
康に対する関心の高まりとともに,食
不活化作用の強さ
性不活化の機序に多様性のあるこ
とが推察される.また,緑茶,紅茶またはEGCgの
品の生体調節機能に着目した研究が多くみられる
腹腔内投与によって,マ
ようになった.我々6)7)は,50種以上の食品をスク
白血球の増多が観察された.このことは,緑茶お
リーニングした結果,茶
よび紅茶の多様な成分やEGCgが,末
やコーヒーが,多
くの細
ウス末梢リンパ球および
梢リンパ球
菌性下痢起因菌に対して抗菌作用を有することを
や白血球に対して生理活性を有することを示すも
報告した.ま
のと考えられる.この活性と,緑茶および紅茶が
MRSA13)に
た,茶やカテキンが皮膚糸状菌12)や
対しても殺菌作用を有することを報
十分量のEGCgやTF3を
有しているにもかかわ
らず,5μg/mlのPTに
告した.
今回,茶
およびコーヒーが,さ
らに,呼
吸器感
染症起因菌の一つである百日咳菌に対しても殺菌
活性を有することを見いだした.ま
た,そ
の殺菌
対してLP活
性不活化作
用を示さなかったこととの関連は不明である.
以上,茶類,EGCgお
に対して,殺
よびTF3が
菌,菌定着阻止,あ
百日咳菌感染
るいは毒素不活
活性は濃度依存的であり,コーヒーのそれは殺菌
化を通じて防御的に働き得る可能性が示された.
時間や有効濃度からみて,茶
今後さらに,百
とは作用機作が異な
日咳毒素の他の活性に対する不活
ることをうかがわせた.また,茶成分のうち,主
化の可能性や,飲
な有効成分と考えられたEGCgお
検討など,実用化に向けた研究を行うことは,日
よびTF38)は,
用,噴
霧吸入といった投与法の
百日咳菌に対してもやはり強い殺菌活性を示すこ
常飲用している茶の安全性の実績からみても意義
とを確認した.
あるものと考えられる.
文
献
Prevention with use of vaccines
ところで,我々14)は,茶がインフルエンザウイル
スの培養細胞への感染を阻止することを報告し
た.また,Relmanら20)は
1) Wright, P. F.:
-Pertussis
百日咳菌の様々な病原因
子欠損変異株の定着能を,CHO細
of the problem
胞および家兎
Infect.
気管上皮細胞を用いて解析し,用いた継代細胞と
2) Kanai,
CHO細
こで,われわれはHeLa細
胞を用いて緑茶,紅茶,EGCgお
よびTF3
の細胞への百日咳菌付着抑制能を検討した.そ
の
結果,緑茶および紅茶が,常用飲用濃度の5分の
1の=濃度でも,強い菌付着抑制作用を示すことが
明らかになった.一方,EGCgお
よびTF3は,殺
菌活性の場合と異なり,用いた条件下ではほとん
ど菌付着抑制作用を示さず,殺菌活性と菌付着抑
制作用では,互
いに関与する茶成分の有効量もし
くは種類に違いのあることが示唆された.
次に,百
日咳が毒素性疾患の一つであると考え
られていることから,茶,EGCgお
よびTF3に
る百日咳毒素不活化の可能性を探った.ま
活性に対する作用を観察した結果,茶
ろEGCgやTF3に
よ
-143
and prospects
Japan's
for control.
Rev.
1991.
evidence
and vaccination
in
pertussis
in the past thirty
Jpn. J. Med. Sci. Biol., 33: 107
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7)
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戸田眞佐子,
大久保幸枝,
大西玲子,
島村忠勝:
日本茶の抗菌作用および殺菌作用について.
菌誌,
よりはむし
強い不活化作用が認められた.
K.:
years—Review.
胞および
Countries: Definition
Dis., 13: S528-534,
epidemiology
初代気管細胞間で基本的に差異のない結果を報告
している.そ
in Developing
8)
44:
669-672,
戸田眞佐子,
日細
1989.
大久保幸枝,
生貝
感染症学雑誌
初,
島村忠勝:
第66巻
第5号
茶,カテキンの抗百日咳作用
茶カテキン類およびその構造類似物質の抗菌作用
infection
ならびに抗毒素作用.
-40
日細菌誌,
45:
561-566,
1990.
9)
征彦,
石上
正:
Bordetella
茶ポリフェノール類の食中
日食工誌,
16)
征彦,
渡辺真由美:
茶ポリフェノール類のボ
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against
Bordetella
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Yoshinobu HORIUCHI1), Masako TODA1), Sachie OKUBO1),
Yukihiko HARA2) & Tadakatsu
SHIMAMURA1)
1)Department
of Microbiology
and Immunology
2)Food Research
, Showa University School of Medicine
Laboratories , Mitsui Norin Co.
We examined the bactericidal activity of tea and catechins against Bordetella pertussis. Green tea,
black tea and coffee showed marked bactericidal activity at their concentrationsin beverages, while
pu-erh tea killed the bacteria in a moderate way. (-) Epigallocatechin gallate (EGCg) and theaflavin
digallate (TF3) showed also marked bactericidal activity. Green tea and black tea also effectively
blocked the adhesion of B. pertussis to HeLa and CHO cells, whereas ECGg and TF3could not. EGCg
and TF3 markedly inactivated leuco-lymphocytosis promoting activity of pertussistoxin. Black tea
showed slight but significant inactivation of the activity, whereas green tea showed no inactivation.
These results suggest that green tea, black tea, EGCg and TF3 might act as prophylactic agents
against pertussis infection.
平成4年5月20日

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