生理活性反応測定装置 (Micro Bioactivity Analyzer) AMIS

生理活性反応測定装置
(Micro Bioactivity Analyzer)
AMIS-101 データ集
株式会社
バイオエックス
2008 年 10 月
生理活性反応測定装置(Micro Bioactivity Analyzer) AMIS-101 は複雑な発光・発色反応を
伴うことなく、酵素反応などの生理活性反応をシンプルに、リアルタイムでの定量測定が
可能です。
数マイクロリットルの微量での測定が可能であり、収量の少ないタンパクの代謝機能の解
析に威力を発揮します。
当データ集は本測定装置の基本性能を示すために測定例としてまとめたものですが、下記
の一覧表に示す通り、幅広い範囲での応用が可能であることがわかります。
基質
酵素
グルコース
Glucose　Oxidase
グルコース
Glucose Dehydrogenase
Glycerol Kinase +
グリセロール
Glycerophosphate Oxidase
エタノール
Alcohol Dehydrogenase
ホルムアルデヒド
Formaldehyde Dehydrogenase
アセトアルデヒド
Aldehydel Dehydrogenase
ＡＴＰ
Alkaline Phosphatase
尿素
Urease
クレアチニン
Creatinine　Deiminase
オリーブ油
Lipoprotein Lipase
リノール酸コレステロール Cholesterol Esterase
DL-BAPNA
Tripsin
酵素検出感度
補酵素基質検出感度
(20µl中の絶対
検出対象
ページ
(µM)
量)
10µg/ml
0.5µg/ml 過酸化水素＋グルコン酸
2
(55µM)
(1ng)
20µg/ml
NAD
プロトン
3
(111µM)
1.
5
µg/ml
ATP
過酸化水素
4
(16µM)
10µg/ml
NAD
プロトン
5
(217µM)
0.3µg/ml
NAD
プロトン＋蟻酸
6
(10µM)
5ng/ml
NAD
プロトン＋酢酸
7
(0.1µM)
5µg/ml
0.1unit/ml リン酸
8
(10µM)
(0.002unit）
2µg/ml
アンモニア
9
(33µM)
1µg/ml
1μg/ml アンモニア
10
(8.8µM)
(2ng)
100µg/ml
オレイン酸
11
200µg/ml
リノール酸
12
(300µM)
60µg/ml
アルギニンカルボン酸
13
なお、当データ集に示すプロトコルはすべて精製された試薬ベースのものであり、実際の
サンプルでの測定に際しては精製など各サンプルの状態に応じた前処理と試薬の設計が必
要となります。具体的なプロトコルの構築に関しましてはご相談下さい。
1
1.
グルコース（その１）
酵素：Glucoseoxidase
基質：Glucose
Buffer：1mM Tris-HCl pH6.8
反応機構
ｍ
50 M NaCl
Glucoseoxidase
β-D-Glucose + O2 + H2O
δ
D-Glucono- -lactone + H2O2
方法：①酵素 Glucoseoxidase を Buffer にて 0.1mg/ml に溶解した。
②基質 Glucose を Buffer にて所定の濃度に溶解した。
③センサーA、B に①の酵素溶液を 18 マイクロリットル投入した
④AMIS-101 にセンサーをセットし、温度が安定したらセンサーA に②の基質を、
センサーB に Buffer（Reference）を各 2μリットル加えて測定した。
⑤（センサーA の出力）― (センサーB の出力)を反応による出力とした。
Output
Analytical Curve (Linear)
100mg/dl
0
50mg/dl
50
100
25mg/dl
150
200
10mg/dl
250
0
300
0
0
-0.02
-10
-0.04
V
20
40
60
-20
-0.06
-0.08
-30
-0.1
-40
-0.12
-50
-0.14
mg/dl
Sec.
2
80
100
120
2.
グルコース（その２）
酵素：Glucosedehydrogenase
補酵素：NAD
基質：Glucose
Buffer：1mM PBS-KOH pH7.0
反応機構
β-D-Glucose + NAD
ｍ
100 M NaCl
Glucose Dehydrogenase
+
D-Glucose-
δ-lactone + NADH + H
+
方法：①酵素 Glucosedehydrogenase を Buffer にて 1.4mg/ml に溶解した
②補酵素 NAD を Buffer にて 3.5mg/ml に溶解した
③基質 Glucose を Buffer にて所定の濃度に溶解した
④センサーA、B に①の酵素溶液を 9 マイクロリットル投入した
⑤センサーA、B に②の補酵素溶液を 9 マイクロリットル投入した
⑥AMIS-101 にセンサーをセットし、温度が安定したらセンサーA に③の基質を、
センサーB に Buffer（Reference）を各 2μリットル加えて測定した。
⑦（センサーA の出力）― (センサーB の出力)を反応による出力とした。
Output
Analytical Curve (End Point)
200
0
100
50
40
100
20
150
200
10
250
0
300
0.0
-0.2
-0.4
V
-0.6
-0.8
-1.0
0
0
-100
-200
-300
Vm-400
-500
-600
-700
-800
-900
50
100
150
y = -4.0385x + 11.039
2
R = 0.9975
mg/dl
Sec.
3
200
250
3
．グリセロール
酵素：Glycerol Kinase, Glycerol Phosphate Oxidase
基質：Glycerol
Buffer：1mM ATP-NaOH pH7.0
反応機構
Glycerol Kinase
Glycerol + ATP
Glycerophosphate Oxidase
Glycerol-3-phosphate +O2
Dihydroxyacetonephosphate
+ H2O2
方法：①酵素 Glycerol Kinase (酵素１)を Buffer にて 0.2ｍg/ml g/ml に溶解した
②酵素 Glycerophosphate Oxidase（酵素２）を Buffer にて 0.2ｍg/ml に溶解
した。
③基質 Glycerol を Buffer にて所定の濃度に溶解した
④センサーA、B に①の酵素１溶液を 9 マイクロリットル投入した
⑤センサーA、B に②の酵素２溶液を 9 マイクロリットル投入した
⑥AMIS-101 にセンサーをセットし、温度が安定したらセンサーA に③の基質を、
センサーB に Buffer（Reference）を各 2μリットル加えて測定した。
⑦（センサーA の出力）― (センサーB の出力)を反応による出力とした。
Output
Analytical Curve (End Point)
1.6mg
0
100
200
3.2mg
300
6.5mg
400
500
600
0.00
0
-0.02
0
0.2
0.4
-20
-0.04
-40
V-0.06
Vm -60
-80
-0.08
-0.10
-100
-0.12
-120
SEC
-140
mg/dl
4
0.6
0.8
4
．エタノール
酵素：Alcohol Dehydrogenase
補酵素：NAD
基質：Ethanol
Buffer：1mM K-PBS pH7.0 NaCl 50mM
反応機構
Alcohol Dehydrogenase
Ethanol + NAD
+
Acetoaldehyde + NADH + H+
方法：①酵素 Alcohol Dehydrogenase を Buffer にて 0.1mg/ml に溶解した
②補酵素 NAD を Buffer にて 1.8mg/ml に溶解した。
③基質 Ethanol を Buffer にて所定の濃度に溶解した
④センサーA、B に①の酵素溶液を 9 マイクロリットル投入した
⑤センサーA、B に②の補酵素溶液を 9 マイクロリットル投入した
⑥AMIS-101 にセンサーをセットし、温度が安定したらセンサーA に③の基質を、
センサーB に Buffer（Reference）を各 2μリットル加えて測定した。
⑦（センサーA の出力）― (センサーB の出力)を反応による出力とした。
Output
200
150
0
V
Analytical Curve (End Point)
100
100
50
200
25
0
300
0
0
-0.1
-100
50
100
150
-200
-0.2
Vm
-300
-0.3
-0.4
-400
-0.5
-500
g/l
Sec.
5
200
250
５．ホルムアルデヒド
酵素：Formaldehyde Dehydrogenase
補酵素：NAD
基質：Formaldehyde
Buffer：1mM Tris-HCl pH8.5
反応機構
Formaldehyde Dehydrogenase
+
Formaldehyde + NAD
Formic Acid + NADH + H
+
方法：①酵素 Formaldehide Dehydrogenase を Buffer にて 0.1mg/ml に溶解した
②補酵素 NAD を Buffer にて 1.8mg/ml に溶解した。
③基質 Formaldehyde を Buffer にて所定の濃度に溶解した
④センサーA、B に①の酵素溶液を 9 マイクロリットル投入した
⑤センサーA、B に②の補酵素溶液を 9 マイクロリットル投入した
⑥AMIS-101 にセンサーをセットし、温度が安定したらセンサーA に③の基質を、
センサーB に Buffer（Reference）を各 2μリットル加えて測定した。
⑦（センサーA の出力）― (センサーB の出力)を反応による出力とした。
Output
0.5mM
0
-10
-20
-30
Vm-40
-50
-60
-70
-80
Analytical Curve (Linear)
0.2mM
0
2
0.1mM
4
6
0.05mM
8
10
0.01mM
12
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0
-2
-4
-6
-8
-10
-12
-14
Formaldehyde mM
min
6
0.5
0.6
6
．アセトアルデヒド
酵素：Aldehyde Dehydrogenase
補酵素：NAD
基質：Acetaldehyde
Buffer：1mM K-PBS pH7.0
反応機構
Aldehyde Dehydrogenase
Acetaldehyde + NAD
+
Acetic Acid + NADH + H
+
方法：①酵素 Aldehide Dehydrogenase を Buffer にて 0.1mg/ml に溶解した
②補酵素 NAD を Buffer にて 1.8mg/ml に溶解した。
③基質 Acetaldehyde を Buffer にて所定の濃度に溶解した
④センサーA、B に①の酵素溶液を 7.5 マイクロリットル投入した
⑤センサーA、B に②の補酵素溶液を 7.5 マイクロリットル投入した
⑥AMIS-101 にセンサーをセットし、温度が安定したらセンサーA に③の基質を、
センサーB に Buffer（Reference）を各 5μリットル加えて測定した。
⑦（センサーA の出力）― (センサーB の出力)を反応による出力とした。
Output
3
0
Analytical Curve (End Point)
2
100
1
200
0.5
0.3
300
400
0
0.1
0
-50
-100
-150
Vm-200
-250
-300
-350
-400
-450
0.0
-0.1
V
-0.2
-0.3
-0.4
Sec.
1
2
y = -101.89x + 1.9694
R2 = 0.9952
g/l
7
3
4
7
．ATP(アデノシン三燐酸)
酵素：Alkaline Phosphatase
基質：ATP(Li)
Buffer：10mM Mops-Tris pH7.4
反応機構
2mM MgCl2
Alkaline Phosphatase
ATP
ADP,
AMP + Pi
MgCl2
方法：①酵素 Alkaline Phosphatase を Buffer にて 60u/ml に溶解した
②基質 ATP Li 塩を Buffer にて所定の濃度に溶解した
③センサーA、B に①の酵素溶液を 18 マイクロリットル投入した
④AMIS-101 にセンサーをセットし、温度が安定したらセンサーA に②の基質を、
センサーB に Buffer（Reference）を各 2μリットル加えて測定した。
⑤（センサーA の出力）― (センサーB の出力)を反応による出力とした。
Output
5.2mM
Analytical Curve (Linear)
3mM
5
2mM
10
1mM
1mM(2)
0.5mM
15
20
25
0.2mM
0
30
1
2
3
0.0
0
-5
-10
-15
-20
Vm-25
-30
-35
-40
-45
-50
-0.5
-1.0
-1.5
-2.0
-2.5
-3.0
min
8
ATP (mM)
4
5
6
８．尿素
酵素：Urease
基質：Urea
Buffer：1mM Tris-HCl pH8.0
反応機構
50mM KCl
Urease
(NH2)2CO + H2O + 2H
+
+
2NH4 + CO2
方法：①酵素 Urease を Buffer にて 0.075mg/ml に溶解した
②基質 Urea を Buffer にて所定の濃度に溶解した
③センサーA、B に①の酵素溶液を 15 マイクロリットル投入した
④AMIS-101 にセンサーをセットし、温度が安定したらセンサーA に②の基質を、
センサーB に Buffer（Reference）を各 5μリットル加えて測定した。
⑤（センサーA の出力）― (センサーB の出力)を反応による出力とした。
Output
10mg/dl
Analytical Curve (End Point)
8mg/dl
5mg/dl
3mg/dl
2mg/dl
500
450
400
350
300
Vm250
200
150
100
50
0
0.5
0.4
0.3
V 0.2
0.1
0
-0.1
0
50
100
150
y = 42.613x + 7.5385
R2 = 0.9981
0
Sec.
9
2
4
6
mg/dl
8
10
12
９．クレアチニン
酵素：Creatinine Deiminase
基質：Creatinine
Buffer：1mM Tris-HCl pH7.5
反応機構
50mM NaCl
Creatinine Deiminase
+
+
Creatinine + H2O + H
N-Methylhydrantoin + NH4
方法：①酵素 Creatinine Deiminase を Buffer にて 0.1mg/ml に溶解した
②基質 Creatinine を Buffer にて所定の濃度に溶解した
③センサーA、B に①の酵素溶液を 18 マイクロリットル投入した
⑤AMIS-101 にセンサーをセットし、温度が安定したらセンサーA に②の基質を、
センサーB に Buffer（Reference）を各 2μリットル加えて測定した。
⑤（センサーA の出力）― (センサーB の出力)を反応による出力とした。
Output
0.12
Analytical Curve (End Point)
10mg/dl
7mg/dl
5mg/dl
3mg/dl
1mg/dl
50
0.10
40
0.08
30
V 0.06
20
0.04
y = 4.2517x - 0.0238
R2 = 0.9977
10
0.02
0
0.00
0
100
200
300
Sec.
10
0
2
4
6
mg/dl
8
10
12
10
．オリーブ油
酵素：Lipoprotein Lipase
基質：Olive Oil
Buffer：5mM K-PBS pH7.0
反応機構
Lipoprotein Lipase によるオリーブ油の加水分解の結果生じるオレイン酸を検出
方法：①酵素 Lipprotein Lipase を Buffer にて 0.1mg/ml に溶解した
②基質オリーブ油を Buffer にて所定の濃度に溶解し、超音波処理を行った。
③センサーA、B に①の酵素溶液を 18 マイクロリットル投入した
④AMIS-101 にセンサーをセットし、温度が安定したらセンサーA に②の基質を、
センサーB に Buffer（Reference）を各 2μリットル加えて測定した。
⑤（センサーA の出力）― (センサーB の出力)を反応による出力とした。
Output
Analytical Curve (Linear)
10mg/ml
0.5mg/ml
0
5mg/ml
0.1mg/ml
100
1mg/ml
200
0
0
20
40
60
0
-0.005
-2
-0.01
-0.02
50 -4
-E
X -6
-0.025
-8
V -0.015
-0.03
-10
sec.
11
mg/ml
80
100
120
11
．リノール酸コレステロール
酵素：Cholesterol Esterase
基質：Cholestryl Linoreate
Buffer：1mM Tris-HCl pH7.5
反応機構
Cholesterol Esterase による Cholestryl Linoreate 分解反応の結果生じるリノール
酸を検出
方法：①酵素 Cholesterol Esterase を Buffer にて 0.1mg/ml に溶解した
②基質 Cholestryl Linoreate を IPA に溶解し Buffer にて所定の濃度に希釈し、
過熱して IPA を蒸発させた後超音波処理を行った。
③センサーA、B に①の酵素溶液を 18 マイクロリットル投入した
④AMIS-101 にセンサーをセットし、温度が安定したらセンサーA に②の基質を、
センサーB に Buffer（Reference）を各 2μリットル加えて測定した。
⑤（センサーA の出力）― (センサーB の出力)を反応による出力とした。
Output
300mg/dl
0.00
-0.01
-0.02
-0.03
-0.04
V
-0.05
-0.06
-0.07
-0.08
-0.09
0
Analytical Curve (Linear)
200mg/dl
50
100mg/dl
100
150
50mg/dl
200
10mg/dl
250
300
0
100
200
0.00
-10.00
-20.00
-30.00
y = -0.0914x - 0.1788
2
R = 0.9765
-40.00
Sec.
mg/dl
12
300
400
12
．DL-BAPNA（合成基質）
酵素：Tripsin
基質：Nα-Benzoyl, L-arginine 4-nitroanilide hydrochloride
Buffer：2.5mM Tris-HCl pH8.3
反応機構
酵素 Tripsin
（
DL-BAPNA）
による基質 Nα-Benzoyl, L-arginine 4-nitroanilide hydrochloride
をアルギニンカルボン酸を検出
方法：①酵素 Tripsin を Buffer にて 1mg/ml に溶解した。
②基質 DL-BAPNA を Buffer にて所定の濃度に溶解した。
③センサーA、B に②の DL-BAPNA 溶液を 18 マイクロリットル投入した
④AMIS-101 にセンサーをセットし、温度が安定したらセンサーA に①の酵素溶
液を、センサーB に Buffer（Reference）を各 2μリットル加えて測定した。
⑤（センサーA の出力）― (センサーB の出力)を反応による出力とした。
（DL-BAPNA）の分解反応の結果生じる
Output
Analytical Curve (End Point)
0.5
0
50
0.25
100
0.125
150
200
0.0625
250
300
0
0
350
0
0.00
-0.1
-0.10
-0.2
-0.20
V-0.3
V-0.30
-0.4
-0.40
-0.5
-0.50
0.1
0.2
0.3
-0.60
-0.6
mg/ml
SEC
13
0.4
0.5
0.6
14
株式会社バイオエックス
〒610-0121
京都府城陽市寺田今堀 121-17
TEL 0774-27-2422 / FAX 0774-54-3561
Email [email protected]
Web http://www.bio-x.co.jp/
15

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