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● シンポジウム 2　神経保護と神経再生
ワルファリン誘発出血性梗塞に対する
シロスタゾールの保護作用の検討
北庄司輝，原英彰
要　旨
現在，出血性梗塞に対する有効な治療法はなく，ワルファリンによる出血性梗塞の増大は致命的であるた
め，その治療法の確立が不可欠である．抗血小板薬であるシロスタゾールは神経保護作用および血管内皮細胞
保護作用を含む様々な保護作用を有することが知られているが，ワルファリン服用患者には慎重投与とされて
いる．本研究では，シロスタゾールが tight junction proteins および VE-cadherin を増強することで，ワルファリ
ンによる出血性梗塞の増悪を抑制することを明らかにした．また，末梢からの出血時間も延長させなかったこ
とから，本研究が臨床に応用できる可能性も示唆された．
（脳循環代謝 25：57∼61，2014）
キーワード : 出血性梗塞，抗凝固薬，ワルファリン，シロスタゾール，タイトジャンクション
きないことが臨床で用いられる上で主な懸念となって
1．ワルファリン抗凝固療法
いる7）．それゆえ，ワルファリンは臨床において標準
的な経口抗凝固薬として使われ続けている．
脳卒中は年齢に大きく関与している．先進国におけ
早期の出血性梗塞は脳梗塞の合併症として生じ，虚
る高齢化によって，心原性脳塞栓症の主な原因である
血障害や心原性脳塞栓症の大きさは虚血後の早期出血
非弁膜症性心房細動による脳梗塞患者数は 2030 年ま
性梗塞の独立したリスクファクターである8）．さらに
でに 2 倍になることが予測されている
脳虚血後の早期出血性梗塞の深刻なサブタイプである
．
1, 2）
非弁膜症性心房細動による脳梗塞の予防のための標
実質血腫は患者の転帰を悪化させる8）．しかしなが
準的な治療として，経口抗凝固薬の投与は臨床上広く
ら，現在臨床において出血性梗塞を予防するために利
認められており，とくに高血圧，糖尿病，不整脈や脳
用できる有効な治療法はない．出血性梗塞の主な原因
梗塞の罹患歴がある患者において，その使用が強く勧
の一つとして，これまでに脳虚血の実験的研究によっ
められている3, 4）．
て，虚血再灌流後の血液脳関門（BBB）の透過性の上昇
ビタミン K のアンタゴニストであるワルファリン
が関与していることが明らかにされてきている9, 10）．
は，非弁膜症性心房細動患者の心原性脳塞栓症予防の
ワルファリン抗凝固療法患者における出血性梗塞のリ
第一選択薬として，臨床上広く用いられている．
スクに関する研究は未だあまり行われていないが，マ
一方，他の新規経口抗凝固薬，とくにダビガトラン
ウスにおいてはワルファリンの前処置が一過性脳虚血
やリバロキサバンはワルファリンに比べて出血合併症
後の出血性梗塞のリスクを増大させることが報告され
が比較的少ないが
ている11）．
，特異的なアンタゴニストがな
5, 6）
く，出血が起こった際にその作用を軽減することがで
2．シロスタゾールの保護作用
岐阜薬科大学生体機能解析学大講座薬効解析学研究室
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シロスタゾールはホスホジエステラーゼ III 阻害作
用を有する抗血小板薬であり，脳梗塞の 2 次予防およ
び末梢動脈疾患における間欠性跛行に広く用いられて
─ 57 ─
脳循環代謝第 25 巻第 2 号
図 1．ワルファリン誘発出血性梗塞モデルに対するシロスタゾールの効果
A：ワルファリン単独投与群
（左）
とワルファリンとシロスタゾール併用群
（右）
の脳全体写真．
B：Vehicle 群（左），ワルファリン単独投与群（中）およびワルファリンとシロスタゾール併
用群（右）の脳凍結切片写真．
C：ワルファリンとシロスタゾールの出血量に及ぼす影響．
D：虚血 7 日後までの生存率．
E：ワルファリンとシロスタゾール併用による出血時間への影響．
(A–C) Data are expressed as means ± SD (##P < 0.01 vs. vehicle, ＊P < 0.05 vs. warfarin; Tukey s
t-test, n = 6 to 15) . (D) ＊P < 0.05 vs. cilostazol; log-rank t-test, n = 12 or 10. (E) Data are
expressed as means ± SEM (＊＊P < 0.01 vs. Normal; Student s t-test, n = 8)
CSZ：シロスタゾール
（文献 15 より改変引用）
いる．シロスタゾールの特徴の一つは血管内皮細胞を
ため，今後モデルを作製する上で，ワルファリン投与
潜在的に保護することである
．我々は過去にマ
時間を 18 時間に設定した．ワルファリン投与 18 時間
10, 12~14）
ウスにおいてシロスタゾールが BBB の破綻を防ぐこ
後に，3 時間虚血 / 再灌流を施すことにより出血性梗
とで，脳虚血後の出血性梗塞を減少させることを明ら
塞を引き起こし，ワルファリン誘発出血性梗塞モデル
かにしてきた
を作製した．
．
10, 12）
そこで本研究は，脳虚血後のワルファリン誘発出血
4．ワルファリン誘発出血性梗塞モデルに
対するシロスタゾールの出血に及ぼす影響
性梗塞に対するシロスタゾールの作用を明らかにする
ことを目的に検討を行った．
3．ワルファリン誘発出血性梗塞モデルの作製
本モデルマウスを用いて，再灌流直後に梗塞体積を
変化させない量のシロスタゾール（1 または 3 mg/kg）
ワルファリンを水ビンに入れ，自由給水下でマウス
を腹腔内に投与した．出血量はヘモグロビンアッセイ
を飼育し，経時的に血液を採取することで，血液凝固
によって定量した．ワルファリン単独投与群で出血量
能の指標である prothrombin time-international normalized
が増加したのに対し，シロスタゾール併用群ではそれ
ratio（PT-INR）を測定した．その結果，ワルファリン投
が抑制された（図 1A∼C）．また，7 日後までの生存率
与開始 18 時間後に PT-INR が臨床での治療域に達した
も評価したところ，ワルファリン単独投与群よりもシ
─ 58 ─
ワルファリン誘発出血性梗塞に対するシロスタゾールの保護作用の検討
図 2．Tight junction proteins および VE-cadherin の発現量
ウェスタンブロッティングにより，ZO-1（A），Occludin
（B），VE-cadherin（C），Claudin-5
（D）の発現量を定量した．
Data are expressed as mean ± SEM (＊P < 0.05, ＊＊P < 0.01 vs. Sham, #P < 0.05, ##P < 0.01 vs. cilostazol; Student s t-test, n = 8 to 9)
CSZ：シロスタゾール
（文献 15 より引用）
ロスタゾール併用群において有意に生存率が高かった
目した．TJPs は膜貫通型タンパク質の Claudin，
（図 1D）．つぎに，ワルファリンとシロスタゾールの
Occludin および JAM から成り，これらのタンパク質
出血に対する相互作用を検討するため，イソフルラン
は ZO-1 を介して細胞内の actin に連結しており，とく
麻酔下で尻尾の直径が 2.5 mm の場所の尾静脈を切開
に Claudin-5，Occludin および ZO-1 は BBB の重要な
し，湧出する血液を 30 秒ごとにろ紙で吸収し，自然
構成因子である．よって今回，TJPs である Claudin-5，
に止血するまでの時間を測定した．ワルファリン単独
Occludin，ZO-1 および Adherens junction protein である
投与群とシロスタゾール併用群の出血時間に有意な差
VE-cadherin のタンパク量をウエスタンブロットによ
はなかった（図 1E）．
り測定した．シロスタゾールは，虚血による ZO-1，
Claudin-5 および VE-cadherin の発現の減少を抑制した
5．シロスタゾールの出血性梗塞抑制
メカニズムの検討
（図 2）．
つぎに，過剰な発現が脳損傷後の浮腫および出血に
関与すると考えられている matrix metalloproteinase
つぎに，シロスタゾールがワルファリンによる出血
（MMP）-2 および 9 についても検討を行ったが，ワル
を抑制したメカニズムの解明を目的に，BBB のバリ
ファリン単独投与群とシロスタゾール併用群の間に有
アー機能の一つである tight junction proteins
（TJPs）に着
意な差は認められなかった（図 3）．
─ 59 ─
脳循環代謝第 25 巻第 2 号
図 3．MMP-2 および 9 の発現量
ウェスタンブロッティングにより，MMP-2（A），MMP-9（B）の発現量を定量した．
Data are expressed as mean ± SEM (＊＊P < 0.01 vs. Sham; Student s t-test, n = 6 to 14)
CSZ：シロスタゾール
（文献 15 より引用）
以上，シロスタゾールがワルファリンによる出血性
ment and stroke prevention: the AnTicoagulation and Risk
梗塞を抑制した機序として，MMP-2 および 9 は関与
Factors in Atrial Fibrillation (ATRIA) Study. JAMA 285:
せず，虚血による TJPs および VE-cadherin の減少を抑
制したことが示唆された．すなわち，シロスタゾール
が MMP-2, 9 を介さず，直接 TJPs および VE-cadherin
を保護している可能性が示唆された．
2370–2375, 2001
2） Go AS: The epidemiology of atrial ﬁbrillation in elderly
persons: the tip of the iceberg. Am J Geriatr Cardiol 14:
56–61, 2005
3） Hart RG, Pearce LA, Aguilar MI: Meta-analysis: antithrombotic therapy to prevent stroke in patients who have
6．まとめ
nonvalvular atrial ﬁbrillation. Ann Intern Med 146: 857–
867, 2007
本研究では，マウスを用いたワルファリン誘発出血
4） Furie KL, Kasner SE, Adams RJ, Albers GW, Bush RL,
性梗塞に対して，シロスタゾールは脳浮腫および脳出
Fagan SC, Halperin JL, Johnston SC, Katzan I,
血を抑制し，生存期間を延長させた．さらに，シロス
Kernan WN, Mitchell PH, Ovbiagele B, Palesch YY,
タゾールは出血時間を延長させることなく，BBB 構成
Sacco RL, Schwamm LH, Wassertheil-Smoller S, Turan TN,
タンパク質を保護することを明らかにした．これらの
Wentworth D; American Heart Association Stroke Coun-
知見は，同様の効果がヒトにおいても認められた場
合，脳梗塞後急性期の患者，とくに抗凝固療法を受け
ている患者において，シロスタゾール投与は出血性リ
スクを軽減できることから，有益である可能性が示唆
された．今後，このワルファリンとシロスタゾールの
併用療法の有効性および安全性を確認するための適切
な臨床試験が行われることを期待したい．
cil, Council on Cardiovascular Nursing, Council on Clinical Cardiology, and Interdisciplinary Council on Quality
of Care and Outcomes Research: Guidelines for the prevention of stroke in patients with stroke or transient ischemic attack: a guideline for healthcare professionals from
the american heart association/american stroke association.
Stroke 42: 227–276, 2011
5） Connolly SJ, Ezekowitz MD, Yusuf S, Eikelboom J,
Oldgren J, Parekh A, Pogue J, Reilly PA, Themeles E,
Varrone J, Wang S, Alings M, Xavier D, Zhu J, Diaz R,
文　献
Lewis BS, Darius H, Diener HC, Joyner CD, Wallentin L;
1） Go AS, Hylek EM, Phillips KA, Chang Y, Henault LE,
RE-LY Steering Committee and Investigators: Dabigatran
Selby JV, Singer DE: Prevalence of diagnosed atrial ﬁbril-
versus warfarin in patients with atrial ﬁbrillation. N Engl J
lation in adults: national implications for rhythm manage─ 60 ─
ワルファリン誘発出血性梗塞に対するシロスタゾールの保護作用の検討
Med 361: 1139–1151, 2009
11） Pfeilschifter W, Spitzer D, Czech-Zechmeister B,
6） Patel MR, Mahaffey KW, Garg J, Pan G, Singer DE,
Steinmetz H, Foerch C: Increased risk of hemorrhagic
Hacke W, Breithardt G, Halperin JL, Hankey GJ, Piccini JP,
transformation in ischemic stroke occurring during warfa-
Becker RC, Nessel CC, Paolini JF, Berkowitz SD,
rin anticoagulation: an experimental study in mice. Stroke
Fox KA, Califf RM; ROCKET AF Investigators: Rivarox-
42: 1116–1121, 2011
aban versus warfarin in nonvalvular atrial ﬁbrillation. N
12） Ishiguro M, Mishiro K, Fujiwara Y, Chen H, Izuta H,
Engl J Med 365: 883–891, 2011
Tsuruma K, Shimazawa M, Yoshimura S, Satoh M,
7） Steiner T, Rosand J, Diringer M: Intracerebral hemorrhage
Iwama T, Hara H: Phosphodiesterase-III inhibitor prevents
associated with oral anticoagulant therapy: current prac-
hemorrhagic transformation induced by focal cerebral
tices and unresolved questions. Stroke 37: 256–262, 2006
ischemia in mice treated with tPA. PLoS ONE 5: e15178,
8） Paciaroni M, Agnelli G, Corea F, Ageno W, Alberti A,
2010
Lanari A, Caso V, Micheli S, Bertolani L, Venti M,
13） Ishiguro M, Suzuki Y, Mishiro K, Kakino M, Tsuruma K,
Palmerini F, Biagini S, Comi G, Previdi P, Silvestrelli G:
Shimazawa M, Yoshimura S, Iwama T, Hara H: Blockade
Early hemorrhagic transformation of brain infarction: rate,
of phosphodiesterase-III protects against oxygen-glucose
predictive factors, and influence on clinical outcome:
deprivation in endothelial cells by upregulation of VE-
results of a prospective multicenter study. Stroke 39:
2249–2256, 2008
cadherin. Curr Neurovasc Res 8: 86–94, 2011
14） Oyama N, Yagita Y, Kawamura M, Sugiyama Y, Terasaki Y,
9） Pfeilschifter W, Spitzer D, Czech-Zechmeister B,
Omura-Matsuoka E, Sasaki T, Kitagawa K: Cilostazol, not
Steinmetz H, Foerch C: Increased risk of hemorrhagic
aspirin, reduces ischemic brain injury via endothelial pro-
transformation in ischemic stroke occurring during warfa-
tection in spontaneously hypertensive rats. Stroke 42:
rin anticoagulation: an experimental study in mice. Stroke
2571–2577, 2011
42: 1116–1121, 2011
15） Kitashoji A, Egashira Y, Mishiro K, Suzuki Y, Ito H,
10） Nonaka Y, Tsuruma K, Shimazawa M, Yoshimura S,
Tsuruma K, Shimazawa M, Hara H: Cilostazol ameliorates
Iwama T, Hara H: Cilostazol protects against hemorrhagic
warfarin-induced hemorrhagic transformation after cere-
transformation in mice transient focal cerebral ischemia-
bral ischemia in mice. Stroke 44: 2862–2868, 2013
induced brain damage. Neurosci Lett 452: 156–161, 2009
Abstract
Effect of cilostazol for warfarin-induced hemorrhagic infarction in mice
Akira Kitashoji and Hideaki Hara
Molecular Pharmacology, Department of Biofunctional Evaluation, Gifu Pharmaceutical University,
Gifu, Japan
The establishment of the treatment for warfarin-induced hemorrhagic infarction is essential because
there is no effective treatment for hemorrhagic infarction at present and an exacerbation of hemorrhagic
infarction with warfarin is mortal. Cilostazol, an antiplatelet agent, have various protective effects,
including neuroprotective effect and protective effects on vascular endothelial cells, however it is careful
administration for warfarin treatment patients. In the present study, we found that cilostazol suppressed
the exacerbation of warfarin-induced hemorrhagic infarction by the enhancement of tight junction
proteins and VE-cadherin. Furthermore, we suggested that this combination treatment is available
clinically because this combination treatment was not extend bleeding time from the murine tail vein.
Key words:hemorrhagic infarction, anticoagulant, warfarin, cilostazol, tight junction
─ 61 ─

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