Waters Prep 150 LCシステムを用いたイチョウ（Ginkgo Biloba）葉中

Waters Prep 150 LC システムを用いた
イチョウ（Ginkgo Biloba）葉中からのフラボノイド単離
Andrew Aubin, Waters Corporation
Waters Corporation, Milford, MA, USA
アプリケーションのメリット
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はじめに
直観的な操作で、使いやすい高性能分取
イチョウ（Ginkgo biloba）葉は、数多くの疾患の治療に医薬用途で何千年も遡って
H P L C システム
長く用いられてきました 1。Ginkgo biloba 葉の抽出物には様々な活性成分が含まれ、
ChromScope™ ソフトウェアで全てのシステム
をトータルコントロール
特にフラボノイド、主として quercetin、kaempferol、isorhamnetin を多く含んで
います（図 1）。
!!
図 1. quercetin 、kaempferol 、isorhamnetin の化学構造
多くの場合、天然物精製の目的は、生物活性をもつと思われる各成分化合物の
単離です。スタンダードの調製やその他研究（臨床試験、バイオアッセイなど）
での使用など、様々な用途にこれら化合物は充分な量が単離されます。化合物の
単離はどれも、できるだけ高純度で、迅速かつ効率的に実施する必要があります。
天然物の抽出、単離、精製のための多くの技術がすでに報告されています 2。
分取逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC ）はこういった目的で広く使用
される分離技術です。本アプリケーションノートでは、 Waters ® Prep 150 LC
システム（図 2）を用いた Ginkgo biloba 葉粉末からのフラボノイド単離について
説明します。
ウォーターズのソリューション
Prep150 LC システム
ACQUITY UPLC® H-Class システム
ChromScope ソフトウェア Version 1.4
XBridge ® カラム
キーワード
分取 HP LC 、イチョウ（Ginkgo biloba）、
ChromScope、Prep 150LC 、XBridge
図 2. Waters Prep 150 LC システム
1
実験方法
分離
分取クロマトグラフィーの分離は下記ウォーター
ズ構成品からなる Prep 150 LC システム（図 2）を
用いて行いました。
ポンプ：
2545 バイナリーグラジエント
モジュール
検出器：
2489 UV/Vis 検出器（セミ分取
TaperSlit™ フローセル）
インジェクター：分取インジェクター
（5 mL ループ）
コレクター：
分析アイソクラティック条件
（分取スケールアップ用）
システム：
カラム温度：室温
流速：
1.4 mL/min
移動相 A：
0.2% ギ酸水溶液
移動相 B：
アセトニトリル
組成：
73％ A、27%B
検出：
UV@371 nm
フラクションコレクターⅢ
ソフトウェア： ChromScope Version 1.4
分析クロマトグラフィーの分離（分析法開発およ
カラム：
製品番号 186003115
付き ACQUITY UPLC H-Class システム（Empower ®
種類の最初の分析スケール分離（純度確認のた
めのグラジエント法と精製のためのアイソクラ
ティック法）は下記条件で開発しました。
分析グラジエント条件
（純度確認用）
XBridge BEH C 18 カラム
130 Å、5 µm、4.6 × 100 mm
び最終純度確認のため）は ACQUITY PDA 検出器
3 ソフトウェアコントロール）で行いました。2
ACQUITY UPLC H-Class
分取分離は分析メソッドから 19 × 100 mm
XBridge カラムへカラム容積に比例して移管
分取アイソクラティック条件
システム：
Prep 150 LC
カラム温度：室温
システム：
ACQUITY UPLC H-Class
カラム温度：
50 ℃
流速：
0.50 mL/min
移動相 A：
移動相 B：
流速：
24.8 mL/min
移動相 A：
0.2% ギ酸水溶液
0.2% ギ酸水溶液
移動相 B：
アセトニトリル
アセトニトリル
組成：
73％ A、27%B
検出：
UV@371 nm
カラム：
XBridge BEH C18 OBD™ 分取カラム
グラジエント： 85:15 -30:70 ; 0-13 min、
30:70 – 5:95 ; 13-15 min
検出：
UV@371 nm
カラム：
ACQUITY UPLC BEH C18 カラム
130 Å、5 µm、19 × 100 mm
製品番号 186002978
130 Å、1.7 µm、2.1 × 100 mm
製品番号 186002352
ウォーターズ Prep 150 LC システムを用いたイチョウ（Ginkgo Biloba）葉中からのフラボノイド単離
2
抽出
Ginkgo biloba 葉粉末（20 g）はメタノール 100 mL を加えて 60 分間超音波処理しました。3N 塩酸を 40 mL
添加した後、混合物を沸騰させ 90 分間還流させました。この還流操作によりフラボン配糖体を加水分解し、
各フラボンとしました。室温に冷却後、この抽出物を Whatman #1 濾紙でろ過してそのまま分析に供しました。
結果および考察
調製した抽出物のグラジエント UPLC ® 分析から、quercetin と kaempferol の濃度はそれぞれ 0.088 および
0.104 mg/mL であることが示され（isorhamnetin の定量用スタンダードは入手不可能でした）、UV（371 nm）
面積百分率による 3 化合物のおおよその純度は 11%、14 ％、5 ％でした（図 3）。前もって開発された分析
アイソクラティック HPLC メソッド（図 4 ）を、 C hromScope ソフトウェアに内蔵された分析→分取グラジ
エントカリキュレーター（弊社 Web 上でも利用可能）を用いて計算し、内径 19 mm カラムの分取分離に流速
をスケールアップしました（図 5）。分析→分取グラジエントカリキュレーターは、流速およびグラジエント
時間について分析から分取へのスケーリングの計算を行うことができる使いやすいツールです。分析メソッド
から分取への適切なスケーリングによって、分析スケールでの分析法開発が可能になり、分析法開発時の
サンプルおよび溶媒消費量を低減できます。スケールアップした分取クロマトグラフィーは分析クロマト
グラフィーと非常に類似しており、対象とするピークを分画する分取メソッド能力の信頼性を向上できます。
以前のアプリケーションノート 3 にこのスケーリング計算についてより詳細を説明しています。
0.25 mL 注入で、アイソクラティック分取分離メソッドと閾値ベースの分画メソッドにより許容可能な分取
Quercetin - 4.084
0.45
0.40
0.35
Kaempferol - 5.102
0.50
Isorhamnetin - 5.434
AU
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
0.00
2.00
4.00
6.00
8.00
10.00
12.00
14.00
16.00
Minutes
図 3. Ginkgo biloba 葉粉末抽出物の UPLC クロマトグラム
ウォーターズ Prep 150 LC システムを用いたイチョウ（Ginkgo Biloba）葉中からのフラボノイド単離
3
1.80
1.60
1.40
0.80
0.60
Kaempferol - 6.697
AU
Quercetin - 3.469
1.00
0.40
0.20
Isorhamnetin - 7.221
1.20
0.00
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
8.00
Minutes
図 4. Ginkgo biloba 葉粉末抽出物の分析スケール HPLC クロマトグラム
図 5. ウォーターズ C hromScope 分析→分取グラジエントカリキュレーター
ウォーターズ Prep 150 LC システムを用いたイチョウ（Ginkgo Biloba）葉中からのフラボノイド単離
4
分離を達成しました（図 6）。分画は、ChromScope ソフトウェアの閾値で容易に設定できます（図 7）。この
例では、2 つの分画ウィンドウを規定し（3.0-4.0 分および 6.0-7.5 分）、ウィンドウ外に溶出するピークは
どれも分画しません。分画されるには、ウィンドウ内に溶出するピークが閾値（このケースでは最初のウィ
ンドウでは 25 mAU、2 つ目のウィンドウでは 15 mAU）に達する必要があります。分画したフラクションの
純度分析の結果、3 化合物の UV 面積 % 純度は UPLC 分析の結果（データ記載無し）、それぞれ 87%、96%、
85% でした。
図 6. 3 つの分画ピークについて示した ChromScope 分取 HPLC クロマトグラム
図 7. ChromScope 分画メソッド
ウォーターズ Prep 150 LC システムを用いたイチョウ（Ginkgo Biloba）葉中からのフラボノイド単離
5
結論
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参考文献
Waters Prep 150 LC 分取 HPLC システムを用いて、Gingko biloba 葉
粉末から抽出した成分を単離・精製。
1. PDR for Herbal Medicines, 4th Ed., 2007, Thompson Healthcare Inc,
Montvale NJ, U.S.A.
Waters C hromScope ソフトウェア（Version 1.4）によるトータル
2. Natural Products Isolation 2nd edition, edited by S.D. Sarker, Z. Latif, A.I.,
2006 Humana Press Inc, Totowa, NJ, U.S.A.
システムソフトウェアコントロールは、全てのメソッドパラ
メーターを容易に変更できシステムの柔軟性を提供。
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3. “Analytical HPLC to Preparative HPLC: Scale Up Techniques using
a Natural Product Extract.” Andrew Aubin and Ronan Cleary.
Waters Application Note 720003120en, 2009
分析スケールで開発した分離を分析→分取グラジエントカリ
キュレーターにより Prep 150 LC システムを用いた 19 × 100 mm
分取カラムにカラム容積に比例してスケールアップ。
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容易な分画設定によりターゲット化合物の正確な分画が可能。
初期抽出物は 15% の quercetin と 18% の kaempferol を含有。
各成分は操作性の高いシステムで純度 87% 以上に精製。
日本ウォーターズ株式会社 www.waters.com
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大阪支社 ࠛ532-0011 大阪市淀川区西中島 5-14-10 サムティ新大阪フロントビル 11F TEL 06-6304-8888 FAX 06-6300-1734
ショールーム
東京大阪
テクニカルセンター東京大阪名古屋福岡札幌
Waters、ACQUITY UPLC 、UPLC 、Empower、XBridge および The Science of What ’s Possible は
Waters Corporation の登録商標です。ChromScope、TaperSlit および OBD は Waters Corporation の商標です。
その他すべての登録商標はそれぞれの所有者に帰属します。
©2014 Waters Corporation. Printed in Japan. 2014 年9月 720004839JA PDF

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