Kobe University Repository : Kernel

　Kobe
University Repository : Kernel
Title
蛋白キナーゼPDK1の心臓発達における生理的機能の解
析
Author(s)
古川, 健亮
Citation
神戸大学医学部紀要=Medical journal of Kobe University,
63(3/4): 17-24
Issue date
2003-03
Resource Type
Departmental Bulletin Paper / 紀要論文
Resource Version
publisher
URL
http://www.lib.kobe-u.ac.jp/handle_kernel/00317271
Create Date: 2015-02-01
1
7
蛋白キナーゼ PDKlの心臓発達における生理的機能の解析
古川健
神戸大学大学院医学系研究科応用分子医学講鹿
糖版病代謝・消化器・腎臓内科
連絡先:古川健見
神戸大学大学院医学系研究科応用分子医学講座
糖尿病代謝・消化器・腎臓内科
神戸市中央区楠町 7-5-1
:0
7
8
3
8
25
8
6
1 ファックス:0
7
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幽
(平成 1
5年 l月 6日受付)
約
〕
【
要
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路
叩
経路
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Cre心oxP システムを用いて筋肉特異的に 3.
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e 1(PDK1)遺伝
に Ca2+ /c
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tk
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子を欠損するマウス CMPDK1KO) を作成し， pho
路(引などの一定の役割が明らかとなりつつある。中
s
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y
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o
1
3k
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e(
P
I3K
) 依存性のシグ
こ傑位抑制型 PI3-K告発現させたト
でも心臓特異的 i
削
側
ナル伝達分子の活性化及び心臓の発背における PDK
ランスジスニックマウスで J心筋細胞のサイズの低下や
lの生盟的意義を解析した。 Mヂ DK1KOの骨格筋
心議最の減少が(1)また，逆に心臓特異的に慌常的
及び心臓における PDK1蛋白発現盤は対照の 20%程
I3-Kあるいは恒常的活性化型 Aktを発
活性化型 P
度に低下していた。 M PDK1KOの心臓では Aktの
したトランスジェニックマウスで，心筋細胞のサイ
幽
3
0
8位のリン酸化， Aktの活性化及び GSK3sのリ
ン酸化は著しく低下していた。 M♂ DKlKO心臓重
じることが報告されており
これらのシグナル伝連経路の心臓の生理的肥大におけ
る重要性は特に注目を集めている。
は対照より 26%減少しており，組織学的検討では
心筋細胞の萎縮と細胞間隙の増大を認めた。一方， M-
PDK1は蛋白リン酸化酵素であり. A
k
t
. p70S6
PDK1KOの骨格筋では Aktの 3
0
8位のリン酸化の
k
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.serumandg
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dk
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β のリン酸化は常に生
抑制は軽度であり， GSK3
といった. PI3-Kの下流で機能するエフェクター分
じた。 M-PDK1KOはメンデルの法則に基づき出生
子のリン般化，活性化に叢要な機能を果たすことが報
し，出生後の体損増加も対照と農はなかったが，すべ
されている(j札 I九実際 . PDK1遺伝子を欠失した
ての倒体が 8:i周齢までに死亡した。以上の結巣から，
1
活性幹細胞では，増殖凶;子子子
r
子依存性の上記のキナ一ゼの
PDK1はマウス個体において Aktの活性化に必須の
活性化が抑制される(12
分子であるとともに，心臓の正常な発速にも
マウスは，胎生 9
.
5日で死亡するため(凶)成熟個体に
能を果たすことが明らかとなった。
おける PDK1の生理的機能の解析は十分には進んで
へ
いなし 1。また. PDK1蛋白の発現監が正常の 20%以
【
緒
下に低下した遺伝子改変マウスでも. Aktの活性化
雷
】
は正常に生じることも報告されており(jぺ個体レベ
ルでの PI3 K依存性蛋白キナ…ゼの活性化における
心筋細胞は胎生期には分裂増殖を繰り返すが，生後
働
まもなく増殖能を喪失する。したがって，生後の心臓
PDK1の必要性についても不明な点が多い。そこで，
の臓器としての成長は，個々の心筋細胞の増大，すな
本研究では C
re
心oxpシステムを用いて筋肉特異的 P
わち生理的肥大に依存している。心臓の生理的肥大に
DK1欠損マウスを作成し，個体レベルでの各穂の情
関与する細胞内シグナルについては，様々な遺伝子改
報伝達分子活性化における PDK1の必要性そ検討す
変動物告用いた解析から， P
I3-K-Aktを介する経
るとともに， PDK1の心臓の発育における生躍的意
1 PI3 K
キーワード:心臓発達，遺伝子改変マウス. PDK，
削
(7
1)
1
8
Akt活性の測定においては，マウスを 1
6時間絶食後，
義安解析した。
ヒト連効型インスリン(マウス体重
法1
【
方
1k
gあたり 5
位)を腹腔内に投与し， 1
0分後に心臓及び、下肢骨格筋
0Cで保存した。摘
を摘出し液体議索中で凍結後一 8
0
出臓器から既報のごとく叩細胞可播化分画を調整し
筋肉特異的 P
OI
く1:欠損マウスの作成
遺伝子相同組換え法により PDK1遺伝子の第 3，
た後，イムノプロットに供した。抗 PDK1抗体はテ
oxP配列を挿入したマウス
第 4エクソンの両側に l
.Liu博士より供与を
キサス大学サンアントニオ校 F
(PDK1f
l
o
x
/
+
) を作成した。本マウス問士の交配に
け抗 Akt1抗体は U
pstateB
i
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c
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l
o
g
y社
oxP配列そ有する
より PDK1遺怯子両側アリルに l
8
3
0
8及び T
4
7
3
)，抗 G
より，抗 Aktリン酸化抗体 (
l
o
x
/
f
l
o
x
) を，また，本マウスと筋
マウス (PDK1f
8K3リン酸化的抗体的 9)，抗 ERK1/2抗体，抗
m
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肉クレアチンキナーゼ (
ERK1/2リン酸化抗体は C
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l8
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g社より，
MCK) プロモーターにより Creリコンビナーゼを筋
ransduction l
a
b
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s社より
抗 G8K3抗体は T
肉特異的に発現したトランスジェニックマウス
容化分画悲調
購入した。 Aktキナ…ゼ活性は細胞可 j
(MCKCre，ジョスリン糖尿病センター， C
.R
.Kahn
整した後，抗 Akt抗体(げ)で免疫沈降し，免疫沈降分
PDK1遺伝子片
博士より供与)(ω との交配により，
繭中のキナーゼ活性を既報のごとく
oxP配列を有し，かっ筋肉特異的に Cre
側アリルに l
(ω
合成ペプチド
として測定した。
リコンビナーゼを発現するマウス (PDK1f
l
o
x
/
+;
【結果】
MCKCr) 帝得た。 PDK1f
l
o
x
/+;MCKCrと PDK1
f
l
o
x
/
f
l
o
xとの交配にで得られた PDK1遺伝子両側ア
oxP配列を有し，かっ筋肉特異的に Creリコ
リルに l
PDK1f
l
o
x
/十と PDK1flox/+MCKCrとの交配に
l
o
x
/
f
l
o
x;
ンビナーゼを発現するマウス [PDK1f
l
o
x
/
f
l
o
xの骨格筋，心臓をは
より得られた PDK1f
MCKCr(M PDK1KO)] を，主に PDK1f
l
o
x
/
f
l
o
x
じめとした各種臓器における PDK1蛋白発現撃は P
告対照として実験に供した。
DK1+/+と比較して葉を認めなかった(データ示さ
イムノプロット及び Aktキナーゼ活性の測定
発現量に影響を与えないことが明らかとなった。心臓
剛
oxP配列の挿入は PDK1
ず)。このことから， l
非刺激状態の各種キナーゼのリン酸化の検討におい
における PDK1蛋自の発現景は M-PDK1KOでは
ては，随時摂食下のマウスを屠殺後，直ちに心臓を摘
対照に比し 20%以下に低下しており，骨格筋におい
出し，液体墾索中で凍結し
0
8
0Cで保存した。ま
た，インスリン依存性の各種キナーゼのリン般化及び
ても間程度の低下がみられたが，他の臓器においては
両群聞で差を認めなかった(岡 1A)口
B
A
IB:ant
トPDKl
M PDK1KO
酬
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Age (
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)
spleen
pancreas
閣1.筋肉特異的 PDI
く1欠損マウス (
MPDIく1I
く0
) における各種臓器での PDIく1の発現量と生祥事
A :4週齢の各遺伝子型マウスの心臓，骨格筋，肝臓，事丸周囲脂肪組織，肺，脳，牌臓，牌臓より可溶性
分闘を調整しイムノプロット解析に供した。各濃伝子型それぞれ 3個体について検討し代表的 l個体
の結果を示した。
1
20
日:筋肉特異的 PDK1欠損マウスの生帯率。 n=8幽
(7
2
)
1
9
PDK1f
l
o
x
/+;MCKCrと PDK1f
l
o
x
/
f
l
o
xとの
4i
腸齢における M-PDK1KO心臓の組織学的検討
交配からは予想されるすべての遺伝子型のマウスが出
では，心筋細胞の萎縮と細胞間隙の増大を認めたが，
生し， M-PDK1KOをはじめ，すべての遺伝子型マ
細胞の配列異常や壊死は認めず，冠動脈や支配神経に
ウスの出生率はメンデルの法則に従った (PDK1f
l
o
x
も形態学的異常はなかった(図 2)。また，マッソン
/
f
l
o
x;MCKCr:PDK1f
l
o
x
/
+;MCKCr:PDK1
f
l
o
x
/
f
l
o
x:PDK1f
l
o
x
/
+ 5
0
:
4
8
:
4
6
:
5
6
)
ο
M
P
D
K
1KOは 4潤齢から死亡する個体が出現し， 8週齢ま
トリクローム染色にて線維染色を行ったが， M PDK
の結果から， M-PDK1KOにおける心臓麓農の低下
でに検討したすべてのマウスが死亡した。一方，他の
は心筋細胞自身の萎縮性変化によることが示唆された白
遺伝子型では 8週までに死亡するマウスを認めなかっ
M PDK1KOの骨格筋には組織学的異常所見
剛
lKO心臓には線維組織の増成は認めなかった。以上
酬
)
o 4週齢における M♂DKIKOの体重は
た(図 1B
を認めなかった(データ示さず)。
PDK1f
l
o
x
/
f
l
o
xとの翠はなかったが，心臓3
重量は雄
で2
6.
4
%，雌で 25.2%の減少を認めた(表1)。
活性化されることが知られている
Aktは PDK1によりその 3
0
8位がリン酸化され，
表1. 4澗齢の筋肉特異的 P
O
t
く1
欠損マウス (MPO
Kl
I
く0) 及び f
l
o
x
j
f
l
o
xの体重と心重量
剛
M
a
l
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F
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l
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o
x
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M
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D
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.
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.
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.
0
8
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=
1
0
.
した。
統計学的解析には t
検定を用いた。
*
p<0
.
0
01
Cv
ssames
e
xo
fM♂ DKIKO)
(ω
。心臓における
Aktの議自発現議は M-PDK1KO，PDK1f
l
o
x
/
f
l
o
x聞で差はなかったが，非刺激状態での Akt3
0
8位の
リン酸化は M-PDK1KOにおいて著明に低下してい
たο また， A
ktの蹟接の慕質である GSK3β(
凶
〉
の
リン般化も M-PDK1KOでは低下していた。一方，
PDK1非依存性にリン酸化が生じることが知られて
いる A
ktの 4
7
3位のリン酸化は， M-PDK1KOの心
臓において PDK1f
l
o
x
/
f
l
o
xに比して冗進していた
(
図3
。
)
次に，J心臓における増殖悶子依存性の各種情報伝達
分子の活性化を検討した。インスリン依存性の A
kt
の3
0
8位のリン酸化は M-PDK1KOの心臓では著明
H&E
T
r
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c
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M PDKIKO
帽
日o
x
/
日ox
図2
. 4週齢の筋肉特典的 p
o
t
く1
欠損マウス (
M-POK1
1
く0
) 及び f
l
o
x
/
f
l
o
xの心臓組織像
上段 h
e
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o
x
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n(H&日)染甑，下段 M
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)染色。スケールパー =10μmo
(
7
3)
2
0
f
l
o
x
/
f
l
o
x
認めた。 GSK3sインスリン依存性のリン酸化も
M~PDKIKO
しく低下していた。(悶 4A)。インスリン依存性の
4一
一 Akt
I
B
:
a
n
t
i
p
A
k
t
(
S
4
7
3
)
Aktの活性化も M-PDK1KOの心臓では著明に抑制
)0一方， e
x
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g
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l
されていた(図 4B
r
e
g
u
l
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e
dk
i
n
a
s
e(
日RK) 1/2については， PDK
1f
l
o
x
/
f
l
o
xではインスリン依存性のリン酸化を認め
たが， M-PDK1KOではインスリン刺激前から ERK
1/2のリン酸化の冗進を認め，インスリン刺激によっ
てさらなるリン酸化の増強は見られなかった(図 4C
)。
以上のことから， PDK1シグナルの低下により，何
らかの代償機転が働き日RK1/2が活性化する可能
性が示唆された。
M-PDK1KO骨格筋においては，インスリン依存
性の A
ktの 3
0
8位のリン酸化の抑制は軽微であり，
インスリン依存性 GSK3のリン般化の抑制は見られ
なかった。 A
kt4
7
3位のリン酸化にはインスリン刺激
前，刺激後ともに M-PDK1KOと PDK1f
l
o
x
/f
l
o
x
は無かった(図 5
。
)
に抑制されており， 4
7
3位のリン酸化は軽度の冗進を
A
+
x一
'
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'
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伽一+
伽
一
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GSK3s
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bp羽持
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M-PDKIKO
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= 二士主主j
ヰE
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E
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2j
+
f
l
o
x
l
f
l
o
x
+
M平 DKIKO
図4
. 筋肉特異的 P
D
I
く1欠損マウス (
M・PDI
く1I
く0
) の心臓におけるインスリン依存性の A
k
t，G
S
I
く3
β のリン
酸化 (
A
)，A
k
t活性(日)及び E
r
kリン酸化 (
C
)
A .4週齢の M♂DKIKO及び対日明、マウス (
f
l
o
x
/f
l
o
x
)を 1
6時間絶食後，インスリン(+)または
生理的食塩水(一)を腹腔内に投与 1
0分後に心臓を摘出し，細胞可溶化分闘を調整し，各抗体を用
いてイムノブロットに供した。
B:同様の方法で調整した細胞可博化分闘の Akt活性を測定した。各群とも n=3
0 C:同様の検体を
日比 1/2リン酸化抗体でイムノブロットした。
(7
4
)
2
1
f
l
o
x
/
t
l
o
x
I
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i
n
: 一一+ +
M♂DKIKO
+
が深まることが期待される o
ト
ベ
M PDK1KO骨格筋と心臓における PDK1
I
B
:
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A
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(
S
4
7
3
)
Akt
l
B:
a
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I
p
A
k
t
(
T
3
0
8
)
Akt
の低下は間程度であったにも関わらず，骨格筋での
A
k
t
l
Akt3
0
8位リン酸化の抑制は軽微であり， GSK3
β
のリン酸化の低下は認めなかった。 PDK1を完全に
ktの活
欠損した肱性幹細胞では増殖因子依存性の A
性化は完全に阻害されるが(12) PDK1遺伝子のイン
l
B:
a
n
t
i
A
k
t
l
l
B
:
a
n
t
I“pGSK3β(S9)
叩
GSK3{
3
l
B
:
a
n
t
i
G
S
K
3
β
GSK3β
図5
. 筋肉特異的 P
D
I
く1欠損マウス (
MPDK1
1
く0
)
の骨格筋におけるインスリン依梓性 A
k
t及び
G
S
I
く3sのリン酸化
4週齢の M♂ DK1KO及び対照マウス
C
f
lox/f
l
o
x
)を 1
6時間絶食後，インスリン
(+)または生理的食塩水(一)を腹腔内に
し
， 1
0分後に下肢骨格筋を摘出して細
胞可溶化分闘を調整し，イムノブロットに
供した。
幽
【
考
察
】
トロン中にネオマイシン耐性遺伝子を挿入することに
より PDK1発現最告正常の 20%以下に低下させたマ
ktの活性化
ウスの個体では，インスリン依存性の A
は正常に生じることが報告されている
これは，
(
1
3
)
PDK1は Aktの活性化にとって必須の機能を果たす
ものの，細胞内では PDK1は十分に過盤に存在して
おり，発現最が 20%以下に低下しでも正常なシグナ
ルを伝達し得るからかも知れない。
以下に低下し，また，非刺激状態，及びインスリン刺
M PDK1KOの心臓の PDK1蛋白発現麗は対照の
20%程度であったが， C印刷 l
o
x
Pシステムの作用発現
機構から考えると，個々の心筋細胞での PDK1
は1
00% (遺伝子未切断)， 50% (片側アリル
のみ切断)もしくは 0% (両側アリルとも切断)と惟
0%程度の PDK1議自の残存によ
されるもし， 2
kt3
0
8位のリン酸化ならびにイン
激状態における A
り下流へのシグナルが完全に伝達されるとすれば，理
ktの活性化は著明に抑制されてい
スリン依存性の A
論上個々の心、筋細胞での PDK1シグナルの抑制の程
ktの基質の一つである GSK3s リン酸
た。また， A
， 0%
， 1
00%となる。
度は，各々の細胞で 0%
化も低下していた。以上の結果から， PDK1は個体
骨格筋は多核の融合細胞であり，一個の核中の PDK
kt-GSK3
β 経路の活性化 l
こ必須の
レベルでも， A
l遺伝子が完全に切断されたとしても，他の核中に未
剛
本研究では J心臓の生理的発宵における PDK1の機
r
eLoxPシステムを用いて筋肉
能を検討するために C
削
特異的 PDK1欠損マウスの作成長試みた。 M PDK
助
1KOの心臓における PDK1発現量は対照群の 20%
O
切断の PDK1遺伝子が残序すれば，細胞全体の PDK
分子であることが明らかとなった。
l資自発現最は 0%とはならず，下流へのシグナル
M PDK1KOの心議最は対照と比較して 26%の減
削
を伝達しうる可能性がある O 心臓と間程度の PDK1
少告認めた。また，心筋細胞の萎縮とそれに伴う細胞
自量の低下にもかかわらず， M♂ DKIKOの骨格
間隙の増大を認め，本マウスの心震震の低下は心筋の
生理的肥大が抑制された結果と考えられた。慣常的活
筋で A
kt活性抑制が軽微であったのは，
I
3Kを心臓特異的に発現させたトランスジェ
性化型 P
細胞構造の違いに起因するのかもしれない。
幽
このような
M PDK1KOは検討したすべての個体が 8週齢ま
ニックマウスでは心筋細胞の肥大と心意最の増加が，
削
また逆に優位抑制型 PIιKのトランスジェニックマ
でに死亡した。 M PDK1KOでは骨格筋におけるシ
ウスでは心筋細胞の萎縮と心意最の低下が生じること
グナル{ぷ壊の阻害が戟微で、あったことから，その早期
されている
(1)
伊
このような既報の知見及び本
の死亡は心臓の機能不全に起因することが強く示唆さ
I3K
P
研究から得られた知見を考えあわせると， P
れる。一方，程度差はあるが同様に心重量の低下を景
DK1経路が心筋細胞の生開的肥大に重要な機能を果
I3-Kトランスジェニッ
する心臓特異的優位抑制型 P
たすのは明らかである O
クマウスや心臓特異的インスリン受容体欠損マウスで
PDK1の下流でどのようなエフェクタ一分子が個
は早期の死亡が生じないことから考えると
(
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)
PD
ランスジェニックマウスでは心筋細胞の肥大と
こも，心臓において重要な機能
Klは生理的肥大以外 l
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者担うことが示唆される実際， C
I3Kのシグナルは心臓
の最近の報告 (5) によると， P
kt依存性のシグナ
の増加が生じることからは吋)， A
の生理的肥大のみならず，収縮力の獲得に
体レベルでの心筋細胞の生理的肥大を制御するかは明
ktの心臓特異的ト
らかではない。恒常的活性化型 A
O
ルが重要なのかも知れない。今後 M-PDK1KO告始
るらしい。今後， M♂DKIKOに生服機能的解析や
めとした各種遺伝子改変動物の更なる解析を通じて，
電気生理学的解析などを加えることより，心臓の正常
個体レベルで、の心筋細胞の肥大のメカニズムへの理解
な機能の発現における PDK1の新規な役割が明らか
(7
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となるかもしれない。
叩
【
謝
静
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Sandra， A.W.， Thomas， R
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本研究にあたり， MCKC
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く感謝します。また，ご指導を賜り
附
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ました神戸大学大学院応用分子医学講膝，糖尿病代謝・
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消化器・腎臓内科春日雅人教授に暦くお礼申し上げま
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