博士学位論文
質量分析法を用いるホルモンドーピング検査法に関する研究
岡野雅人
東京薬科大学
目次
緒 論 ............................................................................................................................... 1
日 本 人 に お け る テ ス ト ス テ ロ ン ド ー ピ ン グ 検 査 の 妥 当 性 検 証 と 改 良 ........... 7
第１章
1.1
序 論 ................................................................................................................... 7
1.2
実 験 の 部 ........................................................................................................... 10
1.2.1
試 薬 お よ び 材 料 ............................................................................................. 10
1.2.2
GC–MS に よ る 尿 中 の steroid profile の 分 析 .................................................. 11
1.2.3
GC–IRMS に よ る 尿 中 ス テ ロ イ ド の 炭 素 同 位 体 比 測 定 ................................. 12
1.2.4
UGT2B17 遺 伝 子 解 析 ..................................................................................... 13
1.2.5
統 計 解 析 ........................................................................................................ 14
1.2.6
ヒ ト 試 料 ........................................................................................................ 14
1.2.6.1
日 本 人 競 技 者 .............................................................................................. 15
1.2.6.2
Testosterone enanthate の 女 性 へ の 単 回 筋 肉 内 投 与 試 験 .............................. 15
1.3
結 果 お よ び 考 察 ................................................................................................ 15
1.3.1
UGT2B17 遺 伝 子 解 析 ..................................................................................... 15
1.3.2
Testosterone 関 連 代 謝 物 の 尿 中 プ ロ フ ァ イ ル ................................................ 18
1.3.3
Testosterone enanthate の 女 性 へ の 単 回 筋 肉 内 投 与 試 験 ................................. 25
1.3.3.1
Testosterone 関 連 代 謝 物 の 尿 中 プ ロ フ ァ イ ル ............................................. 25
1.3.3.2
Testosterone 関 連 代 謝 物 の 炭 素 同 位 体 比 ..................................................... 32
1.4
小 括 .................................................................................................................. 39
成 長 ホ ル モ ン 分 泌 刺 激 製 剤 GHRP-2 の UPLC–MS/MS を 用 い た ド ー ピ ン グ 検
第２章
査 法 の 開 発 ................................................................................................................... 40
2.1
序 論 .................................................................................................................. 40
2.2
実 験 の 部 ........................................................................................................... 42
2.2.1
試 薬 お よ び 材 料 ............................................................................................. 42
2.2.2
Calibrator の 調 製 ............................................................................................ 43
2.2.3
ヒ ト 尿 試 料 の 前 処 理 方 法 ............................................................................... 43
2.2.4
精 密 質 量 分 析 ................................................................................................. 43
2.2.5
UPLC–MS/MS ................................................................................................ 43
2.2.6
UPLC–MS/MS 法 の メ ソ ッ ド バ リ デ ー シ ョ ン ................................................ 45
2.2.6.1
妨 害 物 質 の 確 認 .......................................................................................... 45
2.2.6.2
直 線 性 ......................................................................................................... 45
2.2.6.3
回 収 率 ......................................................................................................... 45
2.2.6.4
検 出 下 限 ..................................................................................................... 45
2.2.6.5
日 内 再 現 性 お よ び 日 間 再 現 性 ..................................................................... 45
2.2.6.6
イ オ ン サ プ レ ッ シ ョ ン ............................................................................... 46
2.2.6.7
キ ャ リ ー オ ー バ ー ....................................................................................... 46
2.2.7
GH isoform differential immunoassay に よ る 血 清 中 GH 同 族 体 の 測 定 ......... 46
2.2.8
ヒ ト 試 料 ........................................................................................................ 47
2.2.8.1
日 本 人 健 常 男 性 （ 非 競 技 者 ） ..................................................................... 47
2.2.8.2
rhGH の 単 回 皮 下 投 与 試 験 .......................................................................... 47
2.2.8.3
GHRP-2 の 単 回 静 脈 内 投 与 試 験 .................................................................. 47
2.2.8.4
rhGH と GHRP-2 の 併 用 投 与 試 験 ............................................................... 47
2.2.9
2.3
統 計 解 析 ........................................................................................................ 48
結 果 お よ び 考 察 ................................................................................................ 48
2.3.1
GH isoform differential immunoassay に よ る 血 清 中 GH 同 族 体 の 測 定 ........... 48
2.3.2
GHRP-2 お よ び そ の 代 謝 物 の UPLC–MS/MS に よ る 分 析 法 の 開 発 ................ 55
2.3.3
尿 中 GHRP-2 と そ の 代 謝 物 の 同 定 ................................................................ 63
2.3.4
UPLC–MS/MS に よ る 尿 中 GHRP-2 と そ の 代 謝 物 AA-3 の 定 量 ................... 64
2.4
小 括 .................................................................................................................. 67
第 ３ 章 エ リ ス ロ ポ エ チ ン 製 剤 ダ ル ベ ポ エ チ ン ア ル フ ァ の UPLC–MS/MS を 用 い た ド ー
ピ ン グ 検 査 法 の 開 発 .................................................................................................... 68
3.1
序 論 .................................................................................................................. 68
3.2
実 験 の 部 ........................................................................................................... 69
3.2.1
試 薬 お よ び 材 料 ............................................................................................. 69
3.2.2
Immunopurification ......................................................................................... 70
3.2.3
V8-プ ロ テ ア ー ゼ に よ る 消 化 ......................................................................... 71
3.2.4
TOF–MS に よ る ペ プ チ ド マ ッ ピ ン グ ............................................................. 71
3.2.5
UPLC−MS/MS ................................................................................................ 71
3.2.6
デ ー タ ベ ー ス 検 索 ......................................................................................... 72
3.2.7
UPLC–MS/MS 法 の メ ソ ッ ド バ リ デ ー シ ョ ン ................................................ 72
3.2.7.1
妨 害 物 質 の 確 認 .......................................................................................... 72
3.2.7.2
直 線 性 ......................................................................................................... 72
3.2.7.3
回 収 率 ......................................................................................................... 73
3.2.7.4
検 出 下 限 ..................................................................................................... 73
3.2.7.5
日 内 再 現 性 お よ び 日 間 再 現 性 ..................................................................... 73
3.2.7.6
イ オ ン サ プ レ ッ シ ョ ン ............................................................................... 73
3.2.7.7
定 性 分 析 ..................................................................................................... 74
3.2.7.8
キ ャ リ ー オ ー バ ー ....................................................................................... 74
3.2.8
Darbepoetin alfa の 単 回 静 脈 内 投 与 試 験 ......................................................... 74
3.2.9
IEF–PAGE、 ダ ブ ル ブ ロ ッ テ ィ ン グ お よ び 化 学 発 光 検 出 .............................. 74
3.3
3.3.1
結 果 お よ び 考 察 ................................................................................................ 75
ペ プ チ ド 分 析 対 象 ペ プ チ ド の 決 定 ................................................................ 75
3.3.2
デ ー タ ベ ー ス 検 索 ......................................................................................... 80
3.3.3
Darbepoetin alfa の UPLC–MS/MS に よ る 分 析 法 の 開 発 ................................. 80
3.3.4
尿 中 Darbepoetin alfa の 分 析 .......................................................................... 86
3.4
小 括 .................................................................................................................. 89
総 括 .............................................................................................................................. 90
謝 辞 .............................................................................................................................. 93
研 究 結 果 の 掲 載 誌 ........................................................................................................ 94
引 用 文 献 ....................................................................................................................... 95
略語
ア ミ ノ 酸 の 表 記 は 、 International Union of Pure and Applied Chemistry and International
Union of Biochemistry and Molecular Biology - IUPAC-IUB Joint Commission on
Biochemical Nomenclature（ JCBN） の 提 唱 し た １ 文 字 も し く は ３ 文 字 記 号 を 使 用 し た 。
AAF
: Adverse analytical finding
ABP
: Athlete biological passport
BMI
: Body mass index
CE
: Collision energy
CID
: Collision-induced dissociation
CIR
: Carbon isotope ratio
CV
: Cone voltage
EI
: Electron ionization
EPO
: Erythropoietin
ESI
: Electrospray ionization
GC–IRMS
: Gas chromatography isotope ratio mass spectrometry
GC–MS
: Gas chromatography mass spectrometry
GH
: Growth hormone
GHRH
: Growth hormone releasing hormone
GHRP
: Growth hormone releasing peptide
GHS
: Growth hormone secretagogue
HPLC
: High performance liquid chromatography
IEF–PAGE
: Isoelectric focusing–polyacrylamide gel electrophoresis
IGF-1
: Insulin-like growth factor-1
I.S.
: Internal standard
LC–MS
: Liquid chromatography mass spectrometry
LOD
: Limit-of-detection
LOQ
: Limit-of-quantification
MRM
: Multiple reaction monitoring
MS/MS
: Tandem mass spectrometry
MW
: Molecular weight
PBS
: Phosphate buffered saline
PCR
: Polymerase chain reaction
rEPO
: Recombinant erythropoietin
rhGH
: Recombinant human growth hormone
SDS–PAGE
: Sodium dodecyl sulphate–polyacrylamide gel electrophoresis
SIM
: Selected ion monitoring
T/E
: Testosterone to Epitestosterone ratio
TFA
: Trifluoroacetic acid
TOF–MS
: Time-of-flight mass spectrometry
tR
: Retention time
UGT
: Uridine diphospho-glucuronosyltransferase
UPLC
: Ultra performance liquid chromatography
WADA
: World Anti-Doping Agency
緒論
人類の歴史が始まって以来、薬物は疾病の治療、診断、予防、健康の維持に使用さ
れ、人類の健康に大きく貢献している。一方で、ストレスからの解放のようなレクリ
エーション目的での薬物乱用は、大麻・覚せい剤等に代表されるように世界的な広が
りを見せ、一般社会においても深刻な問題となっている。さらに、スポーツにおける
競 技 力 向 上 を 意 図 し た 競 技 者 に よ る 薬 物 不 正 使 用 、い わ ゆ る ド ー ピ ン グ（ Doping）は 、
勝利至上主義、名誉、金銭的な報酬などと相まって、近年では、トップアスリートに
まで広がりを見せている。ドーピング問題は一般青少年への拡大も懸念されるなど、
今やパブリックヘルスにおける大きな社会問題の一つとなっている。ドーピングは、
オリンピック精神の真髄でもある倫理観やフェアプレーといったスポーツ精神に根本
的に反するものである
1)
。
ド ー プ（ Dope）と い う 言 葉 の 語 源 は 、ア フ リ カ 東 南 部 の 原 住 民 カ フ ィ ー ル 族 が 祭 礼
の 際 に 飲 む 強 い 酒 で あ る 。Dope と い う 単 語 が 初 め て 辞 書 に 載 っ た の は 1889 年 で あ る 。
競走馬に与えられるアヘンと麻薬の混合物と記載されているように、ドーピングは、
当 初 は 、競 走 馬 や 競 争 犬 に 対 す る 薬 物 使 用 で あ っ た 。19 世 紀 後 半 に な る と ド ー ピ ン グ
は人間におけるスポーツ界にも広まった
2)
。1865 年 の ア ム ス テ ル ダ ム 運 河 に お け る 水
泳 競 技 者 の 薬 物 使 用 が 競 技 ス ポ ー ツ に お け る 最 初 と さ れ て い る 。1879 年 の 自 転 車 競 技
で は 、カ フ ェ イ ン や ニ ト ロ グ リ セ リ ン が 使 用 さ れ た 。そ の 後 、1886 年 の 自 転 車 競 技 で
は、ドーピングにより競技中に競技者が死亡する事故が発生した。このような事態を
憂 慮 し た 医 師 た ち が 、医 学 的 、道 徳 的 立 場 か ら ド ー ピ ン グ 反 対 の 声 明 を 1933 年 に 出 す
に 至 っ た 。1965 年 に は 、フ ラ ン ス 、ベ ル ギ ー 、イ タ リ ア な ど 欧 州 諸 国 で ド ー ピ ン グ 防
止法が整備され、スポーツにおけるドーピング検査の必要性が高まった。ドーピング
を 防 止 す る 活 動 は 、 ア ン チ ・ ド ー ピ ン グ 活 動 （ Anti-doping Movement） と 呼 ば れ 、 そ
の目標は、スポーツ固有の価値を保護することである。ここ十数年のアンチ・ドーピ
ン グ 活 動 の 変 遷 を Table 1 に 示 し た 。
Table 1. Recent anti-doping activities
Year
Event
1999
World Anti-Doping Agency (WADA) founded
2001
Japan Anti-Doping Agency (JADA) founded
2003
World Anti-Doping Code (WADC) issued
2005
The International Convention against Doping in Sport adopted by the UNESCO
2006
Japanese government ratified the UNESCO International Convention
2009
Sports pharmacist system implemented by JADA
2011
Basic Sport Law came into effect
1
20 世 紀 ま で は 、 競 技 団 体 や 国 に よ り ド ー ピ ン グ 対 策 や ル ー ル が 異 な っ て い た が 、
1999 年 に 、国 際 レ ベ ル の あ ら ゆ る ス ポ ー ツ に お け る ア ン チ・ド ー ピ ン グ 活 動 を 促 進 し 、
調 整 す る こ と を 目 的 と し て 、世 界 ア ン チ・ド ー ピ ン グ 機 構（ World Anti-Doping Agency:
WADA）が 設 立 さ れ た 。2001 年 に は 、日 本 ア ン チ・ド ー ピ ン グ 機 構（ Japan Anti-Doping
Agency: JADA）が 設 立 さ れ 、日 本 国 内 の ア ン チ ・ ド ー ピ ン グ 体 制 が 整 備 さ れ た 。2003
年 に 、世 界 ア ン チ・ド ー ピ ン グ 規 程（ World Anti-Doping Code: WADC）が 制 定 さ れ
1)
、
ドーピング防止に関する世界統一の規程の下、調和したアンチ・ドーピング活動が開
始 さ れ る に 至 っ た 。 さ ら に 、 2005 年 に 、 第 33 回 国 際 連 合 教 育 科 学 文 化 機 関 （ ユ ネ ス
コ ）総 会 に お い て 、
「 ス ポ ー ツ に お け る ド ー ピ ン グ 防 止 に 関 す る 国 際 規 約 」が 採 択 さ れ 、
ア ン チ・ド ー ピ ン グ 活 動 は 各 国 政 府 の 責 務 と さ れ た 。2006 年 に は 、日 本 国 政 府 も 同 規
約 を 締 結 し た 。2011 年 に 、ス ポ ー ツ 基 本 法 が 制 定 さ れ 、そ の 中 で 、ス ポ ー ツ は 世 界 共
通の人類の文化であると位置づけられ、ドーピング検査、アンチ・ドーピングに関す
る教育および啓発、その他のアンチ・ドーピング活動の実施に係る施策の推進は、国
の責務であることが明記されるに至った。
競技者の尿試料もしくは血液試料からのドーピング禁止物質の検出、いわゆるドー
ピング検査における検体分析は、アンチ・ドーピング活動の中で重要な位置を占めて
い る 。オ リ ン ピ ッ ク に お い て は 、1968 年 の グ ル ノ ー ブ ル 大 会 か ら ド ー ピ ン グ 防 止 規 則
が適用され、ドーピング検査が開始された。当時の禁止物質は、アンフェタミンやス
トリキニーネといった興奮剤、モルヒネなどの麻薬、ジエチルエーテルなどであった
が 、 2014 年 に は 、 約 300 種 類 以 上 の 禁 止 物 質 が 指 定 さ れ て い る （ Table 2） 3) 。 WADC
で は 、 禁 止 物 質 は 、 1)競 技 力 向 上 、 2)健 康 上 の 危 険 性 、 3)ス ポ ー ツ 精 神 に 反 す る 、 と
いう 3 つの要件のうち 2 つを満たすと判断された場合に収載され、リストは毎年更新
されている。
2
Table 2. 2014 WADA prohibited list（ extract） 3)
Prohibited substances
Substances prohibited at all times
S0. Non-Approved Substances
S1. Anabolic Agents
1. Anabolic Androgenic Steroids (AAS)
a. Exogenous AAS
b. Endogenous AAS when administered exogenously
2. Other Anabolic Agents
S2. Peptide Hormones, Growth Factors and Related Substances
Chorionic Gonadotrophin (CG) and Luteinizing Hormone (LH) and their releasing
factors, in males
Corticotrophins and their releasing factors
Growth Hormone (GH) and its releasing factors and Insulin-like Growth Factor-1
(IGF-1)
Growth factors
S3. Beta-2 Agonists
S4. Hormone and Metabolic Modulators
1. Aromatase inhibitors
2. Selective estrogen receptor modulators (SERMs)
3. Other anti-estrogenic substances
4. Agents modifying myostatin function
5. Metabolic modulators
Insulins
Peroxisome Proliferator Activated Receptor δ (PPARδ) agonists (e.g. GW 1516),
PPARδ-AMP-activated protein kinase (AMPK) axis agonists (e.g. AICAR)
S5. Diuretics and Other Masking Agents
Substances prohibited in-competition
S6. Stimulants
a: Non-Specified Stimulants
b: Specified Stimulants
S7. Narcotics
S8. Cannabinoids
S9. Glucocortisteroids
Substances Prohibited In Particular Sports
P1. Alcohol
P2. Beta-Blockers
Prohibited methods
M1. Manipulation of Blood and Blood Components
1. The administration or reintroduction of any quantity of autologous, allogenic
(homologous) or heterologous blood or red blood cell products of any origin into
the circulatory system.
2. Artificially enhancing the uptake, transport or delivery of oxygen, including, but
not limited to, perfluorochemicals, efaproxiral (RSR13) and modified
haemoglobin products (e.g. haemoglobin-based blood substitutes,
microencapsulated haemoglobin products), excluding supplemental oxygen.
3. Any form of intravascular manipulation of the blood or blood components by
physical or chemical means.
M2. Chemical and Physical Manipulation
1. Tampering, or attempting to tamper, in order to alter the integrity and validity
of Samples collected during Doping Control. These include but are not limited to
urine substitution and/or adulteration (e.g. proteases).
2. Intravenous infusions and/or injections of more than 50 mL per 6 hour period
except for those legitimately received in the course of hospital admissions or
clinical investigations.
M3. Gene Doping
1. The transfer of polymers of nucleic acids or nucleic acid analogues
2. The use of normal or genetically modified cells.
3
禁 止 物 質 の 分 析 は 、世 界 32 箇 所（ 2014 年 1 月 現 在 ）の WADA 認 定 試 験 所 で の み 実
施 さ れ る 。日 本 国 内 に お い て は 、著 者 の 所 属 す る 三 菱 化 学 メ デ ィ エ ン ス 株 式 会 社（ 2014
年 4 月 よ り 株 式 会 社 LSI メ デ ィ エ ン ス に 社 名 変 更 , WADA Tokyo laboratory） が 唯 一 の
WADA 認 定 試 験 所 で あ り 、1985 年 以 来 、国 内 外 の ド ー ピ ン グ 検 査 に お け る 検 体 分 析 を
担 っ て い る 。 Figure 1 に は 、 WADA Tokyo laboratory で 実 施 し て い る ド ー ピ ン グ 検 査 に
おける検体分析法を示した
4)
。ドーピング検査においては、最も信頼性の高い分析法
として質量分析を用いているが、質量分析法が確立されていないタンパク質・ペプチ
ドホルモン類に関しては、イムノアッセイなどを用いている。
Urine
solid phase extraction
Blood
immunoaffinity
digestion
hydrolysis
digestion
liquid-liquid extraction
HPLC
purification
derivatization
derivatization
GC-IRMS
GC-MS/MS
LC-MS/MS
stimulants, narcotics
ELISA, IEF-PAGE, SDS-PAGE
EPO, hCG, LH
Insulin
anabolic, diuretics
LC-MS/MS
O2 carrier
Flowcyotmetry
Blood parameters
GH
testosterone
beta-blockers
corticosteroids
Figure 1. Analytical procedure for sports doping test 4 ) .
2008 年 か ら 2012 年 の WADA の 統 計
5)
によると、ドーピング検査における検出物質
の 50.6− 64.9%は 、 タ ン パ ク 同 化 ス テ ロ イ ド ホ ル モ ン で あ り 、 筋 肉 増 強 効 果 を 期 待 す
るドーピングが最も多い。創薬の分野では、遺伝子組換え、クローニングおよび化学
合成などを用いたタンパク質・ペプチド製剤の開発の進歩は目覚しいものがある。し
かし、それらが大きく医療に貢献する一方、競技者によるドーピング目的による使用
も 懸 念 さ れ る 。ペ プ チ ド ホ ル モ ン の 検 出 例 は 、2008 年 か ら 2012 年 の WADA の 統 計 に
よ る と 、1.6− 4.0%で あ る が 、こ れ は 使 用 例 が 少 な い と い う よ り も 検 査 体 制 が い ま だ 不
十分ともいえる。実際、自転車競技のような持久力系競技において、酸素運搬能の向
上 を 期 待 す る エ リ ス ロ ポ エ チ ン（ Erythropoietin: EPO）の 使 用 は 、マ ス コ ミ で も 大 き く
取りあげられるなど大きな社会問題となっている。
ドーピング検査においては、元来生体内には存在しない興奮薬や利尿薬などは、検
出されたことをもってドーピングと判定することが可能である。筋肉増強作用を有す
4
る タ ン パ ク 同 化 ス テ ロ イ ド ホ ル モ ン 、 成 長 ホ ル モ ン （ Growth hormone: GH） に 代 表 さ
れる成長促進因子および持久力向上を期待する造血ホルモンの使用を検出することは
困難を伴う。その最大の理由としては、ホルモン製剤の場合は単に検出するだけでは
なく、生体内にあるホルモンと摂取されたホルモン製剤とを識別する必要があること
が 挙 げ ら れ る 。実 際 、2012 年 の タ ン パ ク 同 化 ス テ ロ イ ド ホ ル モ ン の 検 出 例 の 中 で も テ
ス ト ス テ ロ ン （ 17β-Hydroxy-4-androsten-3-one: Testosterone） が 依 然 と し て 最 も 多 い の
は
5)
、検出された場合に、競技者側が裁判などを通じて言い逃れる可能性があること
を熟知しているためと考えられる。
こうした背景を踏まえ、著者は 3 つのホルモンドーピングすなわち、タンパク同化
ス テ ロ イ ド ホ ル モ ン 、 GH お よ び 造 血 ホ ル モ ン に 焦 点 を 当 て 、 そ の ド ー ピ ン グ 検 査 を
有効なものとするべく研究を行った。
第 1 章 で は 、 タ ン パ ク 同 化 ス テ ロ イ ド ホ ル モ ン の 一 つ で あ る Testosterone 製 剤 の ド
ーピング検査における妥当性について検討した。競技者による筋肉増強効果を意図し
たタンパク同化ステロイドホルモン製剤の不正使用は、数十年来スポーツにおける重
大な懸案事項となっている。タンパク同化ステロイドホルモンによるドーピング検査
に お け る 課 題 は 、Testosterone 製 剤 を 使 用 し た 場 合 の 、外 因 性 と 内 因 性 の 異 同 識 別 で あ
る 。 Testosterone 製 剤 に よ る ド ー ピ ン グ を 検 知 す る た め に 、 WADA は 一 次 ス ク リ ー ニ
ング検査における世界共通の判断基準（閾値）を設けているが、内因性ステロイドホ
ルモン等の尿中排泄については、黄色人種（モンゴロイド）と白色人種（コーカソイ
ド）とでは大きく異なる可能性があり、その基準を見直すべきであるとの議論がなさ
れてきた。そこで、日本人競技者に対して、より実効性あるドーピング検査を実施す
る た め に 、 日 本 人 ス ポ ー ツ 競 技 者 の Testosterone の グ ル ク ロ ン 酸 抱 合 に 関 与 す る 遺 伝
子多型および内因性ステロイドホルモンの尿プロファイルの検討を行った。さらに、
こ れ ま で 実 施 例 が ほ と ん ど 無 か っ た 女 性 に 対 す る Testosterone 製 剤 の 投 与 試 験 を 実 施
し た 。投 与 前 後 の 尿 試 料 を 現 行 の WADA 承 認 試 験 法 に よ り 分 析 し 、そ の 妥 当 性 を 検 討
した。
第 2 章 で は 、 GH 放 出 ペ プ チ ド -2（ Growth hormone releasing peptide-2: GHRP-2） の
ド ー ピ ン グ 検 査 法 を 開 発 す る こ と を 主 目 的 と し た 。 GHRP-2 は GH 分 泌 不 全 症 の 診 断
薬として日本国内で使用されている
6 ,7 )
。一 方 、イ ン タ ー ネ ッ ト 上 で は GHRP-2 を 含 有
するサプリメントが販売されており、誰もが容易に入手可能な状態になっている
8,9)
。
故 に 、 競 技 者 に よ り GHRP-2 が 乱 用 さ れ て い る 可 能 性 が 懸 念 さ れ る 。 ま ず 、 遺 伝 子 組
換 え GH（ Recombinant human GH: rhGH）の 投 与 試 験 を 実 施 し 、WADA が 承 認 し た rhGH
の ド ー ピ ン グ 検 査 法 「 GH isoform differential immunoassay」 の 妥 当 性 を 検 討 し た 。 次
に 、 GHRP-2 の 投 与 試 験 を 行 い 、「 GH isoform differential immunoassay」 に よ る 検 出 可
否 に つ い て 検 討 し た 。 ま た 、 GHRP-2 と rhGH の 併 用 使 用 が 、「 GH isoform differential
immunoassay」法 へ ど の よ う な 影 響 を 及 ぼ す か に つ い て も 検 討 し た 。さ ら に 、ヒ ト 尿 中
GHRP-2 お よ び そ の 代 謝 物 を 、質 量 分 析 に よ り 直 接 的 に 検 出 す る 手 法 の 開 発 を 行 っ た 。
5
第 3 章 で は 、 造 血 ホ ル モ ン の 一 つ で あ る EPO 製 剤 ダ ル ベ ポ エ チ ン ア ル フ ァ
（ Darbepoetin alfa） の 質 量 分 析 に よ る ド ー ピ ン グ 検 査 法 の 開 発 を 行 っ た 。 1989 年 に 、
Amgen（ Thousand Oaks, CA, USA） が 遺 伝 子 組 換 え 技 術 に よ り EPO 製 剤 を 開 発 し た こ
とは、腎性貧血治療の領域に大きな貢献となった。一方で、スポーツ競技の世界にお
いて、酸素運搬能を向上させる目的で長距離自転車競技者によるドーピング行為へと
つ な が る 結 果 と な っ た 。 Table 3 に 、 WADA 認 定 試 験 所 で の EPO 関 連 物 質 の 検 出 数 を
示した
5)
。
Table 3. The number of analytical findings of EPOs 5 )
Year
Epoetins
Darbepoetin alfa
PEG-EPO (Mircera)
2002
－
3
－
2003
51
7
－
2004
38
0
－
2005
15
1
－
2006
17
1
－
2007
22
2
－
2008
51
2
5
2009
56
4
8
2010
36
8
1
2011
43
5
－
こ の よ う に 、EPO 製 剤 に よ る ド ー ピ ン グ は 、後 を 絶 た た な い 状 況 で あ る 。現 在 、WADA
が 承 認 し た EPO ド ー ピ ン グ を 直 接 的 に 検 出 す る 方 法 は 、 電 気 泳 動 法 で あ り
10 )
、熟練
し た 手 技 が 必 要 で 、検 査 に は 3 日 間 の 工 程 を 要 す る 。ド ー ピ ン グ 検 査 や 法 医 鑑 定 で は 、
最 も 信 頼 性 の 高 い 分 析 法 は 質 量 分 析 で あ る 。し か し な が ら 、EPO 製 剤 の 質 量 分 析 に よ
るドーピング検査法はいまだ開発されていない。そこで、本章では、タンパク質の酵
素 消 化 後 に 得 ら れ る ペ プ チ ド 断 片 を 測 定 す る Bottom-up 法 に よ り 、天 然 型 EPO の 構 造
を 改 変 し た EPO 製 剤 Darbepoetin alfa の 質 量 分 析 法 の 開 発 を 行 っ た 。
6
第１章
日本人におけるテストステロンドーピング検査の妥当性検証と改
良
1.1
序論
Testosterone 製 剤 は 、男 子 性 腺 機 能 不 全 や 再 生 不 良 性 貧 血 の 治 療 の た め に 、広 く 臨 床
で使用されている医薬品である。しかしながら、スポーツ競技者による筋肉増強効果
を意図した乱用は、数十年間スポーツにおける重大な問題になっている。
1979 年 に 、 Baba ら は 免 疫 放 射 定 量 法 （ immunoradiometric assay: IRMA） に か わ り 、
安 定 同 位 体 希 釈 法 を 用 い た ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー 質 量 分 析 法 （ gas chromatography
mass spectrometry: GC–MS） に よ り 血 漿 お よ び 尿 中 の 微 量 Testosterone を 選 択 的 に 測 定
す る こ と を 可 能 と し 、 Testosterone 製 剤 の 薬 物 動 態 研 究 に 画 期 的 な 進 歩 を も た ら し た
11, 12 )
。 一 方 、 内 因 性 の Testosterone と 医 薬 品 製 剤 由 来 の Testosterone は 、 そ の 分 子 量
（ molecular weight: MW）と 分 子 組 成 は 同 一 で あ る（ C 1 9 H 28 O 2 , MW = 288.4）。そ の た め 、
両 者 の 由 来 を GC–MS に よ る 質 量 ス ペ ク ト ル を も と に 識 別 す る こ と は 困 難 で あ る 。
Donike ら は 、 Testosterone 製 剤 の 投 与 に よ り 尿 中 の Testosterone 濃 度 が 上 昇 し 、 逆 に 、
そ の 異 性 体 エ ピ テ ス ト ス テ ロ ン（ 17α-Hydroxy-4-androsten-3-one, Epitestosterone）が 抑
制 さ れ る こ と に 着 目 し 、 尿 中 の Testosterone の グ ル ク ロ ン 酸 抱 合 体 （ glucuronide） と
Epitestosterone の glucuronide の ア グ リ コ ン 比 率 （ Testosterone to Epitestosterone ratio:
T/E） を GC–MS に よ り 測 定 し 、 T/E の 上 昇 を 捉 え る こ と で Testosterone 製 剤 に よ る ド
ーピングが検知可能であることを報告した
13 )
。国 際 オ リ ン ピ ッ ク 委 員 会（ International
Olympic Committee: IOC）は 、1982 年 に Donike ら に よ っ て 統 計 学 的 に 算 出 さ れ た T/E>6
を Testosterone ド ー ピ ン グ の 判 定 閾 値 に 設 定 し た 。 そ の 後 、 先 天 的 に 高 い T/E を 有 し
た競技者が存在する事例が報告されるようになった
14 -17 )
。そ の た め 、ド ー ピ ン グ 検 査
に お い て T/E が 高 値 を 示 し た 場 合 に は 、 違 反 が 疑 わ れ る 分 析 結 果 （ adverse analytical
finding: AAF）と 判 定 す る 前 に 、そ れ が 生 理 的 も し く は 病 的 な も の に 起 因 し て い る 可 能
性についての追跡調査を行うことが必要となった。
1994 年 に は 、 Becchi ら が 、 尿 中 Testosterone の 起 源 を 識 別 可 能 と す る ガ ス ク ロ マ ト
グ ラ フ ィ ー 同 位 体 比 質 量 分 析 法 （ gas chromatography isotope ratio mass spectrometry:
GC–IRMS） に よ る 革 新 的 な 技 術 を 開 発 し た
18 )
。炭素の天然同位体比
12
C:
13
C は、お
よ そ 99:1 で あ り 、海 水 中 炭 酸 や 空 気 中 炭 酸 ガ ス の そ れ ら は ほ ぼ 一 定 の 値 を 示 す 。し か
し、陸上の固体成分では食物連鎖や炭酸同化作用の過程に起こる同位体効果により、
由 来 ご と に 特 徴 的 な 炭 素 同 位 体 比 （ carbon isotope ratio: CIR） を 示 す
19 )
。 CIR は 、 国
際 標 準 物 質 （ 米 国 南 カ ロ ラ イ ナ 州 の Pee Dee 層 か ら 産 出 し た ベ レ ム ナ イ ト 化 石 : PDB）
からの
13
C 含 量 の 千 分 率 偏 差 （ δ 1 3 C ‰)で 表 さ れ る 。 生 体 内 で 合 成 さ れ た Testosterone
と 化 学 合 成 さ れ た Testosterone 製 剤 で は 、 炭 素 源 が 異 な り 、 同 位 体 分 別 （ isotopic
fractionation） に よ り 両 者 の CIR は 異 な る 。 す な わ ち 、 医 薬 品 等 の 化 学 合 成 し た
7
Testosterone 製 剤 の 原 料 は 植 物 ス テ ロ ー ル で あ り 、 そ の δ 1 3 C 値 は –30‰ 近 辺 で あ る の に
対 し 、生 体 内 の そ れ は –20‰ 近 辺 を 示 す 。GC–IRMS 分 析 に よ り 、尿 試 料 中 の Testosterone
お よ び そ の 代 謝 関 連 ス テ ロ イ ド の CIR を 測 定 す る こ と に よ り 、 Testosterone 製 剤 に よ
るドーピングを直接的に検知することが可能である。しかし、この技術は分析に時間
を要し、高コストであることから、ドーピング検査において多数の尿試料を測定する
こ と は 難 し い の が 現 状 で あ る 。 WADA は 2005 年 に 、 Testosterone 製 剤 に よ る ド ー ピ ン
グ の 検 出 率 を 改 善 す る た め に 、T/E の 閾 値 を 6 か ら 4 に 引 き 下 げ た 。現 在 、WADA は 、
T/E > 4 を 示 し た 場 合 に は 、 追 跡 調 査 も し く は WADA 認 定 試 験 所 に よ る GC–IRMS 分 析
の実施を必須と規定している
20 )
。 ま た 、 T/E に よ る ア プ ロ ー チ に 加 え て 、 尿 中 ス テ ロ
イ ド の glucuronide の 濃 度 、す な わ ち 、Testosterone お よ び Epitestosterone > 200 ng/mL、
Androsterone（ A） > 10000 ng/mL、 Etiocholanolone（ Et） > 10000 ng/mL お よ び
Dehydroepiandrosterone（ DHEA）>100 ng/mL の 閾 値 を 超 え た 場 合 に も 、GC–IRMS 分 析
を実施することと規定されている
20 )
。
ア ジ ア 圏 の 競 技 者 の 尿 中 の T/E は 、 欧 米 圏 の コ ー カ サ ス 人 種 の そ れ よ り も 顕 著 に 低
値であることが報告された
21 -24 )
。す な わ ち 、尿 中 の T/E は 人 種 に よ り 差 が あ る こ と が
示 唆 さ れ た 。 ヒ ト に お い て 、 Testosterone お よ び そ の 第 I 相 代 謝 物 は 、 uridine
diphospho-glucuronosyltransferase（ UGT）に よ っ て グ ル ク ロ ン 酸 抱 合 を 受 け 、尿 中 に 第
II 相 代 謝 物 と し て 排 泄 さ れ る
25 ,2 6)
。 代 謝 経 路 を Figure 1-1 に 示 し た よ う に 、 グ ル ク ロ
ン 酸 抱 合 に は 、UGT 遺 伝 子 フ ァ ミ リ ー の う ち フ ァ ミ リ ー 2（ UGT2）に 属 す る 酵 素 が 関
与 し て お り 、Testosterone は 、主 に UGT2B17、わ ず か に UGT2B15 に よ り 抱 合 を 受 け る
27)
。そ れ に 対 し て 、Epitestosterone は 、主 に UGT2B7 に よ り 、抱 合 を 受 け る
ら は 、 UGT2B17 遺 伝 子 多 型 （ gene polymorphism） に つ い て 報 告 し た
31 )
28 -30 )
。Wilson
。 UGT2B17 に
は 一 塩 基 多 型 が あ り 、 ホ モ 接 合 型 挿 入 （ homozygous insertion: ins/ins）、 ホ モ 接 合 型 欠
失 （ homozygous deletion: del/del） お よ び ヘ テ ロ 型 （ heterozygous: del/ins） が あ り 、 ア
フリカ系アメリカ人とコーカサス人種との間ではそれらの頻度が異なることを明らか
に し た 。 さ ら に 、 Jakobsson ら は 、 UGT2B17 del/del 遺 伝 子 型 が 韓 国 人 男 性 で は ス ウ ェ
ーデン人男性のそれよりも 7 倍の頻度であることを報告した
32 )
。 Jakobsson ら は 、
Testosterone enanthate 500 mg を del/del 型 の コ ー カ サ ス 人 男 性 被 験 者 に 筋 肉 内 投 与 し た
と こ ろ 、そ の 40%の 被 験 者 は T/E が WADA の 設 定 し た 閾 値 4 に 到 達 し な か っ た の に 対
し て 、ins/ins お よ び del/ins 型 被 験 者 に お い て は T/E が 閾 値 4 に 到 達 し た こ と を 報 告 し
た
33 )
。こ の よ う に 、人 種 差 や 遺 伝 子 多 型 に よ り 内 因 性 ス テ ロ イ ド ホ ル モ ン の 尿 中 排 泄
は 大 き く 異 な る 可 能 性 が あ り 、そ の 基 準 を 見 直 す べ き で あ る と の 議 論 が な さ れ て き た 。
著 者 の 知 る 限 り に お い て は 、 日 本 人 ス ポ ー ツ 競 技 者 に お け る UGT2B17 遺 伝 子 解 析 お
よ び UGT2B17 遺 伝 子 型 別 に 、 Testosterone 製 剤 を 使 用 し た 場 合 の 尿 中 ス テ ロ イ ド 濃 度
や T/E な ど の ス テ ロ イ ド プ ロ フ ァ イ ル （ steroid profile） に 対 す る 影 響 に つ い て の 報 告
は 無 い 。 さ ら に 、 Testosterone 製 剤 の 投 与 に よ る steroid profile へ の 影 響 に 関 す る 報 告
は、男性での報告と比較して女性での報告はほとんど無い。本章では、日本人競技者
8
か ら 尿 試 料 お よ び 血 液 試 料 を 採 取 し 、 UGT2B17 遺 伝 子 型 お よ び 尿 中 の steroid profile
に 関 し て 検 討 し た 。 ま た 、 非 競 技 者 で あ る 日 本 人 女 性 に 対 し て UGT2B17 遺 伝 子 型 別
に 少 量 の Testosterone enanthate を 筋 肉 内 投 与 し 、 投 与 前 後 の 尿 試 料 を 採 取 し た 。 尿 中
の steroid profile お よ び 尿 中 ス テ ロ イ ド の CIR 測 定 を 行 い 、現 行 の Testosterone ド ー ピ
ング検査法の妥当性について検討した。
Figure 1-1. Metabolic pathway of testosterone and the related steroids 2 5-30) .
9
1.2
1.2.1
実験の部
試薬および材料
β-グ ル ク ロ ニ ダ ー ゼ（ Escherichia coli K12）溶 液 は Roche Diagnostics GmbH
（ Mannheim,
Germany） か ら 購 入 し た 。 N-メ チ ル -N-ト リ メ チ ル シ リ ル ト リ フ ル オ ロ ア セ タ ミ ド
（ MSTFA）は Marcherey-Nagel（ Duren, Germany）か ら 購 入 し た 。ヨ ウ 化 ア ン モ ニ ウ ム
（ NH 4 I） は Sigma（ St. Louis, MO, USA） か ら 購 入 し た 。 エ タ ン チ オ ー ル お よ び tertブ チ ル メ チ ル エ ー テ ル （ tert-butyl methyl ether: MTBE） は 和 光 純 薬 （ Osaka, Japan） か
ら 購 入 し た 。 乾 燥 ピ リ ジ ン は Merck（ Darmstadt, Germany） か ら 購 入 し た 。 蒸 留 水 は
Milli-Q ultra pure system（ Millipore, Bedford, MA, USA） に よ り 製 造 し た も の を 使 用 し
た 。固 相 抽 出 用 カ ー ト リ ッ ジ（ Bond Elut LRC-C18, 500 mg）は Varian（ Lake Forest, CA,
USA） か ら 購 入 し た 。 QIAamp ® DNA Mini Kit は キ ア ゲ ン （ Tokyo, Japan） よ り 購 入 し
た 。 TaKaRa Ex Taq ® Hot Start Version は タ カ ラ バ イ オ （ Shiga, Japan） か ら 購 入 し た 。
DNA-2500 Reagent Kit は 島 津 製 作 所（ Kyoto, Japan）か ら 購 入 し た 。pGEM ® DNA Marker
は プ ロ メ ガ （ Tokyo, Japan） か ら 購 入 し た 。 プ ラ イ マ ー マ ス タ ー ミ ッ ク ス 、 BigDye ®
Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit、 SYBR ® Gold nucleic acid gel stain お よ び DEPC
treated water は ラ イ フ テ ク ノ ロ ジ ー ズ （ Tokyo, Japan） か ら 購 入 し た 。 ポ リ メ ラ ー ゼ 連
鎖 反 応（ polymerase chain reaction: PCR）用 プ ラ イ マ ー マ ス タ ー ミ ッ ク ス の 構 成 は 以 下
に示した。
・ UGT2B15 specific primers（ marker G）
forward（ 5′ -CCTGGAAGAGCTTGTTCAGA-3′）
reverse（ 5′ -CTGCCAGAATGACATCAAAC-3′）
・ UGT2B17 specific primers（ marker D）
forward（ 5′ -TCACAAGTCAATCTCCCATCC-3′）
reverse（ 5′ -CTGCAGAATATGTCAATAATTGGC-3′）
・ UGT2B17 deletion specific primer（ marker J）
forward（ 5′ -TGCACAGAGTTAAGAAATGGAGAGATGTG-3′）
reverse（ 5′ -GATCATCCTATATCCTGACAGAATTCTTTTG-3′）
Epitestosterone、 Androsterone（ A） お よ び 17α-Methyltestosterone（ MT） は Sigma か ら
購 入 し た 。Etiocholanolone（ Et）お よ び 5α-androstan-3β-ol は Steraloids（ Newport, RI, USA）
か ら 購 入 し た 。 Testosterone、 DHEA、 5α-androstan-3α,17β-diol（ 5α-diol）、
5β-androstan-3α,17β-diol（ 5β-diol）、 [16,16,17- 2 H 3 ]Testosterone（ d 3 -T）、
[16,16,17- 2 H 3 ]Epitestosterone（ d 3 -E）、 [2,2,3,4,4- 2 H 5 ]Et（ d 5 -Et）、 [16,16,17- 2 H 3 ]5α-diol
（ d 3 -5α-diol）、 [2,2,3,4,4- 2 H 5 ]5β-diol（ d 5 -5β-diol） お よ び [2,2,4,4- 2 H 4 ]A-β-glucuronide
（ d 4 -A-g） は National Measurement Institute（ New South Wales Pymbel, Australia） か ら
購 入 し た 。Pregnanediol（ Pdiol）は Merck か ら 購 入 し た 。 [2,2,3,4,4,6- 2 H 6 ]DHEA（ d 6 -DHEA）
は Isotec（ Miamisburg, OH, USA） か ら 購 入 し た 。 Testosterone propionate は 東 京 化 成
10
（ Tokyo, Japan） か ら 購 入 し た 。 尿 中 ス テ ロ イ ド 定 量 用 の 内 部 標 準 物 質 （ internal
standard: I.S.）は エ タ ノ ー ル 混 合 溶 液 と し 、MT、d 3 -T、d 3 -E、d 5 -Et、d 3 -5α-diol、d 5 -5β-diol、
d 4 -A-g お よ び d 6 -DHEA の 濃 度 は 、 4.1、 7.2、 1.9、 9.2、 3.7、 3.6、 7.9 お よ び 6.5 μg/mL
に そ れ ぞ れ 調 製 し た 。 投 与 試 験 に 用 い た 注 射 用 製 剤 エ ナ ル モ ン デ ポ ー ® （ Testosterone
enanthate, 100 mg 注 射 液 ） は 、 あ す か 製 薬 （ Tokyo, Japan） か ら 購 入 し た 。 そ の 他 の 試
薬はすべて分析用もしくは特級グレード以上のものを使用した。
1.2.2
GC–MS に よ る 尿 中 の steroid profile の 分 析
ドーピング検査における一般的な尿試料の前処理を行った
34 , 35 )
。要 約 す る と 、3 mL
の 尿 試 料 に 0.75 mL の 0.8 M リ ン 酸 緩 衝 液 （ phosphate buffered saline: PBS）（ pH 7.0）、
50 μL の 尿 中 ス テ ロ イ ド 定 量 用 I.S.の 混 合 溶 液 お よ び 50 μL の β-グ ル ク ロ ニ ダ ー ゼ
（ Escherichia coli K12）溶 液 を 加 え 、50 °C で 60 分 間 イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン し た 。0.5 mL
の 20% K 2 CO 3 /KHCO 3 (1/1, w/w)水 溶 液 を 加 え て 塩 基 性（ pH 9.6）と し た 後 、5 mL の MTBE
で 遊 離 型 ア グ リ コ ン（ ス テ ロ イ ド ）を 抽 出 し た 。溶 媒 を 窒 素 気 流 下 で 蒸 発 乾 固 し 、50 μL
の MSTFA/NH 4 I/エ タ ン チ オ ー ル （ 1000/2/6, v/w/v)を 加 え 、 60 °C で 15 分 間 加 熱 し 、 ト
リ メ チ ル シ リ ル（ TMS）誘 導 体 化 を 行 っ た（ Figure 1-2）。反 応 後 、そ の 2 μL を GC–MS
システムへ注入した。
Figure 1-2. TMS derivatization of testosterone.
GC–MS シ ス テ ム は 、 ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ 四 重 極 型 質 量 分 析 計 Agilent GC/5975 inert
XL MSD（ Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA）を 使 用 し た 。分 析 カ ラ ム は Agilent
Ultra-1（ 17 m, 内 径 0.25 mm, 膜 厚 0.11 μm） を 用 い た 。 オ ー ブ ン 温 度 は 180 °C（ ホ
ー ル ド 1 分 ）か ら 229 °C ま で 3 °C/分 で 昇 温 し 、さ ら に 300 °C ま で 40 °C/分 で 昇 温 し 、
3 分 間 保 持 し た 。キ ャ リ ア ガ ス は 定 圧 モ ー ド（ 12 psi）で ヘ リ ウ ム を 使 用 し た 。注 入 口
温 度 は 280 °C に 設 定 し 、 注 入 モ ー ド は ス プ リ ッ ト （ 11:1） と し た 。 イ ン タ ー フ ェ ー ス
温 度 は 300 °C に 設 定 し た 。イ オ ン 化 は 70 eV で 電 子 イ オ ン 化（ electron ionization: EI）
と し 、 イ オ ン 源 温 度 は 230 °C に 設 定 し た 。 デ ー タ は す べ て 選 択 イ オ ン モ ニ タ リ ン グ
（ selected ion monitoring: SIM） で 取 得 し た 。 尿 中 ス テ ロ イ ド の 定 量 は 、 WADA 認 定 試
験所で統一して用いられている 1 点検量線で安定同位体希釈質量分析により行った。
定 量 用 標 準 物 質 添 加 尿 試 料 か ら 得 ら れ た I.S.に 対 す る ピ ー ク 面 積 比 と 測 定 試 料 の ピ ー
11
ク面積比を比較して尿中濃度を算出した。ステロイド濃度は、グルクロン酸抱合体の
加水分解後のアグリコン濃度を表記した。定量用の標準物質添加尿試料のステロイド
濃 度 は 、 そ れ ぞ れ 、 Testosterone: 2.4 ng/mL（ 0.5− 16 ng/mL） も し く は 70 ng/mL（ >16
ng/mL）、Epitestosterone: 20 ng/mL、A: 1330 ng/mL、Et: 1330 ng/mL、5α-diol: 110 ng/mL、
5β-diol: 334 ng/mL お よ び DHEA: 104 ng/mL と し た 。
1.2.3
GC–IRMS に よ る 尿 中 ス テ ロ イ ド の 炭 素 同 位 体 比 測 定
ドーピング検査における一般的な尿試料の前処理を行った
36 -3 8)
。要 約 す る と 、10–30
mL の 尿 試 料 を BondElut LRC-C 18（ CH 3 OH 6 mL お よ び 蒸 留 水 6 mL で 活 性 化 し た も の ）
に 供 し て 、5 mL の 蒸 留 水 で 洗 浄 し 、3 mL の CH 3 OH で 固 相 抽 出 を 行 っ た 。抽 出 溶 媒 を
窒 素 気 流 下 、60 °C で 蒸 発 乾 固 し た 。1 mL の 0.2M PBS（ pH 7.0）を 加 え 、5 mL の ジ エ
チ ル エ ー テ ル に よ り 遊 離 型 ス テ ロ イ ド を 除 去 し た 。 水 層 に 50 μL の β-グ ル ク ロ ニ ダ ー
ゼ （ Escherichia coli K12） 溶 液 を 加 え 、 50 °C で 60 分 間 イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン し た 。 遊
離 型 ア グ リ コ ン と し た 対 象 ス テ ロ イ ド は 、 25 mg の K 2 CO 3 を 加 え て 塩 基 性 （ pH 9.6）
と し 、 5 mL の n-ペ ン タ ン に よ り 液 − 液 抽 出 し た 。 有 機 層 に 100 μL の Testosterone
propionate エ タ ノ ー ル 溶 液（ 24 μg/mL）を 加 え 、窒 素 気 流 下 60 °C で 蒸 発 乾 固 し た 。残
渣 を 110 μL の 30% CH 3 CN で 再 溶 解 し 、高 速 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー（ high performance
liquid chromatography: HPLC） に よ る ス テ ロ イ ド の 分 画 分 取 用 試 料 と し た 。 HPLC シ ス
テ ム は Alliance（ Waters, Milford, MA, USA）を 使 用 し 、カ ラ ム は CAPCELL PAK C 8 DD
（ 150 mm × 2.0 mm, 粒 径 5 μm） を 資 生 堂 （ Tokyo, Japan） か ら 購 入 し て 使 用 し た 。 注
入 量 は 50 μL と し た 。 検 出 器 は 、 Waters 2998 Photodiode array を 用 い て 波 長 を 191 nm
に 設 定 し た 。 移 動 相 に は 30% CH 3 CN（ 移 動 相 A） お よ び 100% CH 3 CN（ 移 動 相 B） を
使 用 し た 。 カ ラ ム 温 度 は 50 °C に 設 定 し 、 流 速 は 0.5 mL/分 で グ ラ ジ エ ン ト 溶 出 し た 。
グ ラ ジ エ ン ト 条 件 は 、 0% B か ら 20 分 で 50% B ま で リ ニ ア グ ラ ジ エ ン ト 溶 出 し 、 3 分
間 保 持 し た 。そ の 後 、3 分 で 0% B に 戻 し 、7 分 間 保 持 し て 移 動 相 初 期 条 件 で 平 衡 化 し
た。以下のように、対象ステロイドを 5 つのフラクションに分画し、分取した。
フ ラ ク シ ョ ン I（ 6 分 − 7.4 分 ）
: Testosterone
フ ラ ク シ ョ ン II（ 7.4 分 − 8.1 分 ）
: DHEA
フ ラ ク シ ョ ン III（ 8.1 分 − 9.5 分 ）
: 5α-diol、 5β-diol お よ び Epitestosterone
フ ラ ク シ ョ ン IV（ 9.5 分 − 11.2 分 ）
: A お よ び Et
フ ラ ク シ ョ ン V（ 11.2 分 − 13.3 分 ）
: Pdiol
な お 、 回 収 す る 保 持 時 間 （ retention time: t R ） に つ い て は 標 準 物 質 の 分 析 を 行 い 、 適 宜
最 適 な 時 間 を 設 定 し た 。 I.S.と し て 加 え た Testosterone propionate の t R を 指 標 と し て 、
測 定 試 料 毎 の わ ず か な tR の 差 異 を 補 正 し て 分 取 し た 。
12
次 に 、 分 画 分 取 し た 各 フ ラ ク シ ョ ン に 、 GC–IRMS 測 定 用 の I.S.と し て 30 μL の
5α-androstan-3β-ol エ タ ノ ー ル 溶 液（ 100 μg/mL）を 添 加 し 、窒 素 気 流 下 、60 °C で 蒸 発
乾 固 し た 。残 渣 に 50 μL の 乾 燥 ピ リ ジ ン お よ び 100 μL の 無 水 酢 酸 を 加 え 、60 °C で 60
分 間 加 熱 し 、 ア セ チ ル 誘 導 体 化 を 行 っ た （ Figure 1-3）。 反 応 終 了 後 、 窒 素 気 流 下 室 温
で 蒸 発 乾 固 し た 。残 渣 に 30 μL の シ ク ロ ヘ キ サ ン を 添 加 し て 再 溶 解 し 、GC–IRMS に よ
る CIR 測 定 用 試 料 と し た 。
Figure 1-3. Acetylation of 5α-androstan-3α,17β-diol.
GC–IRMS シ ス テ ム は Agilent 7890A GC/Isoprime 安 定 同 位 体 比 質 量 分 析 計（ Isoprime
Ltd., Cheadle, UK）を 使 用 し 、分 析 カ ラ ム は Agilent DB-17（ 30 m, 内 径 0.25 mm, 膜 厚
0.25 μm, 50% phenylmethylsilicone） を 用 い た 。 オ ー ブ ン 温 度 は 50 °C（ ホ ー ル ド 1 分 ）
か ら 250 °C ま で 20 °C/分 で 昇 温 し 、 さ ら に 300 °C ま で 5 °C/分 で 昇 温 し 、 9 分 間 保 持
し た 。キ ャ リ ア ガ ス は 、定 流 速 モ ー ド（ 1 mL/分 ）で 超 高 純 度 ヘ リ ウ ム を 使 用 し た 。注
入 口 温 度 は 260 °C に 設 定 し 、注 入 モ ー ド は ス プ リ ッ ト レ ス と し た 。イ ン タ ー フ ェ ー ス
温 度 は 350 °C に 設 定 し た 。 酸 化 銅 が 充 填 さ れ た ガ ラ ス 燃 焼 管 は 850 °C に 設 定 し た 。
有 機 物 を 燃 焼 し て CO 2 ガ ス と し 、 生 成 し た H 2 O は 液 体 窒 素 に よ り −100°C に 冷 却 し て
除 去 し た 。 CO 2 ガ ス を 連 続 的 に 安 定 同 位 体 比 質 量 分 析 計 に 導 入 し 、 m/z 44（ 12 C 16 O 2 ）
と m/z 45（ 13 C 16 O 2 ）の イ オ ン 測 定 を 行 っ た 。標 準 物 質 に 対 し て 校 正 さ れ た 標 準 CO 2 ガ
ス と の 比 較 か ら 有 機 化 合 物 の CIR を 測 定 し た 。δ 13 C 値 測 定 用 の 標 準 CO 2 ガ ス は 、国 際
標 準 品 NBS-19 limestone
（ IAEA の 供 給 す る CaCO 3 ）に 対 し て 校 正 し た も の を 使 用 し た 。
1.2.4
UGT2B17 遺 伝 子 解 析
UGT2B17 遺 伝 子 解 析 は Wilson ら の 方 法 に 従 っ て 実 施 し た
31 )
。要約すると、ヒト全
®
血 試 料 200 μL か ら ゲ ノ ム DNA を QIAamp DNA Mini Kit を 用 い て 抽 出 し た 。 ゲ ノ ム
DNA 濃 度 は 、NanoDrop ® ND-1000 分 光 光 度 計（ NanoDrop Technologies, DE, USA）に よ
り 吸 光 度 を 測 定 し て 算 出 し た（ 波 長 : 260 nm, 280 nm）。DNA 濃 度 に 応 じ て 、DEPC treated
water に よ り 2 ng/μL に 希 釈 し た 。 プ ラ イ マ ー マ ス タ ー ミ ッ ク ス を 含 む ゲ ノ ム DNA サ
ン プ ル （ 10 ng） は 、 GeneAmp ® PCR シ ス テ ム 9700（ ラ イ フ テ ク ノ ロ ジ ー ズ ） を 用 い
て PCR 増 幅 し た 。PCR 増 幅 は 、94 °C 180 秒 で ホ ー ル ド し 、94 °C 20 秒 、60 °C 30 秒 、
72 °C 90 秒 を 30 サ イ ク ル 行 い 、 さ ら に 4 °C に ホ ー ル ド し た 。 得 ら れ た PCR 反 応 産 物
13
5 μL を DNA ラ ダ ー 溶 液 （ pGEM ® DNA Markers） 11 μL と 共 に PCR チ ュ ー ブ に 採 り 、
96 ウ ェ ル プ レ ー ト の 各 セ ル 内 で 混 合 し た 。 SYBR ® Gold nucleic acid gel stain を 染 色 試
薬 に 用 い て 、 MultiNA MCE ® -202 マ イ ク ロ チ ッ プ 電 気 泳 動 シ ス テ ム （ 島 津 製 作 所 ） で
UGT2B17 変 異 測 定 を 行 っ た 。 PCR 反 応 産 物 の シ ー ケ ン ス は 、 BigDye ® Terminator v1.1
Cycle Sequencing Kit お よ び Applied Biosystem 3130xl Genetic Analyzer（ ラ イ フ テ ク ノ
ロジーズ）により解析した。
1.2.5
統計解析
統 計 解 析 は エ ク セ ル 統 計 1.01 for Windows（ 社 会 情 報 サ ー ビ ス , Tokyo, Japan）を 使 用
し た 。 特 に 言 及 が な い 数 値 に つ い て は 、 す べ て 平 均 値 （ mean） ± 標 準 偏 差 （ standard
deviation: SD n - 1 ） で 記 述 し た 。 分 布 の 正 規 性 は 、 コ ル モ ゴ ロ フ –ス ミ ル ノ フ 検 定 に よ り
確 認 し た 。 UGT2B17 ホ モ 接 合 型 欠 失 群 （ del/del） と そ の 他 （ del/ins + ins/ins） の 間 の
有 意 差 検 定 は 、ノ ン パ ラ メ ト リ ッ ク な マ ン –ホ イ ッ ト ニ ー の U 検 定 を 用 い て 解 析 し た 。
日 本 人 に お け る 遺 伝 子 型 の 分 布 に つ い て の ハ ー デ ィ –ワ イ ン ベ ル ク 平 衡 へ の 適 合 性 は 、
ピ ア ソ ン の χ 2 検 定 （ χ 2 = 3.84, 有 意 水 準 5%, 自 由 度 = 1) に よ り 確 認 し た 。 男 女 差 お
よ び 遺 伝 子 型 間 の 差 は 、 χ 2 検 定 を 使 用 し て 解 析 し た 。 Testosterone enanthate の 投 与 前
後 の 比 較 に は 、 ウ ィ ル コ ク ソ ン の 符 号 順 位 検 定 を 用 い た 。 本 章 で は 、 P < 0.05 を 統 計
学 的 有 意 差 あ り と し た 。ま た 、95%信 頼 区 間（ 95% CI, 2.5 th パ ー セ ン タ イ ル と 97.5 th パ
ーセンタイル間) を基準範囲に設定した。
1.2.6
ヒト試料
本章を含め本研究における医薬品のヒトへの投与試験については、厚生労働省の臨
床 研 究 に 関 す る 倫 理 指 針 「 平 成 20 年 7 月 31 日 改 訂 版 」 に 従 い 、 介 入 を 伴 う 医 学 研 究
としてヘルシンキ宣言に示された倫理規範を準拠した。薬剤投与試験については、臨
床試験実施医療機関（都内 2 施設）における倫理審査委員会の承認を得た。臨床試験
情 報 は 、（ 一 財 ） 日 本 医 薬 情 報 セ ン タ ー （ JAPIC） の デ ー タ ベ ー ス に 登 録 し 、 公 開 し た
（ http://www.clinicaltrials.jp/user/cteSearch.jsp, JapicCTI No.: 090956, 101028, 101301,
101356, 111585 お よ び 111685）。国 内 の 2 箇 所 の 大 学 に お い て 実 施 し た 競 技 者 か ら の 試
料採取における倫理審査は、各大学において実施し、承認を得た。また、全ての研究
工程は、三菱化学メディエンス株式会社倫理委員会の承認を得た。なお、本研究の投
与試験の対象者には、競技者を含まないこととし、研究結果の悪用またはドーピング
へ の 応 用 を 防 止 す る た め の 処 置 と し て 、全 て の 関 係 施 設 と は 守 秘 義 務 契 約 を 締 結 し た 。
試験に先立ち、すべての被験者に対して研究内容の詳細説明を実施し、被験者全員か
ら 書 面 で の 同 意 書 を 得 た 。 UGT2B17 遺 伝 子 解 析 用 の 血 液 試 料 は 、 EDTA 採 血 管 に よ り
採 取 し た 。採 取 し た 尿 試 料 お よ び 血 液 試 料 は 分 析 に 供 す る ま で −20 °C に 保 管 し た 。安
全配慮のため、投与試験中はバイタルサイン（血圧, 体温, 脈拍数）を監視し、投与
試験前後では心拍数を測定し血液の一般臨床検査を行った。
14
1.2.6.1
日本人競技者
男 性 被 験 者 群 と し て 、 競 技 ス ポ ー ツ を 行 う 255 名 の 日 本 人 男 子 大 学 生 （ 年 齢 : 20.3
± 1.3 才 , ボ デ ィ マ ス 指 数 （ body mass index: BMI） : 23.3 ± 2.1） を 対 象 と し た 。 男 性 被
験者の競技種目は、陸上、サッカー、バスケットボール、野球、バレーボールおよび
ダ ン ス ス ポ ー ツ で あ っ た 。 ま た 、 女 性 被 験 者 群 と し て は 、 競 技 ス ポ ー ツ を 行 う 256 名
の 日 本 人 女 子 大 学 生 （ 年 齢 ： 19.8 ± 0.9 才 , BMI: 21.8 ± 2.2） を 対 象 と し た 。 女 性 被 験
者の競技種目は、陸上、サッカー、バスケットボール、チアリーディング、バドミン
トン、野球、バレーボール、スキー、ライフセービング、フェンシング、ラクロス、
ソフトテニス、ハンドボール、剣道、ゴルフ、体操、ダンススポーツであった。試料
採取前の食事の制限は特に実施しなかったが、試料採取 3 日前からアルコール、医薬
品 、 サ プ リ メ ン ト の 摂 取 を 不 可 と し た 。 採 血 お よ び 採 尿 は 、 午 前 9 時 か ら 午 後 12 時
30 分 の 間 に 実 施 し た 。
1.2.6.2
Testosterone enanthate の 女 性 へ の 単 回 筋 肉 内 投 与 試 験
日 本 人 の 非 競 技 者 で あ る 42 名 の 日 本 人 女 性 が 、 無 作 為 公 募 に 対 し て 自 発 的 に 研 究
に 参 加 し た 。 UGT2B17 遺 伝 子 型 を 解 析 し た と こ ろ 、 28 名 が del/del 型 で あ り 13 名 が
del/ins 型 で あ っ た 。 ins/ins 型 は 1 名 の み で あ っ た 。 準 ラ ン ダ ム 化 に よ る 被 験 者 選 択
（ quasi-randomized selection）と 健 康 診 断 の 結 果 、10 名 の 健 常 日 本 人 女 性（ 年 齢 : 21 – 38
才 , BMI: 21.3 ± 1.9） が 投 与 試 験 に 参 加 し た 。 投 与 試 験 参 加 被 験 者 の UGT2B17 遺 伝 子
型 の 内 訳 は 、6 名 が del/del 型（ subjects-02, -03, -04, -06, -08 お よ び -10）、3 名 が del/ins
型 （ subjects-01, -05 お よ び -07）、 1 名 が ins/ins 型 （ subject-09） で あ っ た 。
次 に 、 100 mg の Testosterone enanthate（ 遊 離 testosterone と し て は 72 mg） を 、 空 腹
時 に 10 名 の 被 験 者 に 筋 肉 内 注 射（ intramuscular injection）し た 。尿 試 料 は 、投 与 前（ pre）、
投 与 後 1、2、3、4、6、8–9、10–11、12–13 お よ び 15–16 日 に 採 取 し た 。試 料 採 取 前 の
食事の制限は特に実施しなかったが、投与試験期間中のアルコール、医薬品（特に経
口 避 妊 薬 お よ び フ ィ ナ ス テ リ ド な ど の 内 因 性 ス テ ロ イ ド 代 謝 に 影 響 を 及 ぼ す も の ）、サ
プリメントの摂取および運動を不可とした。
1.3
1.3.1
結果および考察
UGT2B17 遺 伝 子 解 析
日 本 人 競 技 者 511 名 （ 255 名 の 男 性 お よ び 256 名 の 女 性 ） か ら 採 取 し た 血 液 試 料 を
用 い て 、UGT2B17 遺 伝 子 解 析 を 行 っ た 。PCR 反 応 産 物 の MultiNA MCE ® -202 に よ る 電
気 泳 動 像 の 例 を Figure 1-4 に 示 し た 。 一 般 に 、 ア ガ ロ ー ス ゲ ル 電 気 泳 動 で は バ ン ド に
歪みが出ることがあるが、マイクロチップ電気泳動により分離能の高い電気泳動分析
が可能であった。
15
UGT2B1 7
deletion
n mark er J
UGT2B15
5 marker G
UGT2B17
7 marker D
di
dd
dd
dd
dd
dd
ii
dd
di
dd
di
dd
dd
dd
dd
di
Figure 11-4. Typica l electropho
oresis data oof PCR pro ducts (dd: del/del,
d
di: del/ins, ii: ins/ins).
(marker J: 884 bp, maarker G: 32
29 bp, marker D: 136 bbp)
UGT2B 17 遺 伝 子 型 は 、3 つ の プ ラ イ マ ー（ markeer D、markeer J お よ び marker G）
）の PCR
増 幅 の 有 無 を 用 い て 判 定 し た 。 各 マ ー カ ー の 遺 伝 子 と の 位 置 関 係 を Figure 1-5 に 示 し
た
31 )
。
UG
GT2B17 (～150
0 kb)
UG
GT2B15
3’
5’
Exon 6
5 4
3 2 1
Exo
on 6
marker D
5 4
3 2 1
m
maker
G
UG
GT2B17 deletio
on
m
marker
J
marker J
Figuree 1-5. Gene--specific m arker locatiions 31 ) .
UGT2B 17 遺 伝 子 が 存 在 し て い る 場 合 に は 、 UGT
T2B17 の 5’側 の upstreeam 領 域 の 増 幅 産
物 （ maarker D） が 検 出 さ れ る 。 UGT2B
B17 遺 伝 子 （ 150 kb）
）を欠失して いる場合には、
UGT2B 17 欠 失 点 （ UGT2B15
5 の 3’末 端 1.2 kb の 領 域 ）の 増 幅 産 物（ m
marker J）が
が検出さ
れ る 。 UGT2B17 を 欠 失 し て い な い 場 合 に は 、 maarker J の 増 幅 は 無 い 。 ま た 、 marker
m
G
は UGT
T2B15 の exxon 1 領 域 の 増 幅 産 物 で あ り 、 PCR
P
反 応で の ゲ ノ ム の 存 在 を確 認 す る
た め の 指 標 と し た 。 以 上 のこ と か ら 、 次 の よ う に 遺 伝 子型 を 判 定 し た 。
16
UGT2B17 ホ モ 接 合 型 欠 失 del/del 型
: marker J の 検 出 お よ び marker D の 不 検 出
UGT2B17 ホ モ 接 合 型 挿 入 ins/ins 型
: marker J の 不 検 出 お よ び marker D の 検 出
UGT2B17 ヘ テ ロ del/ins 型
: marker J の 検 出 お よ び marker D の 検 出
そ の 結 果 、Table 1-1 に 示 す よ う に 、日 本 人 競 技 者 の del/del 型 は 、男 性 で 74.5%、女
性 で は 60.2%の 頻 度 で あ っ た 。del/ins 型 は 、男 性 が 24.3%で あ り 、女 性 は 37.1%で あ っ
た 。 ins/ins 型 は 、 男 性 が 3 人 （ 1.2%）、 女 性 が 7 人 （ 2.7%） で あ っ た 。 男 性 の del/del
型 頻 度 は 、 女 性 の そ れ と 比 較 し て 有 意 に 高 い 結 果 で あ っ た （ 帰 無 仮 説 H0 は 棄 却 さ れ
な か っ た 。 χ 2 = 12.0, 自 由 度 = 1, P < 0.01）。 日 本 人 競 技 者 の 遺 伝 子 型 分 布 は 、 ハ ー デ
ィ –ワ イ ン ベ ル ク 平 衡 の 法 則 か ら の 乖 離 は な か っ た（ 帰 無 仮 説 H 0 は 棄 却 さ れ な か っ た 。
男 性 χ 2 = 0.7, 女 性 χ 2 = 2.9, 自 由 度 = 1）。
Table 1-1. UGT2B17 genotype distribution
Origin
Number
Rate%
Gender
del/del
Asian
(Japanese)
Male
Asian
(Japanese)
Female
Asian
(Koreans)
Male
Caucasian
(Swedes)
Male
Caucasian
(pubertal boys)
Male
Reference
del/ins
ins/ins
190
62
3
74.5%
24.3%
1.2%
154
95
7
60.2%
37.1%
2.7%
44
15
7
66.7%
22.7%
10.6%
8
34
44
9.3%
39.5%
51.2%
10
52
54
8.6%
44.8%
46.6%
[32]
[32]
[39]
ス ウ ェ ー デ ン 人 男 性 お よ び 思 春 期 の コ ー カ サ ス 人 男 性 の del/del 型 は 、そ れ ぞ れ 9.3%
お よ び 8.6%で あ る の に 対 し て
32 ,3 9)
、 日 本 人 男 性 の そ れ は 、 74.5%と 非 常 に 高 い 割 合 で
あった。この結果は、日本人と同じく東アジアのモンゴロイド人種を中心とする韓国
に お い て 、 66.7%と 高 い 割 合 で あ る 結 果 と も 一 致 し た
32 )
。注目すべき点は、同じ東ア
ジ ア 人 で あ る 韓 国 人 男 性 の ins/ins 型 は 10.6%で あ る の に 対 し て 、日 本 人 男 性 で は 、1.0%
と 10 分 の 1 未 満 に す ぎ な い 点 で あ る 。こ の 理 由 の 一 つ と し て 、日 本 の 地 理 的 な 要 因 が
考 え ら れ る 。 す な わ ち 、 元 来 は 東 ア ジ ア 地 域 の モ ン ゴ ロ イ ド 人 種 に お い て は 、 del/del
型が主流であるが、韓国は大陸と陸続きであり、欧州地域とは歴史的に密接な交流が
あったのに対して、日本は島国であり、遺伝的に独立していたことが起因している可
能性も考えられる。
17
1.3.2
Testosterone 関 連 代 謝 物 の 尿 中 プ ロ フ ァ イ ル
GC–MS 測 定 に よ り 得 ら れ た SIM ク ロ マ ト グ ラ ム を 、 Figure 1-6 に 示 し た 。 TMS 化
ス テ ロ イ ド の 定 量 用 イ オ ン 、 I.S.の イ オ ン お よ び t R を Table 1-2 に 示 し た 。 ま た 、 本 法
で は 酵 素 加 水 分 解 の 成 否 の 確 認 用 に d 4 -A-g を 添 加 し た 。d 4 -A の 検 出 を モ ニ タ ー す る た
め 、 d 4 -A-bis-TMS（ MW = 438） の イ オ ン m/z 438（ M + ） も あ わ せ て 設 定 し た 。
Abundance
Ion 432.00 (431.70 to 432.70): 9301002.D\data.ms
70000
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
8.00
Time>
Abundance
T
DHEA
E
9.00
10.00
11.00
12.00
13.00
14.00
15.00
Ion 434.00 (433.70 to 434.70): 9301002.D\data.ms
A
700000
600000
500000
400000
300000
200000
100000
0
8.00
9.00
10.00
Et
11.00
12.00
13.00
14.00
15.00
Time>
Abundance
Ion 241.00 (240.70 to 241.70): 9301002.D\data.ms
120000
100000
80000
60000
40000
20000
0
8.00
5β-diol
5α-diol
9.00
10.00
11.00
12.00
13.00
14.00
15.00
Time>
Abundance
Ion 446.00 (445.70 to 446.70): 9301002.D\data.ms
MT
25000
20000
15000
10000
5000
0
8.00
9.00
10.00
11.00
12.00
13.00
14.00
15.00
Time>
Figure 1-6. GC–MS chromatograms of steroid TMS derivatives.
18
Table 1-2. Monitoring ions of target steroids and their retention times
Steroid
Derivative
Qualifier ion
tR (min)
Testosterone
Testosterone-bis-TMS
m/z 432 (M+)
13.5
Epitestosterone
Epitestosterone-bis-TMS
m/z 432 (M+)
12.6
DHEA
DHEA-bis-TMS
m/z 432 (M+)
12.1
A
Androsterone-bis-TMS
+
m/z 434 (M )
+
10.7
Et
Etiocholanolone-bis-TMS
m/z 434 (M )
10.9
5α-diol
5α-diol-bis-TMS
+
m/z 241 (M ̶ CH3･ ̶ 2TMSOH)
11.1
5β-diol
5β-diol-bis-TMS
m/z 241 (M+ ̶ CH3･ ̶ 2TMSOH)
11.3
d 3 -T
d 3 -T-bis-TMS
m/z 435 (M+)
13.5
d 3 -E
d 3 -E-bis-TMS
m/z 435 (M+)
12.6
d 6 -DHEA
d 6 -DHEA-bis-TMS
m/z 438 (M )
d 5 -Et
d 5 -Et-bis-TMS
m/z 439 (M+)
10.9
d 3 -5α-diol
d 3 -5α-diol-bis-TMS
+
m/z 244 (M ̶ CH3･ ̶ 2TMSOH)
11.1
d 5 -5β-diol
d 5 -5β-diol-bis-TMS
m/z 246 (M+ ̶ CH3･ ̶ 2TMSOH)
11.2
MT
MT-bis-TMS
+
m/z 446 (M )
15.3
d 4 -A
d 4 -A-bis-TMS
Internal standard (I.S.)
+
+
m/z 438 (M )
12.0
10.7
本測定法は、ドーピング検査に用いられている標準法であるため、他施設で開発し
た分析法の導入時のメソッドバリデーションの詳細は割愛する。1 例を示すと、
Testosterone の 直 線 性 は 0.5 ng/mL か ら 16 ng/mL で R 2 =0.9997、 正 確 度 （ accuracy） は
2.2 – 9.6%と 良 好 で あ っ た 。 同 様 に 、 他 の 測 定 対 象 ス テ ロ イ ド の Accuracy は 、 2.9 – –
20.4%で あ り 、 良 好 で あ っ た 。 ま た 、 す べ て の 尿 試 料 の 測 定 に あ た っ て は 、 精 度 管 理
用 試 料 （ quality control sample: QC sample） も 同 時 に 測 定 し て 精 度 管 理 を 行 っ た 。 QC
sample に お け る 対 象 ス テ ロ イ ド 濃 度 は 、 精 度 管 理 基 準 内 に あ り 、 Testosterone 濃 度 の
日 間 再 現 性 は 、 1.6%（ 70 ng/mL） か ら 10.1%（ 0.5 ng/mL） と 良 好 に 測 定 が 行 わ れ た 。
尿中成分の濃度は、尿量による影響を受けるため、一般的にクレアチニン補正や比重
補 正 を 行 う 。本 章 で は 、ド ー ピ ン グ 検 査 で 採 用 さ れ て い る 尿 比 重（ specific gravity: S.G.）
1.020 を 基 準 と し て 、 次 式 （ 1） に よ り 補 正 し た 濃 度 を デ ー タ 解 析 に 用 い た
Concentration co r r e ct ed
=
(1.020− 1)
(S.G.sample − 1)
× Concentration me a su r e d
20 )
。
（ 1）
1 名 の del/del 型 の 男 性 は 、 ド ー ピ ン グ 禁 止 薬 物 が 検 出 さ れ た た め 統 計 解 析 デ ー タ か
ら 除 外 し た 。 女 性 群 に お い て 、 2 名 の del/del 型 競 技 者 の Testosterone、 5α-diol お よ び
5β-diol に つ い て は 、夾 雑 ピ ー ク が 検 出 さ れ た た め 、統 計 解 析 デ ー タ か ら 除 外 し た 。コ
ル モ ゴ ロ フ –ス ミ ル ノ フ 検 定 の 結 果 、非 正 規 分 布 を 示 し た た め 統 計 解 析 は ノ ン パ ラ メ ト
リ ッ ク 法 に よ り 行 っ た 。Figure 1-7 に 、UGT2B17 遺 伝 子 型 別 の steroid profile の Box-plot
を 示 し た 。 ins/ins 型 は 、 男 性 で 3 名 、 女 性 で 7 名 の み で あ っ た た め 、 有 意 差 検 定 に お
け る del/del 型 の 比 較 対 象 群 は 、 del/ins 型 と ins/ins 型 を 含 め る こ と と し た （ del/ins +
ins/ins も し く は others と 表 記 ）。
19
Testosterone (ng/ml)
90
80
Epitestosterone (ng/ml)
120
**
**
**
70
**
60
**
NS
**
100
NS
80
50
60
40
40
30
20
20
10
0
0
del/del
M
others
M
del/del
F
del/del
M
others
F
5α-diol (ng/ml)
250
others
M
del/del
F
others
F
5β-diol (ng/ml)
180
**
NS
160
**
200
**
**
**
**
140
NS
120
150
100
80
100
60
40
50
20
0
0
del/del
M
others
M
del/del
F
others
F
del/del
M
del/del
F
others
F
5α-/5β-diol
T/E
8
6
5
others
M
NS
**
*
**
*
7
**
6
**
4
**
5
4
3
3
2
2
1
1
0
0
del/del
M
others
M
del/del
F
others
F
del/del
M
others
M
del/del
F
others
F
Figure 1-7. Box plots of urinary steroid concentrations (i.e. aglycones) and the
ratios. The whiskers indicate the 5 t h and 95 t h percentiles.
**P < 0.0001. *P < 0.05. NS: not significant. others: del/ins + ins/ins.
20
Table 1-3 に 示 す よ う に 、日 本 人 男 性 競 技 者 に お い て 、del/ins 型（ median: 33.9 ng/mL）
お よ び ins/ins 型（ median: 45.8 ng/mL）の 尿 中 Testosterone 濃 度 は 、del/del 型（ median:
4.4 ng/mL） の そ れ と 比 較 し て 有 意 に 高 い 結 果 を 示 し た （ P < 0.0001）。 一 方 、 del/ins 型
（ median: 31.7 ng/mL） お よ び ins/ins 型 （ median: 13.9 ng/mL） の 尿 中 Epitestosterone
濃 度 は 、 del/del 型 （ median: 26.7 ng/mL)の そ れ と 比 較 し て 有 意 差 は 認 め な か っ た （ P >
0.05）。 del/del 型 （ median: 0.16） の T/E は 、 del/ins 型 （ median: 1.1） お よ び ins/ins 型
（ median: 3.3） の そ れ と 比 較 し て 有 意 に 低 い 結 果 を 示 し た （ P < 0.0001）。 Juul ら は 、
コ ー カ サ ス 人 種 の 思 春 期 男 性 に お い て 、del/del、del/ins お よ び ins/ins 型 の T/E 平 均 は 、
そ れ ぞ れ 0.29、 1.4 お よ び 2.1 と 報 告 し た
39 )
。今回、日本人男性競技者においても同
様 の 結 果 を 示 し た 。 WADA の 設 定 し て い る T/E>4 を 示 し た の は 、 del/ins 型 2 名 （ 4.5
お よ び 5.0） で あ っ た 。 こ の 2 例 に つ い て は 、 1.2.3 項 に 示 し た GC–IRMS 分 析 を 実 施
し た 結 果 、内 因 性 の T/E 高 値 と 判 断 で き た 。日 本 人 男 性 の 74.5%を 占 め る del/del 型 の
T/E 基 準 上 限 値 は 、 95% CI か ら 算 出 す る と 0.5 が 妥 当 と 考 え ら れ 、 WADA の 設 定 す る
T/E>4 と は 大 き な 乖 離 で あ っ た 。Table 1-4 に 示 す よ う に 、女 性 競 技 者 に お い て は 、del/ins
型（ median: 5.2 ng/mL）お よ び ins/ins 型（ median: 9.5 ng/mL）の 尿 中 Testosterone 濃 度
は 、 del/del 型 （ median: 1.4 ng/mL） の そ れ と 比 較 し て 有 意 に 高 い 結 果 を 示 し た （ P <
0.0001）。 一 方 、 del/ins 型 （ median: 9.2 ng/mL） お よ び ins/ins 型 （ median: 5.8 ng/mL）
の 尿 中 Epitestosterone 濃 度 は 、 del/del 型 （ median: 10.1 ng/mL） の そ れ と 比 較 し て 有 意
差 は 認 め な か っ た（ P > 0.05）。男 性 同 様 に del/del 型（ median: 0.14）の T/E は 、del/ins
型 （ median: 0.6） お よ び ins/ins 型 （ median: 1.7） の そ れ と 比 較 し て 有 意 に 低 い 結 果 を
示 し た（ P < 0.0001）。WADA の 設 定 し て い る T/E>4 を 示 し た 女 性 競 技 者 は い な か っ た
が 、 ins/ins 型 の 女 性 競 技 者 が 最 大 で 3.4 を 示 し た 。
本 研 究 内 に お い て 、 95% CI を も と に UGT2B17 遺 伝 子 型 別 の T/E 基 準 上 限 値 を 設 定
し た 。す な わ ち 、日 本 人 女 性 に つ い て は 0.4（ del/del）、1.9（ del/ins）お よ び 3.2（ ins/ins）
と 設 定 し た 。 WADA の 設 定 す る Testosterone 製 剤 に よ る ド ー ピ ン グ 判 定 基 準 に は 、 世
界 統 一 基 準 T/E>4 で は な く 、UGT2B17 遺 伝 子 型 別 の T/E 基 準 値 を 適 用 す る こ と が 妥 当
であることが明らかとなった。
21
Table 1-3. Urinary steroid concentrations (i.e. aglycones) and the ratios
classified according to UGT2B17 genotypes in Japanese male student athletes
Testosterone Epitestosterone
(ng/ml)
(ng/ml)
A
(ng/ml)
Et
(ng/ml)
5α-diol
(ng/ml)
5β-diol
(ng/ml)
DHEA
(ng/ml)
del/del Male
n
189
189
189
189
189
189
189
Mean
4.8
31.2
2386
1364
55.1
33.2
34.4
Median
4.4
26.7
2240
1249
49.3
30.1
30.6
Maximum
32.6
107
7772
6168
235
154
143
Minimum
0.6
3.5
701
330
15
9
9
25th percentile
3.5
19.0
1746
956
37
21
24
75th percentile
95 % CI
del/ins Male
5.4
38.9
2732
1565
66
40
41
2.1-9.1
7.4-75.1
1113-4765
566-2688
21.6-121
11.0-71.6
13.4-77.1
n
Mean
62
62
62
62
62
62
62
37.7
33.9
2532
1648
56.4
65.0
36.8
30.3
Median
33.9
31.7
2337
1508
50.0
63.3
Maximum
76.6
85.6
6548
6792
132
169
132
Minimum
4.3
7.4
763
385
20.6
19.0
11.9
25th percentile
26.2
20.6
1731
1161
36.8
42.7
23.2
75th percentile
95 % CI
ins/ins Male
48.3
42.7
3111
2027
70.7
84.8
46.3
6.6-72.1
9.9-70.0
955-4753
522-3027
21.9-121
24.8-118
12.3-74.9
n
3
3
3
3
3
3
3
Mean
46.7
15.8
1957
1243
36.4
61.2
24.1
Median
45.8
13.9
1837
1061
40.2
41.2
24.9
Maximum
55.5
23.0
2412
1751
41.7
104
28.6
Minimum
P value
38.7
10.4
1622
918
27.2
38.2
18.9
<0.0001
NS
NS
<0.01
NS
<0.0001
NS
T/E
A/Et
5α-/5β-diol
5α-diol/E
5β-diol/E
A/T
n
189
189
189
189
189
189
Mean
0.19
1.9
1.8
2.2
1.3
548
Median
0.16
1.9
1.7
1.8
1.0
509
del/del Male
Maximum
0.94
4.6
4.4
10.1
6.2
2387
Minimum
0.03
0.6
0.4
0.5
0.2
68.6
25th percentile
0.12
1.4
1.4
1.3
0.7
399
75th percentile
95 % CI
del/ins Male
0.22
2.2
2.1
2.6
1.5
635
0.07-0.49
0.8-3.6
0.9-3.1
0.6-6.2
0.4-4.5
260-978
n
62
62
62
62
62
62
Mean
1.4
1.6
0.9
2.0
2.3
87.8
63.2
Median
1.1
1.6
0.9
1.6
2.1
Maximum
5.0
3.3
2.2
4.7
6.6
749
Minimum
0.10
0.87
0.5
0.6
0.7
24.7
25th percentile
0.8
1.3
0.67
1.2
1.4
50.5
75th percentile
95 % CI
ins/ins Male
1.7
1.9
1.1
2.5
2.9
86.1
0.2-4.1
0.9-2.8
0.5-1.9
0.8-4.6
0.7-5.3
32.9-335
n
Mean
3
3
3
3
3
3
3.2
1.7
0.7
2.5
3.7
42.5
Median
3.3
1.8
0.7
2.6
3.7
41.9
Maximum
3.7
2.3
1.0
3.3
4.3
52.6
Minimum
P value
2.4
1.0
0.4
1.7
3.2
33.1
<0.0001
<0.01
<0.0001
NS
<0.0001
<0.0001
P value: del/del vs. del/ins + ins/ins. NS: not significant.
22
Table 1-4. Urinary steroid concentrations (i.e. aglycones) and the ratios
classified according to UGT2B17 genotypes in Japanese female student athletes
Testosterone Epitestosterone
(ng/ml)
(ng/ml)
A
(ng/ml)
Et
(ng/ml)
5α-diol
(ng/ml)
5β-diol
(ng/ml)
DHEA
(ng/ml)
del/del Female
n
153
154
154
154
153
153
154
Mean
1.5
11.5
2002
1955
20.4
21.0
41.9
Median
1.4
10.1
1819
1729
18.2
17.5
37.8
Maximum
4.7
48.6
5957
5515
85.1
93.9
148
Minimum
0.5
2.4
478
377
7.2
5.7
8.9
25th percentile
1.1
7.0
1239
1259
13.6
11.6
25.9
75th percentile
95 % CI
del/ins Female
1.7
13.7
2473
2570
24.5
25.5
49.6
0.6-3.0
3.5-32.2
561-4259
693-4643
8.7-48.1
6.3-53.5
15.3-98.2
n
95
95
95
95
95
95
95
Mean
5.9
11.1
2064
2055
23.7
27.1
39.9
Median
5.2
9.2
1806
1800
19.5
22.7
35.1
Maximum
19.9
55.2
6853
5036
81.6
79.8
95.5
Minimum
0.6
1.7
553
727
5.8
6.5
12.1
25th percentile
1.4
6.0
1162
1287
14.2
15.0
25.4
75th percentile
95 % CI
ins/ins Female
8.8
14.2
2570
2617
28.7
34.4
53.1
0.8-16.3
2.9-33.0
667-5182
791-4570
7.4-60.8
8.8-72.5
15.0-81.1
n
Mean
7
7
7
7
7
7
7
10.1
7.0
1654
1782
23.1
46.4
37.0
Median
9.5
5.8
1364
1549
18.5
35.6
39.9
Maximum
13.7
15.5
2967
3750
47.6
134
56.2
Minimum
6.0
3.2
1058
797
14.6
12.9
19.4
25th percentile
8.5
4.0
1157
1014
15.4
22.9
25.5
75th percentile
95 % CI
P value
12.1
8.5
1935
2177
25.1
48.2
46.3
6.3-13.6
3.2-14.8
1064-2888
821-3568
14.7-44.6
13.2-122
19.9-55.1
<0.0001
NS
NS
NS
NS
<0.01
NS
T/E
A/Et
5α-/5β-diol
5α-diol/E
5β-diol/E
A/T
n
153
154
152
153
153
153
Mean
0.16
1.1
1.2
2.1
2.3
1437
Median
0.14
1.0
1.1
1.9
1.8
1398
Maximum
0.8
3.1
6.9
12.4
16.0
3483
Minimum
0.03
0.3
0.2
0.4
0.4
284
25th percentile
0.09
0.8
0.8
1.3
1.1
949
75th percentile
95 % CI
del/ins Female
0.2
1.4
1.4
2.8
2.8
1881
0.05-0.4
0.4-2.5
0.4-2.4
0.7-4.0
0.5-5.8
473-2807
del/del Female
n
95
95
95
95
95
95
Mean
0.6
1.1
1.0
2.8
3.1
713
Median
0.6
1.0
0.9
2.2
2.8
337
Maximum
2.6
3.2
2.8
20.3
10.7
3430
Minimum
0.05
0.4
0.3
0.5
0.6
109
25th percentile
0.2
0.7
0.7
1.6
1.8
218
75th percentile
95 % CI
ins/ins Female
1.0
1.4
1.1
3.5
3.8
1024
0.06-1.9
0.4-2.7
0.5-1.9
0.7-6.2
0.7-7.4
120-2434
n
Mean
7
7
7
7
7
7
1.8
1.0
0.7
4.0
7.1
165
Median
1.7
1.0
0.5
3.3
8.7
143
Maximum
3.4
1.5
1.1
8.8
11.2
236
Minimum
0.8
0.6
0.4
1.3
1.2
95.0
25th percentile
1.2
0.8
0.4
3.1
5.4
134
75th percentile
95 % CI
P value
2.1
1.2
0.9
4.2
9.0
206
0.8-3.2
0.6-1.5
0.4-1.1
1.6-8.2
1.5-10.9
100-236
<0.0001
NS
<0.01
<0.01
<0.0001
<0.0001
P value: del/del vs. del/ins + ins/ins. NS: not significant.
23
Testosterone の 活 性 代 謝 物 で あ る 5α-Dihydrotestosterone（ DHT）は 、WADA 禁 止 物 質
で も あ る 。 DHT を 使 用 し た 場 合 、 尿 中 に は 5α型 代 謝 物 が 上 昇 す る こ と か ら 、 5α-diol
濃 度 と 5β-diol の 尿 中 濃 度 比 （ 5α-/5β-diol） は 、 DHT ド ー ピ ン グ の 検 出 の た め の 最 も
重要なパラメーターである
40 )
。Table 1-3 に 示 し た よ う に 、日 本 人 男 性 競 技 者 に お い て 、
del/ins 型 （ median: 50.0 ng/mL） お よ び ins/ins 型 （ median: 40.2 ng/mL） の 尿 中 5α-diol
濃 度 は 、del/del 型（ median: 49.3 ng/mL）の そ れ と 比 較 し て 有 意 差 は 認 め な か っ た（ P >
0.05）。 そ れ と は 対 照 的 に 、 del/ins 型 （ median: 63.3 ng/mL） お よ び ins/ins 型 （ median:
41.2 ng/mL） の 尿 中 5β-diol 濃 度 は 、 del/del 型 （ median: 30.1 ng/mL)の そ れ と 比 較 し て
有 意 に 高 い 値 を 示 し た（ P < 0.0001）。del/del 型（ median: 1.7）の 5α-/5β-diol は 、del/ins
型 （ median: 0.9） お よ び ins/ins 型 （ median: 0.7） の そ れ と 比 較 し て 有 意 に 高 い 結 果 を
示 し た（ P < 0.0001）。Table 1-4 に 示 し た よ う に 、日 本 人 女 性 競 技 者 に お い て は 、del/ins
型（ median: 19.5 ng/mL）お よ び ins/ins 型（ median: 18.5 ng/mL）の 尿 中 5α-diol 濃 度 は 、
del/del 型（ median: 18.2 ng/mL）の そ れ と 比 較 し て 有 意 差 は 認 め な か っ た の に 対 し て（ P
> 0.05）、 del/ins 型 （ median: 22.7 ng/mL） お よ び ins/ins 型 （ median: 35.6 ng/mL） の 尿
中 5β-diol 濃 度 は 、 del/del 型 （ median: 17.5 ng/mL） の そ れ と 比 較 し て 有 意 に 高 い 値 を
示 し た（ P < 0.01）。del/del 型（ median: 1.1）の 5α-/5β-diol は 、del/ins 型（ median: 0.9）
お よ び ins/ins 型（ median: 0.5）の そ れ と 比 較 し て 有 意 に 低 い 結 果 を 示 し た（ P < 0.01）。
こ の よ う に 、日 本 人 競 技 者 に お い て 、del/del 型 の 5α-/5β-diol は 、del/ins 型 お よ び ins/ins
型 の そ れ と 比 較 し て 、男 女 と も に 有 意 に 高 い 結 果 で あ っ た 。Strahm ら は 、日 本 人 の サ
ッ カ ー 選 手 の 5α-/5β-diol（ median: 0.9） が 、 コ ー カ サ ス 人 種 （ median: 0.4） の そ れ と
比較して有意に高いことを示した
23 ）
。 そ の 理 由 の 一 つ と し て 、 5α-reductase 活 性 が ア
ジ ア 人 で は コ ー カ サ ス 人 種 よ り も 高 い 可 能 性 が あ る と 報 告 し た 。 一 方 、 Juul ら は 、 コ
ー カ サ ス 人 種 の 5α-/5β-diol は 、 del/del 型 が ins/ins 型 と 比 較 し て 有 意 に 高 い こ と を 報
告している
39 )
。 こ れ ら の 事 象 は 、 Sten ら
30 )
に よ る 5αお よ び 5β型 ス テ ロ イ ド の UGT
活 性 に 関 す る 報 告 に よ り 説 明 が 可 能 で あ る 。 Figure 1-1 に 示 す よ う に 、 UGT2B17 は 、
5α-diol お よ び 5β-diol 両 者 の 17 位 の 水 酸 基 に 対 す る グ ル ク ロ ン 酸 抱 合 に 強 く 作 用 す る 。
UGT2B15 は 、 5α-diol の 17 位 の 水 酸 基 に 強 く 作 用 す る が 、 5β-diol の 17 位 の 水 酸 基 に
対 し て の 作 用 は わ ず か で あ る 。さ ら に 、UGT2B7 は 、5α-diol の 3 位 の 水 酸 基 の グ ル ク
ロ ン 酸 抱 合 に 選 択 的 に 作 用 し 、 そ の 活 性 は 5β-diol の そ れ よ り も 高 い 。 こ の よ う に 、
UGT2B17 遺 伝 子 の 欠 失 は 、5β-diol の 17 位 の グ ル ク ロ ン 酸 抱 合 に 影 響 を 与 え る と 考 え
ら れ る 。 そ の 結 果 、 del/del 型 の 尿 中 5β-diol 濃 度 （ す な わ ち 5β-diol -17-glucuronide）
が 、 ins/ins お よ び del/ins 型 と 比 較 し て 有 意 に 低 い と 考 え ら れ る 。
一 方 、尿 中 5α-diol 濃 度 に 関 し て は 、UGT2B17 遺 伝 子 の 欠 失 で も UGT2B15 遺 伝 子 の
関 与 が あ る た め UGT2B17 遺 伝 子 型 に よ ら ず 有 意 差 は 認 め ず 、 del/del 型 の 5α-/5β-diol
は 、del/ins 型 お よ び ins/ins 型 と 比 較 し て 有 意 に 高 い と 考 え る の が 妥 当 と 云 え る 。た だ
し 、 最 終 的 な 結 論 と す る た め に は 、 尿 中 の 遊 離 型 5α-diol お よ び 5β-diol、 さ ら に 、 そ
れ ぞ れ の 3-glucuronide お よ び 17-glucuronide 濃 度 レ ベ ル と 血 中 の 遊 離 型 5α-diol お よ
24
び 5β-diol 濃 度 の 比 較 を 行 う 追 加 の 検 討 が 必 要 で あ る 。
1.3.3
1.3.3.1
Testosterone enanthate の 女 性 へ の 単 回 筋 肉 内 投 与 試 験
Testosterone 関 連 代 謝 物 の 尿 中 プ ロ フ ァ イ ル
100 mg の Testosterone enanthate を 、6 名 の del/del 型 、3 名 の del/ins 型 お よ び 1 名 の
ins/ins 型 の 日 本 人 女 性 被 験 者 に 筋 肉 内 投 与 し た 。 Figure 1-8 に 示 す よ う に 、 投 与 後 、 6
名 の del/del 型 の 最 高 尿 中 Testosterone 濃 度 （ 11.9 – 29.2 ng/mL） は 、 投 与 前 （ 0.5 – 2.6
ng/mL）と 比 較 し て 有 意 に 上 昇 し た（ P < 0.05）。del/ins お よ び ins/ins 型 で は 843 – 1607%
上 昇 し た 。 し か し な が ら 、 10 名 す べ て の 被 験 者 に お い て 、 遺 伝 子 型 に か か わ ら ず 、
Testosterone 濃 度 は 、WADA の 設 定 す る GC–IRMS 実 施 基 準 値 200 ng/mL に 到 達 し な か
っ た 。Figure 1-8 に 示 す よ う に 、投 与 後 、尿 中 Epitestosterone の 増 減 が 観 察 さ れ た 。エ
チ ニ ル エ ス ト ラ ジ オ ー ル の よ う な 経 口 避 妊 薬 の 使 用 が 尿 中 Epitestosterone の 排 泄 を 低
下させることが報告されている
35 )
。し か し 、す べ て の 被 験 者 は 、経 口 避 妊 薬 を 服 用 し
ていない。本研究において同一被験者におけるプラセボ試験を実施しなかったが、
Epitestosterone 濃 度 の 月 経 周 期 に 応 じ た 日 間 変 動
35 )
、も し く は 、Testosterone の 投 与 に
よ る 影 響 と 考 え ら れ る 。6 名 の del/del 型 の 最 大 T/E（ 0.6 – 1.3）は 、投 与 前（ 0.07 – 0.2）
と 比 較 し て 有 意 に 上 昇 し た も の の （ P < 0.05）、 WADA の 設 定 し た 閾 値 4 に は 6 名 と も
到 達 し な か っ た 。 こ の よ う に 、 日 本 人 競 技 者 の 大 多 数 を 占 め る del/del 型 に お い て 、
T/E>4 や T>200 ng/mL と い う WADA の 設 定 し た 統 一 基 準 値 で は 、 Testosterone 製 剤 に
よ る ド ー ピ ン グ を 検 知 す る こ と が 困 難 で あ っ た 。ins/ins 型（ subject-09）に お い て 、T/E
は 、投 与 前 0.8 か ら 投 与 後 3 日 目 で 7.1 ま で 上 昇 し た 。del/ins 型 に お い て は 、subject-01、
subject-05 お よ び subject-07 の 投 与 前 の T/E は 、そ れ ぞ れ 1.0、0.2 お よ び 0.5 で あ っ た
の に 対 し て 、 投 与 後 は 、 そ れ ぞ れ 最 大 で 3.9、 1.0 お よ び 5.6 ま で 上 昇 し た 。 注 目 す べ
き 点 は 、 1 例 （ del/ins, subject-05） に お い て 、 Testosterone 濃 度 お よ び T/E の 上 昇 が 予
想 さ れ た ほ ど の 顕 著 な 上 昇 を 示 し て い な い 点 で あ る 。Ekström ら は 、phosphodiesterase
7（ PDE7） は cAMP を 特 異 的 に 分 解 す る 酵 素 で あ る が 、 Testosterone enanthate か ら 遊
離 Testosterone へ の 変 換 が PDE7B 遺 伝 子 多 型 に 関 係 す る こ と を 、最 近 報 告 し た
41 )
。日
本 人 に お け る PDE7B 遺 伝 子 多 型 の 分 布 は 明 ら か と な っ て い な い が 、 本 研 究 に お い て
Testosterone enanthate の 投 与 試 験 に 参 加 し た 被 験 者 （ 例 え ば subject-05） の PDE7B 遺
伝 子 多 型 の 違 い が 、 尿 中 Testosterone 濃 度 お よ び T/E に 大 き く 影 響 し て い る 可 能 性 も
考えられる。
25
del/del
Testosterone
Testosterone
160
35.0
140
30.0
120
01
05
07
09
100
80
60
Conc. (ng/ml)
Conc. (ng/ml)
del/ins , ins/ins
40
02
03
04
06
08
10
25.0
20.0
15.0
10.0
5.0
20
0.0
0
0
2
4
6
8
10
12
14
0
16
2
4
6
del/del
Epitestosterone
60
60
50
50
40
01
05
07
09
30
20
Conc. (ng/ml)
Conc. (ng/ml)
del/ins , ins/ins
8
10
12
14
16
Day
Day
10
Epitestosterone
02
03
04
06
08
10
40
30
20
10
0
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0
2
4
6
Day
del/ins , ins/ins
8
10
12
14
16
Day
del/del
T/E
8.0
T/E
1.5
7.0
02
03
04
06
08
10
5.0
WADA Threshold
4.0
3.0
01
05
07
09
1.0
Ratio
Ratio
6.0
0.5
2.0
1.0
0.0
0.0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0
Day
2
4
6
8
10
12
14
16
Day
Figure 1-8. Change in the urinary concentrations of testosterone, epitestosterone (i.e.
aglycones) and T/E after the administration of testosterone enanthate.
del/del: subjects-02, -03, -04, -06, -08 and -10. del/ins: subjects-01, -05 and -07. ins/ins:
subject-09.
26
次 に 、Figure 1-9 お よ び Figure 1-10 に 示 す よ う に 、Testosterone の 代 謝 物 A、Et、5α-diol
お よ び 5β-diol の 濃 度 は 、す べ て の 遺 伝 子 型 の 被 験 者 10 名 に お い て 有 意 に 上 昇 し た（ P
< 0.05, 投 与 3 日 目 ）。A も し く は Et の 濃 度 が WADA の 設 定 し た GC–IRMS 実 施 基 準 閾
値 で あ る 10000 ng/mL に 到 達 し た の は 、 2 名 の del/ins 型 被 験 者 （ subject-01 お よ び
subject-07）に お い て の み で あ っ た 。6 名 す べ て の del/del 型 被 験 者 に お い て 、投 与 前 と
比 較 し て 投 与 後 3 日 目 で 5α-/5β-diol が 優 位 に 減 少 し た （ P < 0.05）。 1.3.2 項 の 結 果 か
ら 、del/del 型 の 5β-diol の glucuronide は 、5α-diol の そ れ よ り 低 値 を 示 す と 予 想 さ れ た
が
30 )
、Testosterone enanthate 投 与 後 の 5α-/5β-diol は 、減 少 傾 向 を 示 し た（ Figure 1-10）。
3-oxo-4-ene-17β-hydroxy steroid の 第 I 相 代 謝 に 関 し て は 、 5α型 代 謝 よ り も 5β型 代 謝 が
優 位 で あ る こ と が 知 ら れ て い る 25 ) 。Testosterone enanthate 投 与 後 に 第 I 相 代 謝 に お い て 、
5β型 代 謝 が 優 位 に 進 行 し た こ と で 、 第 ΙΙ相 代 謝 で あ る グ ル ク ロ ン 酸 抱 合 で は 、 5β型 よ
り 5α型 が 優 位 で あ っ て も 最 終 的 に 5β-diol（ glucuronide） の 尿 中 濃 度 が 5α-diol
（ glucuronide） よ り も 高 値 と な り 、 5α-/5β-diol 比 が 減 少 し た も の と 考 え ら れ る 。
Testosterone 製 剤 に よ る ド ー ピ ン グ 検 出 用 の パ ラ メ ー タ ー と し て は 、 他 に
5α-diol/Epitestosterone（ 5α-diol/E）、 5β-diol/Epitestosterone（ 5β-diol/E） お よ び
A/Testosterone（ A/T） が あ る
20 )
。 Testosterone enanthate 投 与 後 に 、 こ れ ら の パ ラ メ ー
タ ー 値 も 上 昇 し た が 、Table 1-3 お よ び Table 1-4 に 示 し た よ う に 、こ れ ら の パ ラ メ ー タ
ー は 、 日 本 人 競 技 者 に お い て そ の 個 人 差 が 非 常 に 大 き い 。 故 に 、 5α-diol/E、 5β-diol/E
お よ び A/T に つ い て は 、統 一 基 準 値 を 使 用 し て の 検 知 よ り も 個 人 変 動 で の Testosterone
ドーピング検知に有効なパラメーターであると考えられる。
27
del/del
A
A
12000
12000
10000
10000
8000
01
05
6000
07
09
4000
Conc. (ng/ml)
Conc. (ng/ml)
del/ins , ins/ins
02
03
8000
04
6000
06
08
4000
10
2000
2000
0
0
0
2
4
6
8
10
12
14
0
16
2
4
6
del/ins , ins/ins
del/del
Et
18000
12
14
16
Et
5000
12000
01
10000
05
8000
07
6000
09
Conc. (ng/ml)
14000
Conc. (ng/ml)
10
6000
16000
4000
02
4000
03
04
3000
06
08
2000
10
1000
2000
0
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0
2
4
6
Day
del/ins , ins/ins
8
10
12
14
16
Day
del/del
A/Et
3.5
4.0
3.0
3.5
2.5
01
2.0
05
1.5
07
Ratio
Ratio
8
Day
Day
09
1.0
A/Et
3.0
02
2.5
03
04
2.0
06
1.5
08
1.0
0.5
10
0.5
0.0
0.0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0
Day
2
4
6
8
10
12
14
16
Day
Figure 1-9. Change in the urinary concentrations of A, Et (i.e. aglycones) and A/E after the
administration of testosterone enanthate.
del/del: subjects-02, -03, -04, -06, -08 and -10. del/ins: subjects-01, -05 and -07. ins/ins:
subject-09
28
del/del
5α-diol
5α-diol
700
300
600
250
500
Conc. (ng/ml)
Conc. (ng/ml)
del/ins , ins/ins
01
400
05
300
07
09
200
02
200
03
04
150
06
08
100
10
50
100
0
0
0
2
4
6
8
10
12
14
0
16
2
4
6
del/ins , ins/ins
del/del
5β-diol
700
12
14
16
5β-diol
250
600
Conc. (ng/ml)
Conc. (ng/ml)
10
300
800
01
500
05
400
07
300
09
200
02
200
03
04
150
06
100
08
10
50
100
0
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0
2
4
6
Day
del/ins , ins/ins
8
10
12
14
16
Day
del/del
5α-/5β-diol
2.5
5α-/5β-diol
4.0
3.5
2.0
02
03
3.0
01
1.5
05
Ratio
Ratio
8
Day
Day
07
1.0
09
2.5
04
2.0
06
1.5
08
1.0
0.5
10
0.5
0.0
0.0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0
2
4
Day
6
8
10
12
14
16
Day
Figure 1-10. Change in the urinary concentrations of 5α-diol, 5β-diol (i.e. aglycones) and
5α-/5β-diol after the administration of testosterone enanthate.
del/del: subjects-02, -03, -04, -06, -08 and -10. del/ins: subjects-01, -05 and -07. ins/ins:
subject-09.
29
次に、本投与試験により採取された尿試料を実際のドーピング検査で採取された検
体 と 仮 定 し た 場 合 に 、 違 反 が 疑 わ れ る 分 析 結 果 （ adverse analytical finding: AAF） が 得
ら れ る 割 合 に つ い て 検 証 し た 。 WADA 閾 値 に 基 づ い た 基 準 と 本 研 究 で UGT2B17 遺 伝
子 型 別 に 設 定 し た 基 準 を 適 用 し た 場 合 の 判 定 結 果 を Table 1-5 に 示 し た 。 WADA の 基
準 値 T/E>4 で は 、del/del 型 の 女 性 は 、6 名 全 員 が す べ て の 採 取 尿 試 料 に お い て AAF 判
定 で き な か っ た 。 し か し 、 1.3.2 項 で 設 定 し た del/del 型 の 女 性 に お け る T/E 基 準 上 限
値 0.4 を 適 用 し た 場 合 、AAF 判 定 率 は 、33.3− 83.0%ま で 向 上 し 、か な り の 偽 陰 性 を 排
除 で き る こ と が 明 ら か と な っ た 。 そ の 一 方 、 del/del 型 女 性 競 技 者 の 3.3%は 、 T/E>0.4
を 示 し て お り 、男 性 競 技 者 に お い て も 、3.2%は del/del 型 の T/E 基 準 上 限 値 0.5 を 超 え
て い る 。 こ の こ と は 、 ド ー ピ ン グ 検 査 に UGT2B17 遺 伝 子 型 別 の T/E 基 準 値 を 適 用 し
た 場 合 、Testosterone 製 剤 に よ る ド ー ピ ン グ の 検 出 率 が 向 上 す る 反 面 、正 常 者 に お い て
GC–IRMS に よ る 確 認 分 析 の 発 生 頻 度 が 増 大 す る こ と と な る こ と を 意 味 し て い る 。
WADA Tokyo laboratory で は 、2009 年 か ら 2011 年 に か け て 計 19175 検 体 の ド ー ピ ン グ
検 査 を 実 施 し た 。そ の う ち T/E>4 を 示 し た 検 体 は 、わ ず か 31 検 体（ 0.2%）に す ぎ ず 、
そ の う ち 2 検 体（ 6.5%）を GC–IRMS 分 析 の 結 果 AAF と 判 定 し た 。こ れ と は 対 照 的 に 、
ド イ ツ の WADA 認 定 試 験 所 に お い て は 、 T/E>4 の ケ ー ス は 、 2.3%と 日 本 の 10 倍 の 頻
度 で あ り 、 そ れ ら の 検 体 の 5.5%が GC–IRMS で AAF 判 定 と な っ て い る
42 )
。この日本
と ド イ ツ に お け る 違 い は 、Table 1-1 に 示 し た よ う に 、モ ン ゴ ロ イ ド と コ ー カ ソ イ ド に
お け る UGT2B17 遺 伝 子 型 の 分 布 の 違 い で 説 明 可 能 で あ る 。す な わ ち 、ド イ ツ の WADA
認 定 試 験 所 で は del/ins 型 も し く は ins/ins 型 の 競 技 者 か ら の 採 取 検 体 が 多 い た め 、
T/E>4 と い う WADA 基 準 で も 高 頻 度 で GC–IRMS が 実 施 さ れ て お り 、 そ の 多 く は 陰 性
を 示 す 結 果 と な っ て い る と 考 え ら れ る 。こ の よ う に 、T/E>4 基 準 で は del/del 型 の 競 技
者 が Testosterone 製 剤 を 使 用 し て い た と し て も 、 十 分 に 検 知 で き て い な い 可 能 性 が あ
ることを示している。
30
Table 1-5. Rate of an adverse analytical finding (AAF) sample fulfilling the criteria based on
the WADA technical document and the genotype-based on the cut-off limit set in this study
Rate (%) of AAF per sample ( ): per individual
Day after administration of testosterone enatnthate
0
1
2
3
4
6
8–9
10–11
12–13
15–16
Testosterone (ng/ml) >200*
0% (0/6)
0% (0/6)
0% (0/6)
0% (0/6)
0% (0/6)
0% (0/6)
0% (0/6)
0% (0/6)
0% (0/6)
0% (0/6)
A (ng/ml)>10000*
0% (0/6)
0% (0/6)
0% (0/6)
0% (0/6)
0% (0/6)
0% (0/6)
0% (0/6)
0% (0/6)
0% (0/6)
0% (0/6)
Et (ng/ml)>10000*
0% (0/6)
0% (0/6)
0% (0/6)
0% (0/6)
0% (0/6)
0% (0/6)
0% (0/6)
0% (0/6)
0% (0/6)
0% (0/6)
T/E>4*
0% (0/6)
0% (0/6)
0% (0/6)
0% (0/6)
0% (0/6)
0% (0/6)
0% (0/6)
0% (0/6)
0% (0/6)
0% (0/6)
T/E>0.4**
del/del subjects (n = 6)
0% (0/6)
67% (4/6)
67% (4/6)
83% (5/6)
67% (4/6)
50% (3/6)
50% (3/6)
50% (3/6)
50% (3/6)
33% (2/6)
13
0% (0/6)
100% (6/6)
83% (5/6)
100% (5/5) 100% (6/6)
83% (5/6)
83% (5/6)
67% (4/6)
60% (3/5)
33% (2/6)
13
0% (0/6)
100% (6/6) 100% (6/6) 100% (5/5) 100% (6/6) 100% (6/6) 100% (6/6) 100% (6/6)
80% (4/5)
33% (2/6)
13
0% (0/6)
100% (6/6) 100% (6/6) 100% (5/5) 100% (6/6) 100% (6/6)
83% (5/6)
83% (5/6)
80% (4/5)
83% (5/6)
13
0% (0/6)
100% (6/6) 100% (6/6) 100% (5/5) 100% (6/6) 100% (6/6)
83% (5/6)
83% (5/6)
80% (4/5)
67% (4/6)
13
0% (0/5)
100% (5/5) 100% (6/6) 100% (4/4) 100% (6/6) 100% (5/5) 100% (4/4) 100% (5/5)
50% (2/4)
33% (2/6)
∆δ C(Pdiol—A) ‰>3*
∆δ C(Pdiol—Et) ‰>3*
∆δ C(Pdiol—5α-diol ) ‰>3*
∆δ C(Pdiol—5β-diol) ‰>3*
∆δ C(Pdiol—Testosterone) ‰>3*
del/ins subjects (n = 3)
Testosterone (ng/ml) >200*
0% (0/3)
0% (0/3)
0% (0/3)
0% (0/3)
0% (0/3)
0% (0/3)
0% (0/3)
0% (0/3)
0% (0/3)
0% (0/3)
A (ng/ml)>10000*
0% (0/3)
0% (0/3)
0% (0/3)
0% (0/3)
33% (1/3)
0% (0/3)
33% (1/3)
33% (1/3)
0% (0/3)
0% (0/3)
Et (ng/ml)>10000*
0% (0/3)
0% (0/3)
33% (1/3)
0% (0/3)
33% (1/3)
33% (1/3)
33% (1/3)
0% (0/3)
0% (0/3)
0% (0/3)
T/E>4*
0% (0/3)
0% (0/3)
0% (0/3)
33% (1/3)
0% (0/3)
33% (1/3)
33% (1/3)
33% (1/3)
0% (0/3)
0% (0/3)
T/E>1.9**
0% (0/3)
33% (1/3)
67% (2/3)
67% (2/3)
67% (2/3)
67% (2/3)
67% (2/3)
67% (2/3)
67% (2/3)
67% (2/3)
13
0% (0/3)
100% (3/3)
67% (2/3)
100% (3/3)
67% (2/3)
67% (2/3)
67% (2/3)
33% (1/3)
0% (0/3)
0% (0/3)
13
0% (0/3)
100% (3/3) 100% (3/3) 100% (3/3) 100% (3/3) 100% (3/3)
67% (2/3)
33% (1/3)
33% (1/3)
0% (0/3)
13
0% (0/3)
100% (3/3) 100% (3/3) 100% (3/3) 100% (3/3) 100% (3/3) 100% (3/3) 100% (3/3) 100% (3/3)
67% (2/3)
13
0% (0/3)
100% (3/3) 100% (3/3) 100% (3/3) 100% (3/3) 100% (3/3) 100% (3/3) 100% (3/3) 100% (3/3)
67% (2/3)
13
0% (0/3)
100% (3/3) 100% (3/3) 100% (3/3) 100% (3/3) 100% (3/3) 100% (3/3) 100% (3/3) 100% (3/3)
67% (2/3)
∆δ C(Pdiol—A) ‰>3*
∆δ C(Pdiol—Et) ‰>3*
∆δ C(Pdiol—5α-diol ) ‰>3*
∆δ C(Pdiol—5β-diol) ‰>3*
∆δ C(Pdiol—Testosterone) ‰>3*
ins/ins subject (n=1)
Testosterone (ng/ml) >200*
0% (0/1)
0% (0/1)
0% (0/1)
0% (0/1)
0% (0/1)
0% (0/1)
0% (0/1)
0% (0/1)
0% (0/1)
0% (0/1)
A (ng/ml)>10000*
0% (0/1)
0% (0/1)
0% (0/1)
0% (0/1)
0% (0/1)
0% (0/1)
0% (0/1)
0% (0/1)
0% (0/1)
0% (0/1)
Et (ng/ml)>10000*
0% (0/1)
0% (0/1)
0% (0/1)
0% (0/1)
0% (0/1)
0% (0/1)
0% (0/1)
0% (0/1)
0% (0/1)
0% (0/1)
T/E>4*
0% (0/1)
100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1)
0% (0/1)
0% (0/1)
0% (0/1)
0% (0/1)
T/E>3.2**
0% (0/1)
100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1)
0% (0/1)
0% (0/1)
0% (0/1)
13
0% (0/1)
100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1)
0% (0/1)
0% (0/1)
0% (0/1)
13
0% (0/1)
100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1)
0% (0/1)
0% (0/1)
0% (0/1)
13
0% (0/1)
100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1)
0% (0/1)
13
0% (0/1)
100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1)
0% (0/1)
13
0% (0/1)
100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1)
0% (0/1)
∆δ C(Pdiol—A) ‰>3*
∆δ C(Pdiol—Et) ‰>3*
∆δ C(Pdiol—5α-diol ) ‰>3*
∆δ C(Pdiol—5β-diol) ‰>3*
∆δ C(Pdiol—Testosterone) ‰>3*
*: WADA criteria 2 0 ) . **: genotype-based cut-off limit.
31
0% (0/1)
1.3.3.2
Testosterone 関 連 代 謝 物 の 炭 素 同 位 体 比
典 型 的 な GC–IRMS ク ロ マ ト グ ラ ム を Figure 1-11 か ら Figure 1-14 に 示 し た 。
Testosterone-mono-acetate、 A-mono-acetate、 Et-mono-acetate、 5α-diol-diacetate、
5β-diol-diacetate、Pdiol-diacetate お よ び 5α-androstan-3β-ol-mono-acetate（ I.S.）の t R は 、
そ れ ぞ れ 1303、 1181、 1168、 1218、 1200、 1321、 976 秒 で あ っ た 。 本 法 で は 測 定 対 象
ス テ ロ イ ド を ア セ チ ル 誘 導 体 化 し て い る 。そ の 結 果 、ス テ ロ イ ド の δ 1 3 C 値 は 、 誘 導 体
化 に よ っ て 導 入 さ れ た 炭 素 に よ る バ イ ア ス が 生 じ る た め 、 用 い た 誘 導 体 化 試 薬 の δ13C
値 と 誘 導 体 化 に よ り 導 入 さ れ る 炭 素 原 子 の 数 に 応 じ て 、次 式（ 2）に よ り 補 正 し た
n a s ×δ 1 3 C as (‰) = n s ×δ 1 3 C s + n a ×δ 13 C a co r r
37 ,38 )
。
（ 2）
nas: ア セ チ ル 化 ス テ ロ イ ド 中 の 炭 素 原 子 の 総 数
δ13Cas: ア セ チ ル 化 ス テ ロ イ ド の δ13C 値
ns: ア セ チ ル 化 さ れ て い な い ス テ ロ イ ド 中 の 炭 素 原 子 の 総 数
δ13Cs: ア セ チ ル 化 さ れ て い な い ス テ ロ イ ド の δ13C 値
na: 導 入 さ れ た ア セ チ ル 基 中 の 炭 素 原 子 総 数
δ 1 3 C a co r r : ア セ チ ル 化 試 薬 （ 無 水 酢 酸 ） の δ 1 3 C 値
次 に 、 測 定 対 象 ス テ ロ イ ド （ A, Et, Testosterone, 5α-diol お よ び 5β-diol） と 内 因 性 ス
テ ロ イ ド の 指 標 と な る Pdiol の δ 1 3 C 値 の 差 を Δδ 1 3 C と 表 記 し 、 次 式 （ 3） に よ り 算 出 し
た 。 WADA の 設 定 し た 基 準 閾 値 に 従 い 、 Δδ 1 3 C が 3‰超 の 場 合 を 、 Testosterone 製 剤 に
よるドーピング判定閾値として評価に使用した
20 )
Δδ 1 3 C (‰) = δ 13 C（ Pdiol） – δ 1 3 C（ target steroid）
。
（ 3）
本測定法は、ドーピング検査に用いられている標準法であるため、メソッドバリデ
ー シ ョ ン の 詳 細 は 割 愛 す る 。本 法 の メ ソ ッ ド バ リ デ ー シ ョ ン は 再 現 性 や 正 確 度 の 他 に 、
Piper ら
38 )
に よ っ て 記 述 さ れ た linear mixing models に よ る 評 価 を 行 っ た 。 Testosterone
製 剤 使 用 者 の 尿 中 ス テ ロ イ ド の CIR は 、 内 因 性 の ス テ ロ イ ド と Testosterone 製 剤 由 来
の ス テ ロ イ ド が 合 算 値 を 示 す 。そ こ で 、尿 試 料 に δ 1 3 C 値 が 既 知 の 化 学 合 成 ス テ ロ イ ド
を 添 加 し た 希 釈 系 列 に お い て 、内 因 性 ス テ ロ イ ド と 添 加 ス テ ロ イ ド の 量 比 と δ 1 3 C 値 の
間 に 、相 関 関 係 が 得 ら れ る こ と で 正 確 な 測 定 が 可 能 で あ る と 云 え る 。5α-diol を 例 と す
る と 、ま ず 、尿 試 料 中 の 内 因 性 5α-diol お よ び 5α-diol 標 準 物 質 の δ 1 3 C 値 を 測 定 し た と
こ ろ 、 そ れ ぞ れ –20.1 ± 0.49‰お よ び –31.2 ± 0.07‰で あ っ た 。 次 に 、 尿 試 料 に 段 階 的 に
5α-diol 標 準 物 質 を 添 加 し て δ 1 3 C 値 を 測 定 し た 。尿 中 の 総 5α-diol 濃 度（ 内 因 性 5α-diol
と 5α-diol 標 準 物 質 の 合 算 ） に 対 す る 内 因 性 5α-diol 濃 度 の 比 率 を x 軸 に 、 δ 1 3 C 値 を y
軸 に と り 線 形 回 帰 式 を 求 め た 。 そ の 結 果 、 直 線 一 次 回 帰 式 は y =（ 10.9 ± 0.18‰） x +
32
（ −31.11 ± 0.64‰）
） と な り 、 良 好 な 直 線 関 係 が 得 ら れ た （ R 2 =0.9947）
）。 ま た 、 他 の 測 定
対象ステロイドも同様に良好な直線性
性（ R 2 =0.98
801 – 0.9986）が 得 ら れ た こ と か ら 、本
法 の 精 度 は 良 好 で あ る と 判 断 し た 。す
す べ て の 尿 試 料 の 測 定 に あ た っ て は 、2 種 類 の QC
sample （ 薬 物 服 用 の 無 い 健 常 者 の 尿 試 料 お よ び 対 象 ス テ ロ イ ド の 標 準 物 質 を 添 加 し た
尿 試 料 ）も 同 時 に 測 定 し 、精 度 管 理 を 行 っ た 。QC
C sample の δ 13 C 値 お よ び Δδ 1 3 C の SD n -1
は 、 そ れ ぞ れ 0.4 – 0.8‰お よ び 0.3 – 00.6‰で あ り 、 日 間 で の 分 析 誤 差 の 影 響 は 分 析 精
度 内 で あ る こ と を 確 認 し た 。 ま た 、 I. S.の δ 1 3 C 値 は 、 日 内 の SD n - 1 は 0.1 – 0.2‰
‰、 日 間
で は 0.33 – 0.4‰と
と 良 好 で あ り 、 各 測 定 試 料 の ア セ チ ル 誘 導 体 化 に よ る isotopic
fractionnation は 認 め ら れ な か っ た 。 す べ て の ア セ チ ル 化 ス テ ロ イ ド 試 料 は 、 GC
C–IRMS
と 同 一 の GC 条 件 で GC–MS
S（ 6890N G
GC/5973 ineert MSD, Agilent） に よ る ス キ ャ ン 測 定
（ m/z 5 0− 550, ス キ ャ ン 速 度 2.9/秒 ） を 実 施 し 、 ピ ー ク の 同 定 と 夾 雑 物 質 の 有 無 を 確
認 し た 。 そ の 結 果 、 8 試 料 中 の Testos terone（ フ ラ ク シ ョ ン I） は 、 夾 雑 ピ ー ク の 重 複
も し く は 低 濃 度 の た め 、 δ13C 値 の 測 定 は 不 可 能 と 判 断 し 、 デ ー タ 解 析 か ら 除 外 し た 。
ま た 、 1 名 の del/d
/del 型 被 験 者 （ subjec t-04） か ら 採 取 し た 2 ス ポ ッ ト の 尿 試 料 （ 投 与 3
日 後 お よ び 投 与 12
1 日 後 ）は
は 、採 取 尿 量 が 少 な く 、正 確 な 測 定 に 必 要 な ピ ー ク 強 度 が 得
られなかったため、データ解析から除 外した。
Figure 1--11. Typicall GC–IRMS
S chromatog
gram (Fraction III).
(upper: m/z
m 45 and m/z
m 44 ion ttraces, loweer: m/z 45 to
o m/z 44 rattio trace)
33
Figuree 1-12. Typiical GC–IRM
MS chromaatogram (Fraction IV).
(upperr: m/z 45 an
nd m/z 44 ioon traces, lo
ower: m/z 45 to m/z 44 ratio trace )
MS chromaatogram (Fraction I).
Figuree 1-13. Typiical GC–IRM
(upperr: m/z 45 an
nd m/z 44 ioon traces, lo
ower: m/z 45 to m/z 44 ratio trace )
34
S chromatog
gram (Fracttion V).
Figure 1--14. Typica l GC–IRMS
(upper: m/z
m 45 and m/z
m 44 ion ttraces, loweer: m/z 45 to m/z 44 raatio trace)
Testoosterone enaanthate 投 与 後 の δ 1 3 C 値 お よ び Δδ
Δ 1 3 C の 変 化 を 、 そ れ ぞ れ Figurre 1-15
お よ び Figure 1-1 6 に 示 し た （ del/del: subjects-02
2, -03, -04, -06 お よ び -10； del/i ns:
subjectss-05 お よ び -07； ins/i ns: subject--09）。
del/d el 型 被 験 者 の A、 Et、
、 Testosterrone、 5α-diiol お よ び 5β-diol の 平 均 δ 1 3 C 値 は 、 投
与 前 に お い て は 、 そ れ ぞ れ −20.5、
−
−211.4、 −21.2 、 −19.7 お よ び −19.5‰
‰で あ っ た が 、 投
与 後 に は 、 そ れ ぞ れ −25.7、
、 −26.2、 −227.0、 −28.2
2 お よ び −28.0‰へ と δ 1 3 C 値 は 有 意 に 低
値 を 示 し た（ P < 0.05）。del//ins 型 お よ び ins/ins 型 被 験 者 に お い て も 同 様 の 結 果 を 示 し
た 。 一 方 、 内 因 性 ス テ ロ イ ド の 指 標 と な る Pdio l の δ 1 3 C 値 は 、 す べ て の 遺 伝 子 型 被 験
者 に お い て 投 与 前 後 で 有 意 差 は 認 め ら れ な か っ た （ P > 0.0
05）。
del/d el 型 被 験 者 の A、 Et、
、 Testosterrone、 5α-diiol お よ び 5β-diol の 平 均 Δδ 1 3 C は 、 投
与 前 に お い て は 、そ
、 れ ぞ れ 0.4、1.3、11.0、−0.4 お よ び −0.6‰
‰で あ っ た が 、投 与 後 に は 、
そ れ ぞ れ 最 大 5.6 、6.2、7.0、
、8.1 お よ び 7.9‰へ と Δδ 1 3 C は 有 意 に 上 昇 し た（ P < 0.05）。
次 に 、 本 投 与 試 験 に よ り 採 取 さ れ た 尿 試 料 を 実 際 の ドー ピ ン グ 検 査 で 採 取 さ れ た 検
体 と 仮 定 し た 場 合 に 、 WAD A 閾 値 に 基 づ い た 基 準 （ Δδ 1 3 C > 3‰） に よ り 違 反 が 疑 わ れ
る 分 析 結 果 （ AAF
F） が 得 ら れ る 割 合 に つ い て 検 証 し た 。 WADA
W
閾値 に基づいた基準 と
本 研 究 で UGT2B117 遺 伝 子 型 別 に 設 定 し た 基 準 を 適 用 し た 場 合 の 判 定 結 果 を Taable 1-5
に 示 し た 。こ の よ う に 、投 与 後 に 採 取 し た す べ て の 遺 伝 子 型 被 験 者 の 尿 試 料 に お い て 、
WADA 閾 値 に 基 づ い た 基 準（ Δδ 13 C > 33‰）に よ り 、AAF と 判 定 す る こ と が 可 能 で あ っ
35
た 。 GC–IRMS 分 析 は 、 Testosterone enanthate 投 与 後 の 早 期 段 階 お よ び 消 失 期 に お い て
も そ の 使 用 を 検 知 す る こ と が 可 能 で あ り 、Testosterone ド ー ピ ン グ の 検 出 法 と し て は 女
性 に 対 し て も 、有 効 で あ る こ と が 明 ら か と な っ た 。Table 1-5 に 示 す よ う に 、GC–IRMS
分 析 に よ り 、最 も AAF 検 出 率 の 高 い 対 象 ス テ ロ イ ド は 、5α-diol お よ び 5β-diol で あ っ
た 。Αお よ び Et は 内 因 性 由 来 の 濃 度 が 高 い た め 、投 与 後 に 代 謝 物 と し て 産 生 し た A お
よ び Et の δ 13 C 値 が 希 釈 さ れ る た め 、 AAF 検 出 率 が 5α-diol お よ び 5β-diol と 比 較 し て
低 い 傾 向 に あ る と 云 え る 。し か し 、1 名 の del/del 型 被 験 者（ subject-06）の 消 失 期 の よ
う に 、 5α-diol お よ び 5β-diol の ∆δ 13 C は 、 他 の 測 定 対 象 ス テ ロ イ ド よ り も 低 値 を 示 す
ケ ー ス も 認 め ら れ た 。こ れ は 3α-dehydrogenase や 17β-dehydrogenase な ど 、第 I 相 ス テ
ロ イ ド 代 謝 酵 素 活 性 の 個 人 差 が 影 響 し て い る 可 能 性 が 考 え ら れ る 。 故 に 、 GC–IRMS
測定においては、対象ステロイドの結果を総合的に判断していくことが必要である。
こ れ ま で 男 性 被 験 者 で の Testosterone 製 剤 に よ る steroid profile へ の 影 響 に つ い て の
報 告 は あ っ た が 、 本 研 究 に よ り 、 女 性 に お い て も Testosterone enanthate の 筋 肉 内 投 与
後 1− 2 週 間 と 長 期 間 に わ た り 、そ の 使 用 を GC–IRMS 分 析 に よ り 検 知 す る こ と が 可 能
で あ る こ と が 明 ら か と な っ た 。し か し な が ら 、GC–IRMS 分 析 の ス ク リ ー ニ ン グ 検 査 へ
の適用は、現状では困難な状況である。その理由としては、次のようなことが挙げら
れ る 。GC–IRMS 分 析 は 、尿 中 の Testosterone を は じ め と す る ス テ ロ イ ド を 燃 焼 し 、生
成 し た CO 2 ガ ス を 測 定 す る 。そ の た め 、尿 中 ス テ ロ イ ド の CIR は 、有 機 化 合 物 が 夾 雑
し た 場 合 、正 確 に 測 定 す る こ と が 不 可 能 と な る 。故 に 、測 定 対 象 と す る ス テ ロ イ ド は 、
可 能 な 限 り 精 製 し て 測 定 に 供 す る 必 要 が あ る 。1.2.3 項 に 示 し た よ う に 、尿 試 料 中 の ス
テ ロ イ ド は 、 固 相 抽 出 、 有 機 溶 剤 抽 出 、 HPLC に よ る 分 取 精 製 お よ び 高 感 度 化 の た め
の ア セ チ ル 化 を 実 施 し て お り 、 前 処 理 だ け で も 2 日 を 要 す る 。 ま た 、 GC 分 析 に よ る
夾 雑 ピ ー ク と の 分 離 を 達 成 す る た め 、1 イ ン ジ ェ ク シ ョ ン 40 分 と 測 定 に は 長 い 分 析 時
間 を 必 要 と し て い る 。さ ら に 、HPLC 分 取 に よ り 尿 試 料 あ た り 5 フ ラ ク シ ョ ン（ 5 イ ン
ジェクション）の測定が必要となる。また、ドーピングに精通した競技者は、検知さ
れ に く い 半 減 期 の 短 い 製 剤 、 す な わ ち Testosterone propionate の 筋 肉 内 投 与 、
Testosterone undecanoate の 経 口 服 用 あ る い は 低 用 量 の 経 皮 吸 収 型 Testosterone 製 剤 な ど
を 使 用 す る 可 能 性 が あ る 。 こ れ ら の Testosterone 製 剤 に お い て 、 UGT2B17 遺 伝 子 型 別
の投与試験によりドーピングの検知率は異なる可能性もあり、調査が必要である。
36
Subject-03 (del/del )
-18.0
-18.0
-20.0
-20.0
-22.0
-22.0
δ13C‰
δ13C‰
Subject-02 (del/del )
-24.0
-26.0
-24.0
-26.0
-28.0
-28.0
-30.0
-30.0
-32.0
-32.0
0
2
A
4
Et
6
8
Day
Testosterone
10
12
5α-diol
14
5β-diol
0
16
2
A
Pdiol
4
Et
-18.0
-20.0
-20.0
-22.0
-22.0
δ13C‰
δ13C‰
-18.0
-24.0
-26.0
Testosterone
10
5α-diol
12
14
5β-diol
16
Pdiol
-24.0
-26.0
-28.0
-28.0
-30.0
-30.0
-32.0
-32.0
0
2
A
4
Et
6
8
Day
Testosterone
10
5α-diol
12
14
5β-diol
0
16
2
A
Pdiol
4
Et
Subject-10 (del/del )
6
8
Day
Testosterone
10
5α-diol
12
14
5β-diol
16
Pdiol
Subject-05 (del/ins )
-18.0
-18.0
-20.0
-20.0
-22.0
-22.0
δ13C‰
δ13C‰
8
Day
Subject-06 (del/del )
Subject-04 (del/del )
-24.0
-26.0
-24.0
-26.0
-28.0
-28.0
-30.0
-30.0
-32.0
-32.0
0
2
A
4
Et
6
8
Day
Testosterone
10
5α-diol
12
14
5β-diol
16
0
Pdiol
2
A
4
Et
Subject-07 (del/ins )
6
8
Day
Testosterone
10
5α-diol
12
14
5β-diol
16
Pdiol
Subject-09 (ins/ins )
-18.0
-18.0
-20.0
-20.0
-22.0
-22.0
δ13C‰
δ13C‰
6
-24.0
-26.0
-24.0
-26.0
-28.0
-28.0
-30.0
-30.0
-32.0
-32.0
0
2
A
4
Et
6
8
Day
Testosterone
10
5α-diol
12
14
5β-diol
0
16
Pdiol
2
A
4
Et
6
8
Day
Testosterone
10
5α-diol
12
14
5β-diol
16
Pdiol
Figure 1-15. Change in the δ 1 3 C values after administration of testosterone enanthate.
del/del: subjects-02, -03, -04, -06 and -10. del/ins: subjects-05 and -07. ins/ins: subject-09.
37
Subject-03 (del/del )
12.0
12.0
10.0
10.0
8.0
8.0
⊿δ13C‰
⊿δ13C‰
Subject-02 (del/del )
6.0
4.0
6.0
4.0
2.0
2.0
0.0
0.0
-2.0
-2.0
0
2
Pdiol - Testosterone
4
6
Pdiol - A
8
Day
10
Pdiol - Et
12
14
Pdiol - 5α-diol
16
Pdiol - 5β-diol
0
2
Pdiol - Testosterone
4
Pdiol - A
12.0
12.0
10.0
10.0
8.0
8.0
6.0
4.0
10
Pdiol - Et
12
14
Pdiol - 5α-diol
16
Pdiol - 5β-diol
6.0
4.0
2.0
2.0
0.0
0.0
-2.0
-2.0
0
2
Pdiol - Testosterone
4
6
Pdiol - A
8
Day
10
Pdiol - Et
12
14
Pdiol - 5α-diol
16
Pdiol - 5β-diol
0
2
Pdiol - Testosterone
4
6
Pdiol - A
Subject-10 (del/del )
8
Day
10
Pdiol - Et
12
14
Pdiol - 5α-diol
16
Pdiol - 5β-diol
Subject-05 (del/ins )
12.0
12.0
10.0
10.0
8.0
8.0
⊿δ13C‰
⊿δ13C‰
8
Day
Subject-06 (del/del )
⊿δ13C‰
⊿δ13C‰
Subject-04 (del/del )
6.0
4.0
6.0
4.0
2.0
2.0
0.0
-2.0
0.0
0
2
Pdiol - Testosterone
4
6
Pdiol - A
8
Day
10
Pdiol - Et
12
14
Pdiol - 5α-diol
16
0
Pdiol - 5β-diol
2
Pdiol - Testosterone
4
6
Pdiol - A
Subject-07 (del/ins )
8
Day
10
Pdiol - Et
12
14
Pdiol - 5α-diol
16
Pdiol - 5β-diol
Subject-09 (ins/ins )
12.0
12.0
10.0
10.0
8.0
8.0
⊿δ13C‰
⊿δ13C‰
6
6.0
4.0
2.0
6.0
4.0
2.0
0.0
0.0
-2.0
-2.0
0
2
Pdiol - Testosterone
4
6
Pdiol - A
8
Day
10
Pdiol - Et
12
14
Pdiol - 5α-diol
16
Pdiol - 5β-diol
0
2
Pdiol - Testosterone
4
6
Pdiol - A
8
Day
10
Pdiol - Et
12
14
Pdiol - 5α-diol
16
Pdiol - 5β-diol
Figure 1-16. Change in the Δδ 1 3 C values after the administration of testosterone enanthate.
del/del: subjects-02, -03, -04, -06 and -10. del/ins: subjects-05 and -07. ins/ins: subject-09.
38
1.4
小括
Testosterone 製 剤 を 使 用 し た 場 合 の 尿 中 Testosterone が 外 因 性 で あ る か 内 因 性 で あ る
か の 異 同 識 別 は 、 ド ー ピ ン グ 検 査 に お い て 重 要 で あ る 。 こ れ ま で T/E に よ る 世 界 統 一
基 準 閾 値 を も と に し た Testosterone 製 剤 に よ る ド ー ピ ン グ の 検 出 が 実 施 さ れ て き た が 、
本研究によりその有効性には限界があることが明確となった。本章での研究の結果、
日 本 人 競 技 者 に お い て は 、 del/del 型 の 割 合 が 極 端 に 高 く 、 ins/ins 型 が 少 な い こ と 、 ま
た del/del 型 の 女 性 が Testosterone enanthate を 使 用 し た 場 合 、 T/E>4 を 示 さ な い こ と が
明 ら か と な っ た 。 日 本 を は じ め と す る ア ジ ア 地 域 の WADA 認 定 試 験 所 に お い て は 、
del/del 型 の 競 技 者 を 検 査 対 象 と す る こ と が 多 い た め 、低 い T/E を 有 し た 競 技 者 に 対 し
て よ り 注 視 す る 必 要 が あ る 。そ の 対 策 と し て は 、UGT2B17 遺 伝 子 型 別 の T/E を 設 定 す
ることも有効と考えられるが、ドーピング検査において遺伝子解析を導入するために
は 倫 理 面 や 法 的 側 面 で の 課 題 は 多 い 。 GC–IRMS 分 析 で は UGT2B17 遺 伝 子 型 に よ ら ず
非 常 に 有 効 で あ る こ と も 確 認 さ れ た 。し か し な が ら 、GC–IRMS は 、そ の 検 査 に 要 す る
時間とコストの面から全検査への適用は事実上困難な状況にあるため、パワー系競技
のようなハイリスク競技におけるターゲット分析なども有効と考えられる。最近、内
因 性 の ス テ ロ イ ド に 近 い δ 1 3 C 値 を 有 し た Testosterone 製 剤 や サ プ リ メ ン ト が 、 イ ン タ
ーネット上の闇市場で流通しはじめていることが報告された
を抽出して精製したもの、あるいは化学合成により
13
43 )
。 動 物 の Testosterone
C 標 識 化 し た Testosterone を 混
合 す る な ど し て 、 CIR を 生 体 内 ス テ ロ イ ド に 近 づ け る な ど し た こ と が 示 唆 さ れ る 。 ド
ー ピ ン グ 検 査 に お け る GC–IRMS の 原 理 の 弱 点 を 狙 っ た 意 図 的 な 操 作 で あ る 可 能 性 が
考 え ら れ る 。こ の よ う な Testosterone 製 剤 を 使 用 し た 場 合 は 、GC–IRMS で も 検 知 す る
こ と は 困 難 に な っ て く る こ と が 予 想 さ れ る 。 ア ス リ ー ト 生 体 パ ス ポ ー ト （ Athlete
Biological Passport: ABP） の よ う に 、 競 技 者 個 人 の T/E や steroid profile を 追 跡 し て い
く こ と で 、そ の 変 動 を 捉 え る 手 法 は 、こ う し た 問 題 点 の 解 決 策 と な り う る
44 )
。ド ー ピ
ン グ 検 査 に お け る ア ス リ ー ト 生 体 パ ス ポ ー ト に よ る ド ー ピ ン グ 検 査 は 、2014 年 1 月 か
ら本格的に開始されることとなった。競技者は世界各国でドーピング検査を受けるた
め 、steroid profile 測 定 に お け る WADA 認 定 試 験 所 間 で の 定 量 精 度 の 相 関 が 重 要 と な る 。
ま た 、 女 性 競 技 者 お よ び del/del 型 の 競 技 者 で は 、 尿 中 Testosterone は 低 濃 度 を 示 す 。
今 後 は 、 ト リ プ ル 四 重 極 型 質 量 分 析 （ GC–MS/MS） の よ う な 高 感 度 分 析 機 器 の 導 入 に
より、低濃度域での定量精度を向上させていくことが課題である。
39
第２章
成 長 ホ ル モ ン 分 泌 刺 激 製 剤 GHRP-2 の UPLC–MS/MS を 用 い た ド ー
ピング検査法の開発
2.1
序論
成 長 ホ ル モ ン （ Growth hormone: GH） は 、 下 垂 体 前 葉 か ら 分 泌 さ れ る 内 因 性 ホ ル モ
ン で あ る 。 GH の 分 泌 は 、 Figure 2-1 に 示 し た よ う に 、 視 床 下 部 か ら 分 泌 さ れ る GH 放
出 ホ ル モ ン （ Growth hormone releasing hormone: GHRH） お よ び 主 に 胃 か ら 分 泌 さ れ る
グ レ リ ン（ Ghrelin）に よ り 促 進 、膵 臓 か ら 分 泌 さ れ る ソ マ ト ス タ チ ン に よ り 抑 制 さ れ
る 。 GHRH は GH 産 生 細 胞 に 特 異 的 に 発 現 し て い る GHRH 受 容 体 （ GHRH-R） 45 ,46 ) に
結 合 し 、GH 遺 伝 子 転 写 を 活 性 さ せ る こ と で 細 胞 内 の cAMP 濃 度 を 上 昇 さ せ 、GH 分 泌
を促進する
47 )
。 イ ン ス リ ン 様 成 長 因 子 （ Insulin-like growth factor-1: IGF-1） は 、 成 長
促 進 作 用 の 一 次 仲 介 物 質 で あ り 、 negative feedback に よ り 血 中 GH レ ベ ル を 制 御 し て
いる
48 )
。 ま た 、 GH 分 泌 刺 激 物 質 （ growth hormone secretagogue: GHS） 49 ) は GHRH-R
に直接作用せず
50 )
、G タ ン パ ク 質 共 役 GHS 受 容 体（ GHS-R1a）を 活 性 化 さ せ る こ と で
GH の 分 泌 を 促 進 さ せ る
51 ,52 )
。
Somatostatin
Hypothalamus
+
Pancreas
-
GHRH
GHS, GHRP
+
GHRH-R
IGF-1
-
Pituitary Gland
GHS-R1a
+
Stomach
Ghrelin
+
GH
IGF-1
GHR
Liver
+
Bone, Muscle
Figure 2-1. GH/IGF-1 axis.
GH は 、 肝 細 胞 膜 の GH 受 容 体 （ GH receptor: GHR） と 結 合 し 、 IGF-1 を 介 し て 骨 や
軟骨細胞の局部組織に作用し、骨格の成長をもたらす
53 )
。 ま た 、 GH は 、 脂 肪 組 織 や
筋組織および免疫組織に直接作用し、タンパク質合成、グルコースおよび脂質代謝を
促進し、免疫機能を調節する
47 ,4 8 , 53)
。
日 本 で は 、GH 分 泌 不 全 症 の 治 療 薬 と し て 、rhGH が 製 造 販 売 さ れ て い る 。遺 伝 子 組
換 え IGF-1（ rIGF-1, Mecasermin） は 、 GH 抵 抗 性 小 人 症 の 治 療 薬 と し て 製 造 販 売 さ れ
て い る 。 ま た 、 GH 分 泌 不 全 症 の 診 断 薬 と し て 、 遺 伝 子 組 換 え GHRH（ GHRH(1-44)）
お よ び 合 成 GHS（ GHRP-2）が 製 造 販 売 さ れ て い る 。GHRP-2 は 、ア ミ ノ 酸 6 残 基 か ら
40
な る ペ プ チ ド で あ り 、 強 力 な GH 分 泌 作 用 を 有 す る
54 ,5 5)
。インターネット上では
GHRP-2 を 含 有 す る Hemogex™（ VPX Sports, Vital Pharmaceuticals Inc., Davie, FL, USA）
や Hemotropin™（ Nutrabolics, Richmond, BC, Canada） の よ う な サ プ リ メ ン ト 、 注 射 用
製剤が販売されており、誰もが容易に入手が可能な状態になっている
GH に は 、タ ン パ ク 同 化 作 用 や 脂 肪 分 解 効 果 が あ る た め
56 )
8 ,9 )
。
、1989 年 に IOC に よ り 禁
止 物 質 に 指 定 さ れ て 以 来 、競 技 者 に よ る 不 正 使 用 は 、現 在 WADA に よ り 厳 し く 禁 止 さ
れている
3)
。 競 技 者 に よ り 不 正 使 用 さ れ る 可 能 性 の あ る 成 長 促 進 因 子 は 、 Table 2-1 に
示 す よ う に 、4 つ の カ テ ゴ リ ー に 分 類 さ れ る 。す な わ ち 、GH、GHRH 類 、GHS 類 お よ
び IGF-1 類 で あ る 。
T able 2-1. List of growth factors abused by athletes
Mechanism
Substance
Exogenous GH
22 kDa rhGH
Somatropin
Genotropin
Release of endogenous GH
(GHRH receptor agonist)
GHRH(1-44)
Somatorelin
GHRH(1-29) (Sermorelin), CJC-1295,
Tesamorelin
Release of endogenous GH
(Ghrelin receptor agonist)
GHRP-2
Pralmorelin
GHRP-6, Tabimorelin, Ibutamoren
Mediator of GH
(Negative feedback of GH secretion)
IGF-1
Mecasermin
Long-R3-IGF-1
Other related substance
rhGH に よ る ド ー ピ ン グ を 検 出 す る 方 法 と し て 、
「 GH isoform differential immunoassay」
が 、 2004 年 の ア テ ネ オ リ ン ピ ッ ク で 初 め て 適 用 さ れ 、 現 在 WADA に 承 認 さ れ て い る
分析法となっている
57 -59 )
。下 垂 体 か ら 分 泌 さ れ る GH は 複 数 の 分 子 量 の 異 な る 同 族 体
（ isoform） か ら 構 成 さ れ て い る 。 す な わ ち 、 22-kDa（ 48%）、 20-kDa（ 9%）、 二 量 体 /
オ リ ゴ マ ー （ 30%） お よ び そ の 他 少 量 の 断 片 化 し た GH な ど か ら 構 成 さ れ て い る
47 )
。
そ れ に 対 し て 、製 剤 と し て 遺 伝 子 組 換 え に よ り 大 腸 菌 か ら 生 成 さ れ る rhGH は 、22-kDa
の み か ら な る 。rhGH を 使 用 す る と 外 因 性 の 22-kDa GH の 血 中 濃 度 が 上 昇 し 、negative
feedback に よ り 内 因 性 の GH 産 生 は 抑 制 さ れ る 。 そ の 結 果 、 循 環 血 中 の GH 同 族 体 の
存 在 比 率 、 す な わ ち 22-kDa GH 濃 度 と そ の 他 の 内 因 性 GH 同 族 体 濃 度 の 存 在 比 率 が 上
昇 す る こ と で 、 rhGH の 使 用 を 検 出 す る と い う 原 理 で あ る
57 -5 9)
。
GHRP-2 を は じ め と す る GHS ド ー ピ ン グ 検 出 法 と し て は 、GHS 受 容 体 に 標 識 し た リ
ガ ン ド を 結 合 さ せ 、 GHS が 存 在 し た 場 合 に 受 容 体 と の 結 合 が GHS に 置 換 し 、 遊 離 し
た放射ラベル化リガンドを検出する手法が開発されている
60 )
。し か し 、放 射 性 物 質 を
使用する施設に制約があり、普及には至ってはいない。
以 上 の こ と を 背 景 と し て 、 GH お よ び 成 長 促 進 因 子 に よ る ド ー ピ ン グ を 検 出 す る た
め の 検 討 を 行 う こ と と し た 。 著 者 は 、 既 に rhGH 製 剤 、 GHRH(1-44)製 剤 お よ び 遺 伝 子
組 換 え IGF-1 の 投 与 試 験 を 実 施 し 、「 GH isoform differential immunoassay」 は 、 日 本 人
競 技 者 に 対 し て rhGH ド ー ピ ン グ を 検 知 す る 上 で 、 高 い ポ テ ン シ ャ ル を 有 し て い る も
41
の の 、 GHRH(1-44)製 剤 お よ び rIGF-1 は 検 知 が 不 可 能 で あ る こ と を 報 告 し た
61 )
。
本 章 で は 、 GHRP-2 の 投 与 試 験 を 行 い 、「 GH isoform differential immunoassay」 の 妥
当 性 を 検 討 し た 。 さ ら に 、 GHRP-2 ド ー ピ ン グ を 直 接 検 知 す る こ と を 目 指 し て 、 液 体
ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー 質 量 分 析 法 （ liquid chromatography–mass spectrometry: LC–MS） に
よ り 、 ヒ ト 尿 中 GHRP-2 お よ び そ の 代 謝 物 の 分 析 法 の 開 発 を 行 っ た 。
2.2
実験の部
2.2.1
試薬および材料
血 清 中 GH 同 族 体 定 量 用 の イ ム ノ ア ッ セ イ キ ッ ト は 、 CMZ-Assays GmbH（ Berlin,
Germany）か ら 購 入 し た も の を 使 用 し た 。蒸 留 水 は 、Milli-Q ultra pure system（ Millipore）
で 製 造 し た 。ソ マ ト ロ ピ ン BS（ 22-kDa rhGH, 5 mg）お よ び GHRP 科 研 100 ®（ Pralmorelin
dihydrochloride 100 μg/10 mL, GHRP-2） は 、 そ れ ぞ れ サ ン ド （ Tokyo, Japan） お よ び 科
研 製 薬 （ Tokyo, Japan） よ り 購 入 し た 。 グ リ シ ン は 、 国 産 化 学 （ Tokyo, Japan） よ り 購
入 し た 。グ リ セ ロ ー ル は Sigma、ト リ フ ル オ ロ 酢 酸（ Trifluoroacetic acid: TFA）は ナ カ
ラ イ テ ス ク （ Kyoto, Japan） か ら そ れ ぞ れ 購 入 し た 。 固 相 抽 出 用 の Oasis ® HLB カ ー ト
リ ッ ジ （ 60 mg/3 mL） は Waters か ら 購 入 し た 。 GHRP-2（ 95.9%, Figure 2-2A）、 AK-6
（ 99.2%, Figure 2-2B）、 AF-6（ 99.6%, Figure 2-2C）、 AA-3（ 99.2%, Figure 2-2D） お よ
び I.S.と し て 用 い た 安 定 同 位 体 標 識 GHRP-2（ D-Ala-D-(β-naphthyl-)Ala-Ala-Trp-Phe*Lys-NH 2 , C 3 6 H 55 N 8 O 6 13 C 9 1 5 N, 99.2%, *が ラ ベ ル 化 ア ミ ノ 酸 ）は GL Biochem Ltd.（ Shanghai,
China）に 依 頼 し て 合 成 し た 。そ の 他 の 試 薬 は 特 級 用 も し く は HPLC グ レ ー ド を 使 用 し
た。
Figure 2-2. Chemical structures of (A) GHRP-2, (B) AK-6, (C) AF-6 and (D) AA-3.
42
2.2.2
Calibrator の 調 製
GHRP-2 お よ び AA-3 は 、 蒸 留 水 に よ り 溶 解 し 、 100 μg/mL に 調 製 し た も の を Stock
solution と し た 。さ ら に 、蒸 留 水 を 用 い て 250 ng/mL に 調 製 し た も の を Working solution
と し た 。定 量 用 Calibrator は 、薬 物 服 用 の 無 い 健 常 者 の 尿 試 料 に Working solution を 加
え 、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9 お よ び 10 ng/mL に 調 製 し た 。本 章 で 記 載 す る 濃
度は、特に断りがなければ遊離体の濃度とした。
2.2.3
ヒト尿試料の前処理方法
遠 心 分 離 し て あ ら か じ め 沈 渣 を 除 い た ヒ ト 尿 試 料 5 mL に 、 I.S.と し て 50 μL の 安 定
同 位 体 標 識 GHRP-2（ 2 μg/mL）、 1 mL の 2M グ リ シ ン 水 溶 液 （ HCl で pH 2.2 に 調 整 ）
を 加 え て pH 2.5 と し 、 固 相 抽 出 カ ー ト リ ッ ジ （ Oasis ® HLB） に 全 量 を 供 し た 。 次 に 、
1 mL の 0.1% TFA で 洗 浄 し 、 2 mL の 0.5% グ リ セ ロ ー ル in CH 3 OH で 溶 出 し た 。 溶 出
液 を 40 °C で 窒 素 気 流 下 蒸 発 乾 固 し た 。残 渣 を 100 μL の 0.1% TFA/CH 3 CN（ 90:10, v/v）
で 再 溶 解 し 、 遠 心 分 離 （ 1000 g） 後 の 上 清 を LC–MS シ ス テ ム に 注 入 し た 。
2.2.4
精密質量分析
HPLC シ ス テ ム は 、Agilent 1100 HPLC を 使 用 し 、飛 行 時 間 型 質 量 分 析（ time-of-flight
mass spectrometry: TOF–MS） に は 、 QSTAR XL MS/MS（ AB Sciex, CA, USA） を 使 用 し
た 。 分 析 カ ラ ム は 、 Supelco Discovery C 18 （ 4.0 mm × 50 mm, 粒 径 1.7 μm, Sigma） を 使
用 し 、 移 動 相 に は 0.1% TFA（ 移 動 相 A） と 100% CH 3 CN（ 移 動 相 B） を 用 い た 。 カ ラ
ム 温 度 は 25 °C、 流 速 は 0.25 mL/分 と し 、 グ ラ ジ エ ン ト 溶 出 し た 。 グ ラ ジ エ ン ト 条 件
は 、 35% B か ら 6 分 で 85% B ま で リ ニ ア グ ラ ジ エ ン ト 溶 出 し 、 2 分 間 保 持 し 、 た だ ち
に 35% B に 戻 し 、 2 分 間 保 持 し て 移 動 相 初 期 条 件 で 平 衡 化 し た 。 注 入 量 は 10 μL と し
た 。TOF–MS 分 析 に お け る イ オ ン 化 は positive mode に よ る エ レ ク ト ロ ス プ レ ー イ オ ン
化 （ electrospray ionization: ESI） と し た 。 イ オ ン ス プ レ ー 温 度 は 450 °C と し 、 イ オ ン
ソ ー ス 電 圧 は 5500 V に 設 定 し た 。 Declustering potential お よ び focusing potential は 、
そ れ ぞ れ 50 V お よ び 250 V に 設 定 し た 。 ネ ブ ラ イ ザ ー ガ ス （ 2.85 L/分 ） と auxiliary
ガ ス（ 4.80 L/分 ）に は 窒 素 を 用 い た 。TOF–MS 測 定 に お け る 質 量 範 囲 は m/z 100− 1000、
質 量 分 解 能 は 10000 と し た 。 TOF–MS シ ス テ ム は 、 測 定 前 に NaCsI と iPD1 に よ り 質
量校正を行った。
2.2.5
UPLC–MS/MS
LC–MS に お け る カ ラ ム 分 離 に は 、 ultra performance liquid chromatography（ UPLC）
を 用 い 、質 量 分 析 は 、tandem mass spectrometry（ MS/MS）に よ り 行 っ た 。UPLC–MS/MS
シ ス テ ム は Acquity UPLC/ト リ プ ル 四 重 極 型 質 量 分 析 計 TQD（ Waters） を 用 い た 。 分
析 カ ラ ム は Acquity UPLC BEH C 1 8 （ 2.1 mm × 50 mm, 粒 径 1.7 μm, Waters） を 使 用 し 、
移 動 相 は 0.1 % TFA（ 移 動 相 A）お よ び 100% CH 3 CN（ 移 動 相 B）と し 、グ ラ ジ エ ン ト
43
溶 出 し た 。 グ ラ ジ エ ン ト 条 件 は 、 10% B で 1 分 間 保 持 し 、 7 分 で 35% B ま で リ ニ ア グ
ラ ジ エ ン ト 溶 出 し 、 さ ら に 、 8 分 で 80% B ま で リ ニ ア グ ラ ジ エ ン ト 溶 出 し 、 た だ ち に
10% B に 戻 し 、2 分 間 保 持 し て 移 動 相 初 期 条 件 で 平 衡 化 し た 。分 析 時 間 は 10 分 と し た 。
カ ラ ム 温 度 は 25 °C と し 、流 速 は 0.5 mL/分 に 設 定 し た 。注 入 量 は 10 μL と し た 。イ オ
ン 化 は ESI（ positive mode）と し た 。イ オ ン ス プ レ ー 温 度 お よ び 脱 溶 媒 温 度 は 、そ れ ぞ
れ 120 °C お よ び 400 °C に 設 定 し た 。 キ ャ ピ ラ リ ー 電 圧 は 3.5 kV に 設 定 し た 。 コ ー ン
ガ ス（ 50 L/時 ）お よ び 脱 溶 媒 ガ ス（ 600 L/時 ）に は 、窒 素 を 使 用 し た 。コ ー ン 電 圧（ cone
voltage: CV） は 26 V に 設 定 し 、 衝 突 ガ ス （ 0.2 mL/分 ） に は 、 ア ル ゴ ン を 使 用 し た 。
ス キ ャ ン 測 定 に お け る 質 量 範 囲 は m/z 70− 850 に 設 定 し た 。 衝 突 誘 起 開 裂
（ collision-induced dissociation: CID） 測 定 に お い て は 、 プ ロ ダ ク ト イ オ ン ス キ ャ ン 測
定 に お け る コ リ ジ ョ ン 電 圧（ collision energy: CE）を 15 eV に 設 定 し 、プ リ カ ー サ ー イ
オ ン は 、m/z 410、m/z 415 お よ び m/z 358 に 設 定 し た 。プ ロ ダ ク ト イ オ ン ス キ ャ ン に お
け る 質 量 範 囲 は 、 m/z 50− 850 に 設 定 し た 。 多 重 反 応 モ ニ タ リ ン グ （ multiple reaction
monitoring: MRM）の 測 定 パ ラ メ ー タ ー は 、Table 2-2 に 示 し た 。GHRP-2、AA-3 お よ び
安 定 同 位 体 標 識 GHRP-2 の mass transition は 、そ れ ぞ れ m/z 410>170（ CE: 26 eV）、m/z
358>170（ CE: 28 eV）、m/z 415>170（ CE: 24 eV）に 設 定 し た 。分 離 の 確 認 の た め 、AK-6
と AF-6 の mass transition は 、そ れ ぞ れ m/z 410.5>170（ CE: 26 eV, CV: 22V）、m/z 691>170
（ CE: 60 eV, CV: 30V）に 設 定 し た 。測 定 前 に NaCsI を 用 い て 装 置 の 質 量 校 正 を 行 っ た 。
Table 2-2. UPLC–MS/MS parameters
Peptide
Analysis
Qualitative
(m/z )
Relative ion
abundance
(%)
Collision
energy
(eV)
Cone
voltage
(V)
410>241
100
15
26
410>170
59.7
15
26
410>269
62.5
15
26
410>550
45.8
15
26
410>129
45.9
15
26
26
26
Mass transition
GHRP-2
Quantitative
Qualitative
410>170
358>241
100
15
26
358>269
43.2
15
26
358>170
37.4
15
26
358>198
36.6
15
26
358>287
26.9
15
26
AA-3
stable isotope-labeled
GHRP-2 (I.S.)
Quantitative
358>170
28
26
Qualitative/
Quantitative
415>170
24
26
44
2.2.6
2.2.6.1
UPLC–MS/MS 法 の メ ソ ッ ド バ リ デ ー シ ョ ン
妨害物質の確認
分 析 対 象 ペ プ チ ド の t R に お い て 、 夾 雑 す る ピ ー ク の 検 出 有 無 を 確 認 す る た め 、 20
種 類 の 異 な る ブ ラ ン ク 尿 試 料 を 2.2.3 項 に 従 い 前 処 理 し 、2.2.5 項 に 従 い 測 定 に 供 し た 。
2.2.6.2
直線性
2.2.2 項 に 従 い 調 製 し た 検 量 線 用 添 加 尿 試 料 を 2.2.3 項 に 従 い 前 処 理 し 、2.2.5 項 に 従
い 測 定 し た 。 検 量 線 濃 度 は 、 0.5 – 10 ng/mL の 11 点 と し た 。 調 製 濃 度 を x 軸 に 、 得 ら
れ た 分 析 対 象 ペ プ チ ド の ピ ー ク 面 積 の I.S.に 対 す る ピ ー ク 面 積 比 を y 軸 に と り 、 最 小
二 乗 法 に よ り 直 線 一 次 回 帰 式 y = ax + b を 求 め た 。
2.2.6.3
回収率
10 種 類 の 異 な る ブ ラ ン ク 尿 試 料 に 分 析 対 象 ペ プ チ ド を 添 加 し て 10 ng/mL に 調 製 し 、
2.2.3 項 に 従 い 前 処 理 し た 。一 方 、10 種 類 の 異 な る ブ ラ ン ク 尿 試 料 を 2.2.3 項 の 固 相 抽
出 後 、 同 量 の 分 析 対 象 ペ プ チ ド を 添 加 し た も の を 100%回 収 さ れ た 比 較 試 料 と し て 、
2.2.5 項 に 従 い 同 時 に 測 定 し た 。UPLC–MS/MS 測 定 に お け る 注 入 量 補 正 の た め 、I.S.は
固 相 抽 出 後 に 添 加 し た 。UPLC–MS/MS 測 定 に よ り 得 ら れ た 分 析 対 象 ペ プ チ ド の ピ ー ク
面 積 と I.S.の ピ ー ク 面 積 と の 比 率 を 算 出 し 、固 相 抽 出 前 後 の ピ ー ク 面 積 比 を 比 較 し て 、
10 種 類 の 異 な る ブ ラ ン ク 尿 試 料 に お け る 平 均 回 収 率 を 算 出 し た 。
2.2.6.4
検出下限
10 種 類 の 異 な る ブ ラ ン ク 尿 試 料 お よ び そ れ ぞ れ に 分 析 対 象 ペ プ チ ド を 0.5 ng/mL と
な る よ う に 添 加 し た 尿 試 料 を 、 2.2.3 項 に 従 い 同 時 に 前 処 理 し 、 2.2.5 項 に 従 い 測 定 し
た 。 ブ ラ ン ク 尿 試 料 の 分 析 対 象 ペ プ チ ド 溶 出 位 置 の 平 均 ピ ー ク 面 積 比 と SD n - 1 を 算 出
し た 。 こ の シ グ ナ ル の 3 倍 （ signal-to-noise ratio: S/N ≥ 3） と な る ピ ー ク 面 積 比 と 0.5
ng/mL 添 加 尿 試 料 の ピ ー ク 面 積 比 の 比 較 に よ り 、 検 出 下 限 （ limit-of-detection: LOD）
濃度を算出した。
2.2.6.5
日内再現性および日間再現性
精 度 確 認 用 試 料 と し て 、低 濃 度（ 1 ng/mL）、中 濃 度（ 4 ng/mL）お よ び 高 濃 度（ 9 ng/mL）
の 分 析 対 象 ペ プ チ ド 添 加 尿 試 料 を 調 製 し た 。 各 濃 度 n = 10 の 尿 試 料 を 2.2.3 項 に 従 い
前 処 理 し 、2.2.5 項 に 従 い 測 定 し た 。2.2.6.2 項 に 従 い 、検 量 線 試 料 を 同 時 に 前 処 理 、測
定 し 直 線 一 次 回 帰 式 y = ax + b を 求 め た 。y に 精 度 確 認 用 試 料 か ら 得 ら れ た ピ ー ク 面 積
比を代入して、濃度 x を算出した。その濃度を基にして、各濃度域での正確度および
精度を算出した。さらに、日内再現性試験を異なる 3 日間実施し、日間再現性を確認
し た 。 各 濃 度 域 で の 正 確 度 お よ び 精 度 を n = 30（ 10 デ ー タ × 3 日 ） で 算 出 し た 。
45
正 確 度 お よ び 精 度 は 、 そ れ ぞ れ 次 式 （ 4） お よ び （ 5） に よ り 算 出 し た 。
正 確 度 （ %） ＝ 100 ×（ 測 定 値 平 均 − 調 製 濃 度 ） / 調 製 濃 度
（ 4）
精 度 （ %） ＝ 100 × 測 定 値 の SD n - 1
（ 5）
2.2.6.6
/
測定値平均
イオンサプレッション
マトリックスによるイオンサプレッション効果の有無を、ポストカラムインフュー
ジ ョ ン に よ り 確 認 し た 。シ リ ン ジ ポ ン プ を カ ラ ム 出 口 に T 字 コ ネ ク タ ー に よ り 装 着 し 、
分 析 対 象 ペ プ チ ド の 標 準 溶 液 を 送 液 し た （ 各 ペ プ チ ド の 濃 度 ： 1.0 μg/mL, 流 速 10 μL/
分 ）。 次 に 、 異 な る 10 種 類 の ブ ラ ン ク 尿 試 料 を 2.2.3 項 に よ り 前 処 理 し 、 2.2.5 項 に 従
い UPLC–MS/MS に お い て 測 定 し た 。 各 分 析 対 象 ペ プ チ ド の t R に お い て 、 ベ ー ス ラ イ
ンの変動や低下の有無を観測した。
2.2.6.7
キャリーオーバー
高 濃 度 に 調 製 し た 分 析 対 象 ペ プ チ ド 添 加 尿 試 料 （ 50 ng/mL） と ブ ラ ン ク 尿 試 料 を
2.2.2 項 に 従 い 、同 時 に 前 処 理 し た 。次 に 、高 濃 度 添 加 尿 試 料 を 2.2.5 項 に 従 い 、UPLC–
MS/MS 測 定 の 最 初 に 分 析 し 、引 き 続 き ブ ラ ン ク 尿 試 料 を 連 続 し て 測 定 し た 。ブ ラ ン ク
尿 試 料 か ら 得 ら れ た 分 析 対 象 ペ プ チ ド の MRM ク ロ マ ト グ ラ ム 上 の t R に お け る ピ ー ク
の検出有無を確認した。
2.2.7
GH isoform differential immunoassay に よ る 血 清 中 GH 同 族 体 の 測 定
血 清 中 GH 同 族 体 の 定 量 は 、「 GH isoform differential immunoassay」 に 基 づ き 、 ド イ
ツ CMZ-Assays 社 製 イ ム ノ ア ッ セ イ キ ッ ト を 使 用 し た 。血 清 試 料 は キ ッ ト 付 属 の 方 法
に 従 っ て 前 処 理 し た 。要 約 す る と 、定 量 用 Calibrator で あ る pituitary-derived hGH（ 80/505,
National Institute for Biological Standards and Control:NIBSC, Hertfordshire, UK） を 0.5
mL の 羊 血 清 に 再 溶 解 し 、 QC sample を 0.5 mL の ヒ ト 血 清 に 再 溶 解 し た 。 こ れ ら の 試
料 お よ び 血 清 試 料 50 μL（ n = 2） を 抗 体 が コ ー テ ィ ン グ さ れ た プ ラ ス テ ィ ッ ク チ ュ ー
ブ に 採 り 、 incubation buffer（ pH 9） を 150 μL 加 え 、 室 温 で 2 時 間 イ ン キ ュ ベ ー シ ョ
ン し た 。 洗 浄 後 、 200 μL の 検 出 抗 体 （ AK569 labeled with Acridinium-NHSEster） を 加
え 、遮 光 下 で 2 時 間 イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン し た 。洗 浄 後 、酸 性 過 酸 化 水 素 水 お よ び NaOH
を 加 え 、洗 浄 後 1 時 間 以 内 に Auto Lumat Plus LB953（ Berthold Technologies GmbH, Bad
Wildbad, Germany） に よ り 化 学 発 光 検 出 を 行 っ た
58 ,5 9 ,61 )
。キットは、一次スクリーン
グ 用 の Kit-1 お よ び 確 認 検 査 用 の Kit-2 の 2 つ の キ ッ ト か ら 構 成 さ れ 、ま た 、各 々 の キ
ッ ト に よ り 、 Rec 濃 度 （ Kit-1 の 場 合 Rec1, Kit-2 の 場 合 Rec2） お よ び Pit 濃 度 （ Kit-1
の 場 合 Pit1, Kit-2 の 場 合 Pit2）を 測 定 し 、Rec/Pit 比（ Kit-1 の 場 合 Rec/Pit1, Kit-2 の 場
合 Rec/Pit2） を 算 出 し た 。
46
2.2.8
ヒト試料
投 与 試 験 お よ び ヒ ト 試 料 の 取 り 扱 い に 関 し て は 、 第 1 章 の 1.2.6 項 に 記 載 ど お り に
行 っ た 。GH の 運 動 に 対 す る 分 泌 率 は BMI に 依 存 し て い る と の 報 告 が あ る
62 ,6 3)
。そ こ
で、投与試験の期間はアルコール、カフェイン、グレープフルーツ、サプリメント、
薬 物 の 摂 取 お よ び 運 動 の 実 施 を 不 可 と し た 。「 GH isoform differential immunoassay」 に
おいて使用する血清試料採取については、採血方法、採血器具など細目にわたって規
定 さ れ て い る た め 、 採 取 に あ た っ て は WADA ガ イ ド ラ イ ン に 従 い 採 血 し た
59 )
。採血
®
管 は 、 血 清 分 離 剤 入 り の BD Vacutainer SST™-II（ Becton Dickinson and Company,
Franklin Lakes, NJ, USA）を 用 い た 。な お 、分 析 に 供 す る ま で 血 清 試 料 は –80 °C に 、尿
試 料 は –20 °C に そ れ ぞ れ 保 管 し た 。
2.2.8.1
日本人健常男性（非競技者）
100 名 の 非 競 技 者 で あ る 日 本 人 健 常 男 性 （ 年 齢 ： 20 – 66 才 , BMI: 15.7 – 32.4） を 対
象とした。食事の制限は特に実施しなかった。
2.2.8.2
rhGH の 単 回 皮 下 投 与 試 験
日 本 人 健 常 男 性 5 名 （ subjects-1 – 5M, 年 齢 : 20 – 37 才 , BMI: 18.8 – 21.8） を 対 象 と
し て 、 午 前 9 時 （ 空 腹 時 ） に rhGH 注 射 薬 ソ マ ト ロ ピ ン BS（ 0.04 mg/kg） を 皮 下 注 射
に よ り 投 与 し た 。 採 血 は 、 投 与 前 24、 23、 22、 21、 20、 18、 16、 12 時 間 、 投 与 直 前 、
投 与 後 1、 2、 3、 4、 5、 6、 8、 12、 24、 27、 34 お よ び 48 時 間 に 実 施 し た 。
2.2.8.3
GHRP-2 の 単 回 静 脈 内 投 与 試 験
日 本 人 健 常 男 性 10 名 （ 年 齢 ： 22 – 40 才 , BMI: 21.3 ± 1.8） を 対 象 と し て 、 午 前 9 時
（ 空 腹 9 時 ） に GHRP 科 研 100 ® 注 射 剤 を 5 mL/分 で 2 分 間 （ 100μg GHRP-2 塩 酸 塩 ）
持 続 静 脈 内 投 与 し た 。 採 血 は 、 投 与 前 24、 22.5、 19.5、 15、 14、 11 時 間 、 投 与 直 前 、
投 与 後 0.5、 1、 1.5、 4.5、 7、 10、 13、 24、 25.5、 28.5、 31、 34、 37、 48、 49.5、 52.5、
55、 58、 61、 72 お よ び 504 時 間 に 実 施 し た 。 尿 試 料 は 、 投 与 24 時 間 前 か ら 投 与 後 72
時間まで全量を採取した。
2.2.8.4
rhGH と GHRP-2 の 併 用 投 与 試 験
日 本 人 健 常 男 性 10 名 （ 年 齢 : 20 – 33 才 , BMI: 19.2 – 21.5） を 対 象 と し て 、 午 前 9 時
（ 空 腹 時 ）に rhGH 注 射 薬 ソ マ ト ロ ピ ン BS（ 0.04 mg/kg）を 皮 下 注 射 に よ り 投 与 し た 。
rhGH 投 与 2 時 間 後 に 、GHRP 科 研 100 ® 注 射 剤 を 5 mL/分 で 2 分 間（ 100μg GHRP-2
塩 酸 塩 ）持 続 静 脈 内 投 与 し た 。採 血 は 、投 与 前 24、23、22、21、20、18、16、12 時 間 、
rhGH 投 与 直 前 、rhGH 投 与 後 1、2（ GHRP-2 投 与 直 前 ）、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、
6、8、12、24、27、34 お よ び 48 時 間 に 実 施 し た 。尿 試 料 は 、投 与 24 時 間 前 か ら 投 与
後 48 時 間 ま で 全 量 を 採 取 し た 。
47
2.2.9
統計解析
統 計 解 析 に は 、 StatFlex 4.2（ Artech Inc., Osaka, Japan） を 使 用 し た 。 ノ ン パ ラ メ ト
リ ッ ク な マ ン –ホ イ ッ ト ニ ー の U 検 定 お よ び ウ ィ ル コ ク ソ ン の 符 号 順 位 検 定 に よ り 、P
< 0.05 を 統 計 学 的 有 意 差 あ り と 判 断 し た 。
2.3
結果および考察
日 本 人 健 常 男 性 の 血 清 試 料 、rhGH 投 与 後 血 清 試 料 、GHRP-2 投 与 後 血 清 試 料 お よ び
rhGH と GHRP-2 併 用 投 与 後 血 清 試 料 を 「 GH isoform differential immunoassay」 に よ り
測 定 し 、現 行 の ド ー ピ ン グ 検 査 法 の 妥 当 性 を 検 討 し た 。次 い で 、UPLC–MS/MS に よ り 、
ヒ ト 尿 中 か ら GHRP-2 お よ び そ の 代 謝 物 を 検 出 す る ド ー ピ ン グ 検 査 法 の 開 発 を 行 っ た 。
2.3.1
GH isoform differential immunoassay に よ る 血 清 中 GH 同 族 体 の 測 定
は じ め に 、「 GH isoform differential immunoassay」 キ ッ ト の メ ソ ッ ド バ リ デ ー シ ョ ン
を 行 っ た 。キ ッ ト は 一 次 ス ク リ ー ニ ン グ 用 の Kit-1、確 認 検 査 用 の Kit-2 か ら 構 成 さ れ 、
各 キ ッ ト に よ り 22-kDa GH 濃 度 （ Rec） お よ び そ の 他 の 内 因 性 GH 同 族 体 濃 度 （ Pit）
を 測 定 し た 。 そ の 結 果 、 血 清 中 GH 濃 度 を 異 な る 5 濃 度 に お い て 、 5 日 間 測 定 し た 日
間 再 現 性（ CV%）は 、Kit-1 の Rec（ Rec1）が 3.5 – 4.3%、Kit-2 の Rce（ Rec2）が 2.3 –
4.9%で あ っ た 。 同 様 に 、 Kit-1 の Pit（ Pit1） お よ び Kit-2 の Pit（ Pit2） は 、 そ れ ぞ れ
3.2 – 5.3%、 2.2 – 6.0%と 良 好 な 精 度 で あ っ た 。 Rec1、 Rec2、 Pit1 お よ び Pit2 の LOD
濃 度 は 、 そ れ ぞ れ 0.001、 0.001、 0.003 お よ び 0.005 ng/mL で あ っ た 。 定 量 下 限
（ limit-of-quantification: LOQ） 濃 度 は 4 種 類 の キ ッ ト す べ て 0.05 ng/mL で あ っ た 。
日 本 人 健 常 男 性 の 血 清 中 GH 濃 度（ Rec, Pit）お よ び Rec と Pit の 比 率（ Kit-1 の 場 合
Rec/Pit1, Kit-2 の 場 合 Rec/Pit2）を 算 出 し た 。Kit-1 に よ る 結 果 を 、Table 2-3A に 示 し た 。
106 名 の 健 常 者 が 試 験 に 参 加 し た が 、 6 名 に つ い て は GH 濃 度 が LOQ 濃 度 を 下 回 っ た
た め 母 集 団 か ら 除 外 し 、 計 100 名 の 日 本 人 非 競 技 者 に お い て 統 計 解 析 処 理 を 行 っ た 。
Rec1 お よ び Pit1 の 濃 度 は 、そ れ ぞ れ 0.05 – 7.92 ng/mL（ median 0.15 ng/mL）お よ び 0.05
– 13.54 ng/mL（ median 0.25 ng/mL） で あ っ た 。 Rec/Pit1 は 、 0.26 – 1.55（ median 0.71）
で あ っ た 。 日 本 人 健 常 男 性 の 基 準 値 上 限 の Rec/Pit1 は 、 平 均 + 2SD n-1 （ n = 100） を も
と に 算 出 し た と こ ろ 1.17 で あ っ た （ Table 2-3A JPN upper）。 日 本 人 健 常 男 性 100 名 の
Rec/Pit1 比 は 、WADA の 設 定 し た GH ド ー ピ ン グ 判 定 閾 値
84)
1.68 を 下 回 る 結 果 で あ り 、
WADA の 設 定 し た 閾 値 は 、 偽 陽 性 結 果 を 与 え ず 妥 当 で あ る と 云 え る 。
48
Table 2-3. Statistical analysis of GH concentrations and Rec/Pit1 ratios in Japanese healthy
volunteers, rhGH treated subjects and GHRP-2 treated subjects
Kit 1
GH (ng/mL)
Rec1
Rec/Pit1 ratio
Pit1
(A) Japanese healthy male subjects, n = 100
Mean
0.50
0.74
0.71
SDn-1
1.21
1.75
0.23
Minimum
0.05
0.05
0.26
Maximum
7.92
13.54
1.55
Median
0.15
0.25
0.71
75th percentile
0.27
0.42
0.82
25th percentile
95% Confidence Interval
0.09
0.13
0.55
0.27 - 0.74
0.39 - 1.08
0.66 - 0.75
JPN upper (Mean + SDn-1)
1.17
(B) rhGH treated male subjects, n = 45 (5 individuals x 9 data, 1-24h)
Mean
12.82
5.07
2.62
Minimum
0.14
0.09
0.71
Maximum
28.44
14.19
4.93
Median
12.76
4.67
2.51
75th percentile
19.09
7.49
3.01
25th percentile
95% Confidence Interval
7.74
2.76
2.10
10.73 - 14.91
4.15 - 5.98
2.34 - 2.90
(C) GHRP-2 treated male subjects, n = 80 (10 individuals x 8 data, 0.5-24h)
Mean
18.74
23.52
0.68
Minimum
0.05
0.05
0.22
Maximum
1.05
132.77
168.60
Median
0.30
0.53
0.69
75th percentile
25.96
34.08
0.89
25th percentile
0.10
0.16
0.55
11.80 - 25.68
15.09 - 31.95
0.63 - 0.73
95% Confidence Interval
rhGH 0.04 mg/kg を 5 名 の 男 性 被 験 者 に 皮 下 投 与 し た 前 後 の 血 清 中 GH 濃 度 （ Rec1
お よ び Pit1）の 変 化 を Figure 2-3A に 示 し た 。Rec1 濃 度 は 、投 与 前 の 平 均 が 0.88 ng/mL
（ 0.05 – 7.33 ng/mL）で あ っ た 。投 与 後 4 時 間 で は 、平 均 が 18.70 ng/mL（ 13.49 – 28.44
ng/mL） ま で 上 昇 し 、 24 時 間 後 に 投 与 前 の 濃 度 へ 戻 っ た 。 Figure 2-3B に は 、 Rec/Pit1
の 変 化 を 示 し た 。 投 与 前 の 平 均 の Rec/Pit1 は 、 0.61（ 0.26 – 1.00） で あ っ た が 、 投 与 4
時 間 後 に は 3.55（ 2.73 – 4.47） ま で 上 昇 し た 。 被 験 者 5 名 の Rec/Pit1 は 、 rhGH の 単 回
皮 下 投 与 後 、平 均 4 時 間 で 最 大 を 示 し た 。Table 2-3B に は 、投 与 後 1 時 間 か ら 24 時 間
ま で の デ ー タ を 集 計 し た 統 計 解 析 デ ー タ を 示 し た 。ま た 、Figure 2-4（ 左 図 ）に 、Rec/Pit1
の Box plot デ ー タ を 示 し た 。 そ の 結 果 、 rhGH 投 与 後 の Rec/Pit1 は 、 日 本 人 健 常 男 性
（ JPN） と 比 較 し て 有 意 に 高 値 を 示 し た （ P < 0.001）。 健 常 男 性 （ JPN） の 基 準 上 限 値
（ 1.17） を 超 え た 期 間 は 、 投 与 後 12 時 間 （ subject-1M お よ び subject-2M）、 24 時 間
（ subject-3M）、 27 時 間 （ subject-5M） お よ び 34 時 間 （ subject-4M） で あ っ た 。 ま た 、
被 験 者 5 名 す べ て が 、 WADA が 設 定 し た 閾 値 1.68 を 超 え 、 rhGH ド ー ピ ン グ の 検 出 が
可能であった。
49
B)
A)
5.00
140
130
JPN (Median, n=100)
4.00
110
Rec1 (Mean, n=5)
100
80
Rec/Pit1
ratio
70
JPN uppeer (+ 2SD, n=100)
3.50
Pit 1 (Mean, n=5)
90
Conc.
ng/mL
rhGH treated (n=5)
4.50
120
rhGH Injection
60
3.00
rhGH Injection
2.50
2.00
50
40
1.50
30
1.00
20
0.50
10
0.00
0
-24
-22
-20
-16
0
2
4
6
12
27
-24
48
-22
-20
-16
0
2
6
12
27
48
34
48
D)
C)
5.00
140
130
Rec1 (Mean, n=10)
120
Pit 1 (Mean, n=10)
110
100
4.50
GHRP-2 treated (n=10)
4.00
JPN uppeer (+ 2SD, n=100)
JPN (Median, n=100)
3.50
90
Conc.
ng/mL
4
Time (h)
Time (h)
80
Rec/Pit1
ratio
GHRP-2
Injection
70
60
3.00
GHRP-2 Injection
2.50
2.00
50
1.50
40
30
1.00
20
0.50
10
0.00
0
-24
-20
-14
0
1
5
10
24
29
34
-24
48
-20
-14
0
1
5
24
29
F)
E)
5.00
140
130
Rec1 (Mean, n=10)
120
Pit 1 (Mean, n=10)
GHRP-2 Injection
110
4.00
100
3.50
80
Rec/Pit1
ratio
70
GHRP-2
Injection
60
50
JPN (Median, n=100)
JPN uppeer (+ 2SD, n=100)
3.00
2.50
rhGH Injection
2.00
rhGH
Injection
40
rhGH/GHRP-2 treated (n=10)
4.50
90
Conc.
ng/mL
10
Time (h)
Time (h)
1.50
30
1.00
20
0.50
10
0.00
0
-24 -22 -20 -16
0
2
3
4
5
6
10
24
-24 -22 -20 -16
34
0
2
3
4
5
6
10
24
34
Time (h)
Time (h)
Figure 2-3. Change in absolute GH concentrations (left) and ratios Rec/Pit1 (right). The
whiskers indicate mean ± standard deviation. JPN means the median of Japanese male
populations (n = 100). JPN upper means Japanese male reference upper limit.
(A,B: rhGH injection; C,D: GHRP-2 injection; E,F: rhGH/GHRP-2 injections)
50
4.0
4.0
Rec/Pit2
6.0
Rec/Pit1
6.0
2.0
2.0
0.0
0.0
JPN male rhGH treated GHRP-2 treated
(n=100)
(n=45)
(n=80)
JPN male rhGH treated GHRP-2 treated
(n=100)
(n=45)
(n=80)
Figure 2-4. Box plots of Rec/Pit ratios from rhGH treated (5 individuals × 9 data, 1 – 24 h
after administration) and GHRP-2 treated (10 individuals × 8 data, 0.5 – 24 h after
administration) compared with Japanese male subjects (JPN male, n = 100). The median
value is shown as a line across the box. The upper edge of the box indicates 75 t h percentile of
the data, and the lower edge indicates the 25 th percentile of the data. The whiskers indicate
the maximum and minimum including the outliers. (left: Kit 1, right: Kit 2)
Nonparametric Mann-Whitney U-test : JPN vs rhGH treated (P < 0.001) and JPN vs
GHRP-2 treated (P > 0.05).
次 に 、内 因 性 GH の 下 垂 体 か ら の 分 泌 を 刺 激 す る GHS の 一 つ GHRP-2 の 使 用 は 、
「 GH
isoform differential immunoassay」 に よ り 検 知 可 能 か 否 か の 検 討 を 行 っ た 。 GHRP-2 静
脈 内 投 与 前 後 の血 清 中 GH 濃 度 （ Rec1 お よ び Pit1） の 変 化 を 、 Figure 2-3C に 示 し た 。
投 与 前 の 平 均（ 投 与 24 時 間 前 か ら 投 与 直 前 ）の Rec1 は 、0.80 ng/mL（ 0.05 – 21.90 ng/mL）
で あ っ た 。 投 与 後 0.5 時 間 で は 、 平 均 の Rec1 は 、 77.4 ng/mL（ 29.1 – 132.8 ng/mL） ま
で 上 昇 し た 。ま た 、投 与 前 の 平 均 の Pit1 は 、1.12 ng/mL（ 0.05 – 24.99 ng/mL）で あ り 、
投 与 後 0.5 時 間 で は 、 86.6 ng/mL（ 33.1 – 168.6 ng/mL） ま で 上 昇 し た 。 こ の よ う に 、
GHRP-2 の 投 与 に よ り 強 い 内 因 性 GH の 分 泌 が 観 測 さ れ た 。 し か し 、 投 与 前 で も 高 値
を 示 し て い る 例 （ subject-10） も 認 め ら れ た よ う に 、 GH 分 泌 は 睡 眠 、 ス ト レ ス 、 運 動
や 食 事 に よ る 影 響 を 受 け 、 日 内 で 脈 動 的 に 分 泌 さ れ る 。 故 に 、 GH の 絶 対 濃 度 に よ る
ド ー ピ ン グ 判 定 は 困 難 と 考 え ら れ る 。 Rec/Pit1 の 投 与 前 後 の 変 化 を 、 Figure 2-3D に 示
し た 。 投 与 前 の 平 均 の Rec/Pit1 は 、 0.72（ 0.32 – 1.09） で あ っ た が 、 投 与 0.5 時 間 後 で
は 、0.91（ 0.79 – 0.98）で あ り 、顕 著 な 上 昇 は 観 察 さ れ な か っ た 。こ の よ う に 、GHRP-2
投 与 に よ り 、 Rec1 お よ び Pit1 と も に 上 昇 し た も の の 、 Rec/Pit1 は 10 名 の 被 験 者 す べ
てにおいて、日本人健常男性の基準上限値以下であった。ここで注目する点は、投与
4.5 時 間 後 で 平 均 の Rec/Pit1 は 、0.32（ 0.22 – 0.59）と 減 少 傾 向 を 示 し て い る 点 で あ る 。
51
理 由 は 不 明 で あ る が 、GHS 受 容 体 を 介 し た 内 因 性 GH の 急 激 な 分 泌 と そ れ に 伴 う 一 時
的 な 内 因 性 GH の 枯 渇 に よ り 、 循 環 血 中 の GH 同 族 体 の 構 成 比 率 に 変 化 が 生 じ て い る
可 能 性 が 考 え ら れ る 。 Table 2-3C に は 、 投 与 後 0.5 時 間 か ら 24 時 間 ま で の デ ー タ を 集
計 し た 統 計 解 析 デ ー タ を 示 し た 。ま た 、Figure 2-4（ 左 図 ）に 、GHRP-2 投 与 後 の Rec/Pit1
の Box plot デ ー タ を 示 し 、日 本 人 健 常 男 性 の Rec/Pit1 と 比 較 し た 。そ の 結 果 、GHRP-2
投 与 後 の Rec/Pit1 は 、 日 本 人 健 常 男 性 と 比 較 し て 有 意 差 を 認 め な か っ た （ P > 0.05）。
このように、GHRP-2 の使 用 は、内 因 性 22-kDa の GH 同 族 体 およびその他 の GH 同 族 体 の分
泌 を共 に刺 激 し、その存 在 比 率 は大 きく変 化 しないため、「 GH isoform differential
immunoassay」 による GHRP-2 使 用 の検 知 は、困 難 であることが明 らかとなった。
次 に 、 GHS（ GHRP-2） の 使 用 が rhGH 検 出 に 及 ぼ す 影 響 を 検 討 す る た め 、 GHRP-2
と rhGH の 併 用 投 与 試 験 を 行 っ た 。 rhGH の 皮 下 投 与 に 続 い て 、 GHRP-2 静 脈 内 投 与 後
の Rec/Pit1 の変 化 を Figure 2-3F に示 した。rhGH 投 与 後 2 時 間 で 、rhGH 単 独 投 与 同 様 に
Rec/Pit1 は 、10 名 の 被 験 者 す べ て に お い て 有 意 に 上 昇 し た（ P < 0.001）。続 い て 、GHRP-2
を 投 与 し た と こ ろ 、 Rec/Pit1 は 、 日 本 人 健 常 男 性 の 基 準 レ ベ ル ま で 急 激 に 減 少 し た 。
Rec/Pit1 は 、 rhGH 投 与 後 最 も 高 値 を 示 し た 2 時 間 後 と 比 較 し て 、 39.9%の 減 少 率 を 示
し た 。 そ の 後 、 再 度 Rec/Pit1 は 上 昇 に 転 じ 、 さ ら に 減 少 す る と い う 二 峰 性 の 推 移 を 示
し た 。こ の 現 象 は 、Figure 2-3E に 示 し た 血 清 中 GH 濃 度（ Rec1 お よ び Pit1）の 変 化 か
ら 、 次 の よ う に 説 明 が 可 能 で あ る 。 ま ず 、 rhGH 投 与 後 の Rec/Pit1 の 上 昇 は 、 血 中 の
外 因 性 GH（ 22-kDa GH） の 濃 度 上 昇 と negative feedback に よ る 内 因 性 GH の 分 泌 抑 制
に よ る も の で あ る 。 引 き 続 き 投 与 さ れ た GHRP-2 が 、 GHS 受 容 体 を 介 し て 内 因 性 GH
の 分 泌 を 再 誘 導 し た 結 果 、Rec1 お よ び Pit1 の 急 激 な 上 昇 に よ り 、Rec/Pit1 を 減 少 さ せ
た も の と 推 定 さ れ る 。 さ ら に 、 血 中 の GHRP-2 の 消 失 後 に は 、 皮 下 投 与 さ れ た rhGH
の 影 響 に よ り 再 び Rec/Pit1 は 上 昇 に 転 じ 、最 終 的 に rhGH の 消 失 に と も な っ て Rec/Pit1
が 投 与 前 の 水 準 に 戻 っ た と 考 え ら れ る 。こ の よ う に 、GHRP-2 の 投 与 は 、rhGH の 使 用
に 起 因 す る 上 昇 し た Rec/Pit1 を 減 少 さ せ 、 rhGH ド ー ピ ン グ の 検 出 を 隠 ぺ い す る こ と
が 可 能 で あ る と 云 え る 。今 回 の 投 与 試 験 は 、GHRP-2 の 静 脈 内 単 回 投 与 で あ っ た た め 、
Rec/Pit1 を 減 少 さ せ た 時 間 は 2 時 間 と 短 時 間 で あ っ た が 、 こ れ は GHRP-2 の 消 失 半 減
期 が 短 い （ 25.2 – 41.4 分 ） た め で あ る
64 )
。しかしながら、実際の不正行為を行う競技
者は、単回投与ではなく、より長期間の隠ぺい効果が得られる可能性のある連続投与
を 行 う こ と が 危 惧 さ れ る 。 こ こ ま で ス ク リ ー ニ ン グ 検 査 用 の Kit-1 の 結 果 に つ い て 述
べ た が 、 確 認 検 査 用 の Kit-2 に つ い て も 同 様 の 結 果 が 得 ら れ た （ Table 2-4、 Figure
2-4(right)お よ び Figure 2-5）。
以 上 の 結 果 、GHRP-2 は 、GH 分 泌 作 用 を 期 待 し て 単 独 で 競 技 者 に ド ー ピ ン グ 目 的 で
使 用 さ れ る だ け で は な く 、rhGH と 併 用 す る こ と で 、GH ド ー ピ ン グ 検 査 を 隠 ぺ い す る
目 的 で 使 用 さ れ る 可 能 性 が あ る と 云 え る 。 故 に 、 GHRP-2 の 使 用 を 直 接 検 出 す る こ と
が 「 GH isoform differential immunoassay」 の 欠 点 を 補 う に は 有 効 な 手 段 で あ り 、 早 急
に対処しなければならないことが明らかとなった。
52
Table 2-4. Statistical analysis of GH concentrations and Rec/Pit2 ratios in Japanese healthy
volunteers, rhGH treated subjects and GHRP-2 treated subjects
Kit 2
GH (ng/mL)
Rec2
Rec/Pit2 ratio
Pit2
(A) Japanese healthy male subjects, n = 100
Mean
0.51
0.86
0.59
SDn-1
1.25
1.91
0.19
Minimum
0.05
0.06
0.21
Maximum
8.05
12.80
1.40
Median
0.15
0.29
0.61
75th percentile
0.30
0.49
0.69
25th percentile
95% Confidence Interval
0.08
0.16
0.46
0.27 - 0.76
0.49 - 1.24
0.56 - 0.63
JPN upper (Mean + SDn-1)
0.97
(B) rhGH treated male subjects, n = 45 (5 individuals x 9 data, 1-24h)
Mean
13.81
7.03
2.17
Minimum
0.16
0.08
0.74
Maximum
27.15
19.65
5.01
Median
13.70
6.15
1.93
75th percentile
20.72
9.53
2.69
25th percentile
95% Confidence Interval
9.24
4.08
1.46
11.60 - 16.02
5.70 - 8.36
1.89 - 2.46
(C) GHRP-2 treated male subjects, n = 80 (10 individuals x 8 data, 0.5-24h)
Mean
18.85
25.86
0.61
Minimum
0.05
0.05
0.20
Maximum
139.13
191.46
0.96
Median
0.30
0.59
0.63
75th percentile
25.97
39.94
0.78
25th percentile
0.09
0.17
0.48
11.96 - 25.75
16.74 - 34.98
0.56 - 0.65
95% Confidence Interval
53
B)
A)
5.00
140
130
JPN (Median, n=100)
4.00
110
Pit 2 (Mean, n=5)
90
Rec/Pit2
ratio
80
70
JPN uppeer (+ 2SD, n=100)
3.50
Rec2 (Mean, n=5)
100
Conc.
ng/mL
rhGH treated (n=5)
4.50
120
3.00
rhGH Injection
2.50
rhGH Injection
60
2.00
50
1.50
40
30
1.00
20
0.50
10
0.00
0
-24
-22
-20
-16
0
2
4
6
12
27
-24
48
-22
-20
-16
0
4
6
12
27
48
34
48
D)
C)
5.00
140
130
Rec2 (Mean, n=10)
120
Pit 2 (Mean, n=10)
110
4.00
100
3.50
80
Rec/Pit2
ratio
GHRP-2
Injection
70
GHRP-2 treated (n=10)
4.50
90
Conc.
ng/mL
2
Time (h)
Time (h)
60
JPN (Median, n=100)
JPN uppeer (+ 2SD, n=100)
3.00
2.50
GHRP-2 Injection
2.00
50
1.50
40
30
1.00
20
0.50
10
0.00
0
-24
-20
-14
0
1
5
10
24
29
34
-24
48
-20
-14
0
1
5
24
29
F)
E)
5.00
140
130
Rec2 (Mean, n=10)
120
Pit 2 (Mean, n=10)
4.50
rhGH/GHRP-2 treated (n=10)
GHRP-2 Injection
JPN (Median, n=100)
JPN uppeer (+ 2SD, n=100)
4.00
110
100
3.50
90
Conc.
ng/mL
10
Time (h)
Time (h)
80
Rec/Pit2
ratio
70
GHRP-2
Injection
60
50
2.50
rhGH Injection
2.00
rhGH
Injection
40
3.00
1.50
30
1.00
20
0.50
10
0.00
0
-24 -22 -20 -16
0
2
3
4
5
6
10
24
-24 -22 -20 -16
34
0
2
3
4
5
6
10
24
34
Time (h)
Time (h)
Figure 2-5. Change in absolute GH concentrations (left) and ratios Rec/Pit2 (right). The
whiskers indicate mean ± standard deviation. JPN means the median of Japanese male
populations (n = 100). JPN upper means Japanese male reference upper limit.
(A,B: rhGH injection; C,D: GHRP-2 injection; E,F: rhGH/GHRP-2 injections)
54
2.3.2
GHRP-2 お よ び そ の 代 謝 物 の UPLC–MS/MS に よ る 分 析 法 の 開 発
ドーピング検査においては、使用する標準試料は可能な限り分析施設内で事前に成
分確認が求められている。また、本章で使用したペプチド標準試料は依頼合成品であ
る 。 そ こ で 、 GHRP-2、 代 謝 物 AA-3 お よ び 安 定 同 位 体 標 識 GHRP-2（ I.S.） の 標 準 試
料 に つ い て 、質 量 ス ペ ク ト ル お よ び 元 素 組 成 を 確 認 す る た め 、ESI（ positive mode）に
よ る 高 分 解 能 TOF–MS 分 析 を 行 っ た 。 LC–MS に お け る 質 量 分 析 で の イ オ ン 化 法 は 、
ESI の 他 に 大 気 圧 化 学 イ オ ン 化 （ atmospheric pressure chemical ionization: APCI）、 マ ト
リ ッ ク ス 支 援 レ ー ザ ー 脱 離 イ オ ン 化（ matrix-assisted laser desorption ionization: MALDI）
お よ び 大 気 圧 光 イ オ ン 化 （ atmospheric pressure photoionization: APPI） な ど が 用 い ら れ
て い る 。本 章 で は 、最 も 汎 用 的 で ペ プ チ ド・タ ン パ ク 質 測 定 に 適 し た ESI 法 を 用 い た 。
GHRP-2、AA-3 お よ び 安 定 同 位 体 標 識 GHRP-2（ I.S.）の TOF–MS 分 析 の 結 果 を 、Table
2-5 に 示 し た 。 GHRP-2 は 、 1 価 の プ ロ ト ン 付 加 イ オ ン m/z 818.4348（ [M+H] + ） と 2 価
の プ ロ ト ン 付 加 イ オ ン m/z 409.7208（ [M+2H] 2 + ）が 観 測 さ れ 、イ オ ン 組 成 は C 45 H 5 6 N 9 O 6
で あ っ た 。AA-3 は 、1 価 の プ ロ ト ン 付 加 イ オ ン 358.1763（ [M+H] + ）が 観 測 さ れ 、イ オ
ン 組 成 は C 19 H 24 N 3 O 4 で あ っ た 。安 定 同 位 体 標 識 GHRP-2 は 、GHRP-2 同 様 に 1 価 の プ
ロ ト ン 付 加 イ オ ン m/z 828.4610（ [M+H] + ） と 2 価 の プ ロ ト ン 付 加 イ オ ン m/z 414.7360
[M+2H] 2+ が 観 測 さ れ 、 イ オ ン 組 成 は C 36 H 5 6 N 8 O 6 13 C 9 1 5 N で あ っ た 。 価 数 に つ い て は 1
価 イ オ ン の 同 位 体 ピ ー ク と の 質 量 差 が 1 mass で あ る の に 対 し て 、 2 価 イ オ ン の そ れ は
0.5 mass で あ る こ と か ら 明 瞭 に 判 別 可 能 で あ っ た 。 理 論 m/z と 実 測 m/z の 誤 差 は 次 式
（ 6）で 算 出 し た 。そ の 結 果 、使 用 し た 合 成 標 準 品 の 元 素 組 成 の 質 量 誤 差 は 、5 ppm 以
内で理論値と一致した。
質 量 誤 差 （ mass error） ＝ （ 実 測 m/z – 理 論 m/z） / 理 論 m/z × 10 6
（ 6）
Table 2-5. Accurate masses and elemental compositions of target peptides
Peptide
GHRP-2
Formula
Observed ion
Theoretical ion
Mass error
[M+H]+
(m/z )
(m/z )
(ppm)
[M+H]+
818.4348
818.4348
0.00
[M+2H]2+
409.7208
409.7210
-0.49
C45H56N9O6
AA-3
C19H24N3O4
[M+H]+
358.1763
358.1761
0.56
stable isotope-labeled
GHRP-2
(I.S.)
C36H56N8O613C915N [M+H]+
828.4610
828.4620
-1.21
414.7360
414.7347
3.13
[M+2H]2+
55
次 に 、 高 感 度 ト リ プ ル 四 重 極 質 量 分 析 計 を 用 い て 、 ESI 法 に よ る G
GHRP-2 お よ び そ
の 代 謝 物 AA-3 の 分 析 条 件 の 検 討 を 行 っ た 。 ま ず 、 GHRP-2、 AA-3 お よ び 安 定 同 位 体
標 識 GH
HRP-2（ I.S
S.）の フ ル ス キ ャ ン 質 量 ス ペ ク ト ル 上 の ベ ー ス イ オ ン ピ ー ク を プ リ カ
ー サ ー イ オ ン と し 、CID に よ る MS/MS
S 測 定 を 行 っ た 。Figurre 2-6 に 示 す よ う に 、GHRP-2
の プ リ カ ー サ ー イ オ ン m/z 410（
4
[M+2 H] 2+ ） 由 来 の プ ロ ダ ク ト イ オ ン は 、 m/z 7 47、 m/z
550、 m
m/z 479、 m//z 269、 m/z 241 お よ び m/z 129 が 観 測 さ れ 、 そ れ ぞ れ ア ミ ノ 酸 配 列 タ
グ y 5 、 y 4 、 y 3 、 b 2 、 a 2 お よ び y 1 − NH 3 と 帰 属 し た 。 さ ら に 、 ペ プ チ ド 化 合 物 の 構 造 的
特 徴 を 示 す β-naphhthyl-alanin
ne（ β-Nal）
） の イ ン モ ニ ウ ム イ オ ン m/z 1700 が 観 測 さ れ た 。
Figure 22-6. ESI maass spectrum
m in scan m
mode (upperr) and produ
uct ion masss spectrum
m (lower)
of the [M
M+2H] 2 + ioon of GHRP
P-2 at m/z 4 10.
56
GHRP
P-2 の 代 謝 物 AA-3 の プ リ カ ー サ ー イ オ ン m/z 358（
（ [M+H] + ） か ら は 、 m/z
m 287
（ y 2 ）、 m/z 269（ b 2 ）、 m/z 24
41（ a 2 ）、 m
m/z 170（ β--Nal の イ ン モ ニ ウ ム イ オ ン ） お よ び 会
合 イ オ ン m/z 715 （ [2M+H] + ） が 観 測 さ れ た （ Fig
gure 2-7）。
m in scan m
mode (upperr) and produ
uct ion mas s spectrum (lower)
Figure 22-7. ESI maass spectrum
of the pprotonated molecule
m
off AA-3 at m /z 358.
57
安 定 同 位 体 標 識 GHRP-2（ I.S.）の プ リ カ ー サ ー イ オ ン m//z 415 （ [M
M+2H] 2 + ）か
からは、
主 に m//z 757 （ y 5 ）、m/z 560
0（ y 4 ）、m/z
/z 489（ y 3 ）、m/z 269（ b 2 ）、m/z 241（ a 2 ）、m/z
、
129
（ y1 − N
NH 3 ） お よ び 170（ β--Nal の イ ン モ ニ ウ ム イ オ ン ） の プ ロ ダ ク ト イ オ ン が 観 測 さ
れた（F
Figure 2-8）
）。
m generatedd in scan m ode (upper)) and produuct ion masss
Figure 22-8. ESI maass spectrum
spectrum
m (lower) of
o the [M+2
2H] 2+ ion off stable isottope-labeled
d GHRP-2 aat m/z 415.
58
次 に 、カ ラ ム 分 離 を 検 討 し た 。UPLC は 、カ ラ ム 樹 脂 の 粒 径 が 1.7μ m と 小 さ く 、耐
圧 15000 psi の シ ス テ ム で あ る た め 、従 来 の HPLC よ り も 少 量 の 流 量 ､少 量 の 移 動 相 で ､
理論段数が高い分離効率の良い分析が可能である。本章では、高速かつ高分離が可能
な UPLC を 用 い 、汎 用 型 の Acquity BEH C 18 逆 相 カ ラ ム を 使 用 し た 。Figure 2-9 に MRM
ク ロ マ ト グ ラ ム を 示 し た 。 GHRP-2、 AA-3 お よ び 安 定 同 位 体 標 識 GHRP-2（ I.S.） の t R
は 、 そ れ ぞ れ 6.1 分 、 4.2 分 お よ び 6.0 分 で あ り 、 ピ ー ク 形 状 も 良 好 で 、 分 析 時 間 も 1
試 料 あ た り 10 分 と ハ イ ス ル ー プ ッ ト な 測 定 が 可 能 で あ っ た 。 ま た 、 Figure 2-2 に 示 す
よ う に GHRP-2 の 構 造 は 、 AK-6 の C 末 端 が ア ミ ド に 置 換 さ れ た も の で あ り 、 両 者 の
MW の 差 は 、約 1 mass unit で あ る 。 す な わ ち 、 両 ペ プ チ ド の 2 価 の プ ロ ト ン 付 加 イ オ
ン の m/z の 差 は 、 約 0.5 と な り 四 重 極 型 質 量 分 析 の 質 量 分 解 能 で は 質 量 分 離 は 困 難 で
あ っ た 。 し か し な が ら 、 Figure 2-9 に 示 す よ う に GHRP-2（ Peak C） と AK-6（ Peak B）
は、良好にカラム分離が可能であった。
(A)
m/z 691>170
(AF-6)
(B)
m/z 410.5>170
(AK-6)
(C)
m/z 410>170
(GHRP-2)
(D)
m/z 415>170
(IS)
(E)
m/z 358>170
(AA-3)
Figure 2-9. Selected ion chromatograms of (A) AF-6, (B) AK-6, (C) GHRP-2, (D) I.S.: stable
isotope-labeled GHRP-2 and (E) AA-3.
59
次 に 、 メ ソ ッ ド バ リ デ ー シ ョ ン を 行 い 、 そ の 結 果 を Table 2-6 に 示 し た 。 20 種 類 の
異 な る ブ ラ ン ク 尿 試 料 に お い て 、分 析 対 象 ペ プ チ ド の t R に 夾 雑 す る ピ ー ク は 観 測 さ れ
な か っ た（ Figure 2-10B）。検 量 線 の 範 囲 0.5 – 10 ng/mL に お い て 、GHRP-2 お よ び そ の
代 謝 物 AA-3 の 直 線 一 次 回 帰 式 は 、そ れ ぞ れ y = 0.1017x + 0.0238（ R = 0.9992）お よ び
y = 0.3163x + 0.0338（ R = 0.9986） と 良 好 な 直 線 性 を 示 し た 。 GHRP-2 お よ び そ の 代 謝
物 AA-3 の 平 均 回 収 率 は 、そ れ ぞ れ 84%お よ び 101%で あ っ た 。尿 試 料 が 腐 敗 し た 場 合 、
尿試料が極端なアルカリ性を示す場合がある。そのため、固相抽出におけるマトリッ
ク ス の pH に よ る 抽 出 率 の 影 響 を 確 認 す る こ と は 重 要 で あ る 。 本 研 究 で は 、 GHRP-2
お よ び 安 定 同 位 体 標 識 GHRP-2（ I.S.） は 、 pH が 3 以 上 で は 固 相 抽 出 に お け る 回 収 率
が 10%以 下 と な る こ と が 確 認 さ れ た 。 従 っ て 、 ア ル カ リ 性 を 示 す 尿 試 料 な ど の 場 合 、
pH <3.0 で あ る こ と を 確 認 し て か ら 固 相 抽 出 カ ラ ム に 供 す る 必 要 が あ る 。 ま た 、 固 相
抽出カラムのコンディショニングおよび尿試料を供した後の洗浄には、蒸留水ではな
く 0.1% TFA を 使 用 す る こ と が 必 要 で あ っ た 。GHRP-2 お よ び そ の 代 謝 物 AA-3 の LOD
（ S/N ≥ 3）は 、そ れ ぞ れ 0.05 ng/mL（ m/z 410>170）お よ び 0.02 ng/mL（ m/z 358>170）
で あ っ た 。 GHRP-2 お よ び そ の 代 謝 物 AA-3 の 日 内 の 精 度 は 、 そ れ ぞ れ 1.6 – 3.1%お よ
び 2.1 – 3.8%で あ っ た 。 正 確 度 は 、 そ れ ぞ れ 0.85 – 1.67%お よ び −2.16 – −2.79%と 良 好
な 再 現 性 を 示 し た 。 GHRP-2 お よ び そ の 代 謝 物 AA-3 の 日 間 の 精 度 は 、 そ れ ぞ れ 1.9 –
4.3%お よ び 3.2 – 3.9%で あ っ た 。正 確 度 は 、そ れ ぞ れ 0.02 – 1.32%お よ び −1.79 – −2.80%
と 良 好 な 再 現 性 を 示 し た 。以 上 か ら 、本 法 の 検 量 線 範 囲 下 限 0.5 ng/mL を LOQ に 設 定
し た 。 本 章 で 採 用 し た ESI 法 は 、 イ オ ン 化 し 易 い 分 子 が 優 先 的 に イ オ ン 化 さ れ る と い
う特徴がある。そのため、尿試料由来の共存マトリックス成分中に、分析対象物質よ
り も プ ロ ト ン 親 和 力 が 大 き い 成 分 が 同 一 の t R で 溶 出 し た 場 合 や 、高 電 界 に よ り 生 成 し
た帯電液滴からイオン蒸発する際に、分析対象物質のイオン蒸発を妨害するようなマ
トリックス成分が液滴内に共存するとイオンサプレッションが起こることはよく知ら
れている
65 )
。そ の 結 果 、感 度 の 低 下 や 定 量 性 の 低 下 と い っ た 問 題 が 生 じ る こ と が あ る 。
そ こ で 、 LC–MS に よ る 定 量 分 析 で は 、 イ オ ン サ プ レ ッ シ ョ ン に よ る 影 響 が あ る た め 、
可 能 な 限 り 分 析 対 象 物 質 の 安 定 同 位 体 標 識 体 を I.S.に 使 用 す る こ と が 望 ま れ る 。 本 法
で は 、 安 定 同 位 体 標 識 GHRP-2 を I.S.と す る こ と で 予 期 し な い イ オ ン サ プ レ ッ シ ョ ン
が あ っ た 場 合 、GHRP-2 の 定 量 精 度 へ の 影 響 を 回 避 で き る 。し か し 、AA-3 に つ い て は 、
安 定 同 位 体 標 識 AA-3 を 使 用 し な か っ た た め 、 イ オ ン サ プ レ ッ シ ョ ン に よ る 影 響 の 確
認 を 行 っ た 。そ の 結 果 、10 種 類 の 異 な る ブ ラ ン ク 尿 試 料 に お い て 、分 析 対 象 ペ プ チ ド
の t R 近 傍 に お け る ベ ー ス ラ イ ン の 低 下 や 変 動 、す な わ ち イ オ ン サ プ レ ッ シ ョ ン は 認 め
ら れ な か っ た 。ま た 、前 処 理 操 作 、UPLC–MS/MS 測 定 時 の オ ー ト サ ン プ ラ ー や カ ラ ム
吸着などによる測定試料間の汚染の有無を確認した。3 種類のブランク尿試料を高濃
度 添 加 尿 試 料 の 測 定 に 引 き 続 き 測 定 し た が 、分 析 対 象 ペ プ チ ド の t R に お い て 、夾 雑 す
る ピ ー ク は 検 出 さ れ な か っ た 。以 上 の よ う に 、UPLC–MS/MS に よ る GHRP-2 お よ び そ
の 代 謝 物 AA-3 の 定 量 精 度 は 良 好 な 結 果 で あ っ た 。
60
Table 2-6. Summary of assay validation for quantification analysis by means of UPLC–MS/MS in MRM mode
Peptide
Limit of
detection
(ng/mL)
Correlation
coefficiency (R)
n=6
range
0.5 - 10 ng/mL
GHRP-2
61
AA-3
0.05
0.02
0.9992
0.9986
Recovery (%)
Intra-day assay
n=10
n=10
(10 ng/mL)
84
101
Inter-day assay
3 days, n=30
Conc.
Precision
(CV%)
Accuracy
(%)
Conc.
Precision
(CV%)
Accuracy
(%)
Low
1 ng/mL
3.1
1.36
Low
1 ng/mL
4.3
1.32
Middle
4 ng/mL
2.3
0.85
Middle
4 ng/mL
2.2
0.02
High
9 ng/mL
1.6
1.67
High
9 ng/mL
1.9
0.77
Low
1 ng/mL
2.1
-2.38
Low
1 ng/mL
3.2
-2.29
Middle
4 ng/mL
3.0
-2.16
Middle
4 ng/mL
3.8
-2.80
High
9 ng/mL
3.8
-2.79
High
9 ng/mL
3.9
-1.79
(C)
(B)
(A)
m/z 415>170
IS(isotope-labeled GHRP-2)
m/z 415>170
IS(isotope-labeled GHRP-2)
m/z 410>269
(GHRP-2)
m/z 410>269
(GHRP-2)
m/z 410>269
(GHRP-2)
m/z 410>241
(GHRP-2)
m/z 410>241
(GHRP-2)
m/z 410>241
(GHRP-2)
m/z 410>170
(GHRP-2)
m/z 410>170
(GHRP-2)
m/z 410>170
(GHRP-2)
m/z 415>170
IS(isotope-labeled GHRP-2)
62
m/z 358>269
(AA-3)
m/z 358>269
(AA-3)
m/z 358>269
(AA-3)
m/z 358>241
(AA-3)
m/z 358>241
(AA-3)
m/z 358>241
(AA-3)
m/z 358>170
(AA-3)
m/z 358>170
(AA-3)
m/z 358>170
(AA-3)
Figure 2-10. Selected ion chromatograms of (A) spiked urine with 10 ng/mL of GHRP-2 and AA-3, (B) a blank urine and (C) urine
sample collected after the administration of GHRP-2 (4.5 h, volunteer-2).
2.3.3
尿 中 GHRP-2 と そ の 代 謝 物 の 同 定
GHRP-2 の 静 脈 内 投 与 後 、 血 中 消 失 半 減 期 は 25.2 – 41.4 分 と 非 常 に 早 い
64 )
。この
こ と か ら 、 ド ー ピ ン グ 検 査 に お い て 血 液 試 料 を 用 い て GHRP-2 を 検 出 す る こ と は 効
果 的 で は な い 。GHRP-2 は AK-6、AF-6 お よ び AA-3 に 代 謝 さ れ る こ と が 報 告 さ れ て
いる
64 ,66 )
。 尿 試 料 を 対 象 と し て 、 GHRP-2 お よ び そ の 代 謝 物 を 検 索 し 、 ド ー ピ ン グ
検 査 に 適 用 可 能 で あ る か を 検 討 し た 。GHRP-2 投 与 後 の 尿 試 料 か ら は 、被 験 者 10 名
と も AK-6 お よ び AF-6 は 検 出 さ れ な か っ た 。 一 方 、 Figure 2-10C に 示 す よ う に 、
GHRP-2 お よ び AA-3 が 尿 中 に 検 出 さ れ た 。こ れ は 、GHRP-2 が amidase に よ り AK-6、
さ ら に carboxyexopeptidase に よ り AF-6、次 い で 、dipeptidyl carboxypeptidase ま た は
endopeptidase に よ り AA-3 に 代 謝 さ れ て 尿 中 に 排 泄 さ れ た と 推 測 し た（ Figure 2-11）。
GHRP-2 : D-Ala-D-(β-Naphthyl)-Ala-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2
Amidase
AK-6 : D-Ala-D-(β-Naphthyl)-Ala-Ala-Trp-D-Phe-Lys-OH
Carboxyexopeptidase
+ Endopeptidase
Carboxyexopeptidase
AF-6 : D-Ala-D-(β-Naphthyl)-Ala-Ala-Trp-D-Phe-OH
Dipeptidyl carboxypeptidase
or Endopeptidase
AA-3 :D-Ala-D-(β-Naphthyl)-Ala-Ala-OH
Figure 2-11. Proposed metabolism of GHRP-2 6 7 - 70 ) .
ド ー ピ ン グ 検 査 に お け る 質 量 分 析 に よ る 定 性 試 験 で は 、標 準 物 質 と の t R お よ び イ
オ ン 強 度 の 比 較 に よ り 物 質 の 同 定 を 行 う 。 そ の 同 定 基 準 は 、 WADA 技 術 文 書
（ TD2010IDCR） に 規 定 さ れ て い る
71)
。 今 回 測 定 し た GHRP-2 投 与 後 の 尿 試 料 中 の
GHRP-2 未 変 化 体 お よ び そ の 代 謝 物 AA-3 は 、そ の t R な ら び に MS/MS 測 定 に お け る
5 つの診断イオンにおいて合成標準試料と一致した。以上のことから、本法がドー
ピング検査に適用できると判断した。
63
2.3.4
UPLC–MS/MS に よ る 尿 中 GHRP-2 と そ の 代 謝 物 AA-3 の 定 量
日 本 人 男 性 健 常 者 10 名 に GHRP-2 を 投 与 し た 場 合 の GHRP-2 お よ び AA-3 の 尿 中
排 泄 率 推 移 を 、Figure 2-12A お よ び Figure 2-12B に そ れ ぞ れ 示 し た 。GHRP-2 未 変 化
体 は 、投 与 後 1.5 時 間 で 急 激 に 排 泄 さ れ た の に 対 し て 、代 謝 物 AA-3 は 投 与 後 7.5 時
間 を ピ ー ク に 24 時 間 ま で の 排 泄 推 移 を 示 し た 。GHRP-2 未 変 化 体 は、投 与 量 の 2%が
尿 中 に排 泄 され、そのほとんどは糞 便 中 に排 泄 されると報 告 されている
6 4)
。Table 2-7 に示 す
ように、本 研 究 で は 、GHRP-2 の 静 脈 内 投 与 後 、GHRP-2 未 変 化 体 は 投 与 量 の 0.2 – 5.9%
（ n = 10、 平 均 2.5%）、 代 謝 物 AA-3 は 2.2 – 5.7%（ n = 10、 平 均 3.4%） が 尿 中 に 排
泄 さ れ た 。GHRP-2 の 尿 中 排 泄 率 に は 個 人 差 が あ り 、volunteer-1 は 投 与 後 1.5 時 間 で
7.9 ng/mL を 示 し た 以 降 は 、LOD 以 下 と な っ た 。volunteer-6 に つ い て は 、投 与 後 1.5
時 間 で 154.9 ng/mL と 高 値 を 示 し 、 12 時 間 ま で 検 出 が 可 能 で あ っ た 。 一 方 、 代 謝 物
AA-3 は 、10 名 の 被 験 者 す べ て に お い て 投 与 後 24 時 間 ま で 検 出 可 能 で あ っ た 。AA-3
の 尿 中 濃 度 は 、volunteer-1 に お け る 投 与 後 7 時 間 で の 12.0 ng/mL が 最 高 濃 度 で あ り 、
GHRP-2 と 比 較 し て 尿 中 の 最 高 濃 度 は 10 分 の 1 と 低 値 で あ っ た 。し か し な が ら 、ド
ーピング検査においては、長期間検出可能な物質を測定対象とすることが適切であ
る 。GHRP-2 ド ー ピ ン グ の 検 査 に お い て は 、代 謝 物 AA-3 を 検 出 対 象 と す る こ と が 効
果的であると云える。
(A)
Excretion rate (ng/h)
3,000
GHRP-2
(Mean of n=10)
2,000
1,000
0
0.0
1.5
4.5
7.5
10.0
13.0
24.0
Time (h)
(B)
Excretion rate (ng/h)
600
AA-3
(Mean of n=10)
400
200
0
0.0
1.5
4.5
7.5
10.0
13.0
24.0
Time (h)
Figure 2-12. Excretion rates of GHRP-2 (A) and AA-3 (B) after intravenous injection of
GHRP-2. Bars are expressed as maximum and minimum values (n = 10).
64
Table 2-7. Urinary excretion of GHRP-2 and AA-3 after the administration of of GHRP-2
Peptide
Volunteer
1
GHRP-2
6
Mean
(n=10)
(min-max)
Amount
excreted
(%)
0.4
5.9
2.5
(0.2 - 5.9)
65
1
AA-3
6
Mean
(n=10)
(min-max)
4.0
2.3
3.0
(1.8 - 4.4)
Collection time (h)
Pre
0 - 1.5
1.5 - 4.5
4.5 - 7
7 - 10
10 - 13
13 - 24
Conc.
(ng/mL)
0
7.9
<0.05
<0.05
<0.05
<0.05
<0.05
excretion rate
(ng/h)
-
240.2
-
-
-
-
-
Conc.
(ng/mL)
0
154.9
16.3
2.8
0.7
0.7
<0.05
excretion rate
(ng/h)
-
3,190
205.1
76.1
21.5
76.7
-
Conc.
(ng/mL)
0
(0 - 0)
41.0
(4.3 - 154.9)
5.3
(0 - 16.7)
1.4
(0 - 8.2)
0.6
(0 -2.2)
0.1
(0 - 0.7)
0.06
(0 - 0.6)
excretion rate
(ng/h)
0
(0 - 0)
1194.1
(139.7 3284.2)
159.5
(0 - 539.6)
40.7
(0 - 239.8)
32.4
(0 - 136.0)
10.2
(0- 76.7)
2.2
(0 - 18.9)
Conc.
(ng/mL)
0
0.4
9.1
12.0
2.4
1.2
0.2
excretion rate
(ng/h)
-
10.7
419.5
609.6
229.4
107.3
15.1
Conc.
(ng/mL)
0
1.3
7.9
7.1
9.3
0.5
0.6
excretion rate
(ng/h)
-
27.4
99.3
191.1
290.9
56.1
35.9
Conc.
(ng/mL)
0
(0 - 0)
1.5
(0.3 - 7.9)
6.1
(0 - 9.6)
6.6
(2.8 - 12.0)
4.8
(0.6 - 9.3)
1.7
(0.3 - 4.5)
0.7
(0.09 - 1.5)
excretion rate
(ng/h)
0
(0 - 0)
306.1
(46.5 609.6)
269.8
(118.3 548.9)
93.0
(24.4 196.6)
29.3
(3.6 - 67.9)
51.0
237.4
(6.9 - 294.0) (3.5 - 528.6)
次 に 、日 本 人 健 常 者 10 名 へ の rhGH と GHRP-2 の 併 用 投 与 試 験 を 行 っ た 。投 与 前
後 に 採 取 し た 尿 中 GHRP-2 お よ び 代 謝 物 AA-3 の 定 量 を 行 っ た 。尿 中 の 平 均 GHRP-2
濃 度 は 、2 時 間 後 で 68.0 ng/mL、4 時 間 後 で 8.0 ng/mL、8 時 間 後 で 1.9 ng/mL、11 時
間 後 で 0.8 ng/mL と な り 、以 降 LOD 以 下 と な り 消 失 し た 。AA-3 に 関 し て は 、2 時 間
後 で 2.0 ng/mL、4 時 間 後 で 5.6 ng/mL、8 時 間 後 で 4.6 ng/mL、11 時 間 後 で 3.5 ng/mL、
22 時 間 後 で 0.7 ng/mL と な り 、以 降 LOD 以 下 と な っ た 。こ の よ う に 、前 述 の GHRP-2
単 独 投 与 に お け る 結 果 と 同 様 の 尿 中 排 泄 推 移 を 示 し た 。 Figure 2-13 の 上 段 に は 、 1
例 の 被 験 者 （ subject-25） に お け る 「 GH isoform differential immunoassay」 に よ り 測
定 し た 血 清 Rec/Pit1 の 推 移 を 示 し た 。 rhGH 投 与 後 、 上 昇 し た Rec/Pit1 が 引 き 続 き
投 与 し た GHRP-2 の 影 響 で 、2.5 時 間 か ら 4.5 時 間 に お い て 減 少 し て い る 。す な わ ち 、
2.3.1 項 で も 述 べ た よ う に 、 rhGH の 使 用 が GHRP-2 投 与 に よ り 隠 ぺ い さ れ て い る 。
Figure 2-13 の 下 段 に は 、UPLC–MS/MS 法 に よ り 定 量 し た GHRP-2 お よ び 代 謝 物 AA-3
の 尿 中 濃 度 推 移 を 示 し た 。こ の よ う に 、Rec/Pit が 隠 ぺ い さ れ て い る 時 間 帯 に 採 取 し
た 尿 試 料 中 か ら は 、GHRP-2 も し く は AA-3 が 検 出 可 能 で あ っ た 。他 の 9 名 の 被 験 者
においても同様の結果を示した。
以 上 の こ と か ら 、競 技 者 が 、rhGH ド ー ピ ン グ 検 査 の 隠 ぺ い 目 的 で GHRP-2 を 使 用
し た 場 合 で も 、尿 中 GHRP-2 お よ び AA-3 を 直 接 検 出 す る こ と で 対 処 が 可 能 で あ る 。
50
5.00
4.50
45
4.00
Rec/Pit1
rhGH Injection
3.50
40
Masking effect
3.00
35
2.50
2.00
30
Rec/Pit1 1.50
ratio
1.00
25
0.50
20
0.00
Conc.
(ng/mL)
15
-0.50
GHRP-2 Injection
GHRP-2
-1.00
10
-1.50
5
-2.00
AA-3
-2.50
0
-24
-22
-20
-16
0
2
3
4
5
6
10
24
34
Rec/Pit1 ratio (Subject-25)
Time (h)
JPN (Median, n=100)
JPN upper (+2SD, n=100)
GHRP-2
AA-3
Figure 2-13. Change in Rec/Pit1 and absolute concentrations of urinary GHRP-2 and
metabolite AA-3 after combined administration of rhGH and GHRP-2.
66
2.4
小括
本 研 究 の 結 果 、「 GH isoform differential immunoassay」 は 、 特 異 的 に rhGH ド ー ピ
ン グ の 検 出 を 可 能 と す る と 結 論 付 け た 。し か し 、GHS の 一 つ で あ る GHRP-2 の 投 与
は 、内 因 性 GH の 分 泌 作 用 を 示 し た が 、Rec/Pit に 有 意 な 上 昇 を 与 え ず 、
「 GH isoform
differential immunoassay」 で は GHRP-2 の 使 用 を 検 出 で き な か っ た 。 ま た 、 rhGH の
検出を隠ぺいする効果があることも明らかとした。このように、成長促進因子
GHRP-2 は 、GH 分 泌 作 用 を 期 待 し て 単 独 で 競 技 者 に ド ー ピ ン グ 目 的 で 使 用 さ れ る だ
け で は な く 、 rhGH と 併 用 す る こ と で 、 rhGH ド ー ピ ン グ の 検 査 を 隠 ぺ い す る 目 的 で
使 用 さ れ る 可 能 性 が あ る 。本 研 究 で は 、GHRP-2 服 用 者 の 尿 中 か ら 、GHRP-2 お よ び
代 謝 物 AA-3 を UPLC–MS/MS 法 に よ り 高 感 度 か つ 迅 速 に 検 出 可 能 な 分 析 法 を 開 発 し
た 。 開 発 し た 分 析 法 を ド ー ピ ン グ 検 査 に 適 用 す る こ と で 、 GHRP-2 に よ る ド ー ピ ン
グ を 検 出 で き る だ け で は な く 、rhGH 検 査 法 の 弱 点 を 補 う こ と も 可 能 と な っ た 。一 方
で 、成 長 促 進 因 子 は イ ン タ ー ネ ッ ト 上 を 中 心 に GHRP-2 以 外 に も GHRP-6、Sermorelin、
CJC-1295 な ど 多 く の 物 質 が 流 通 し て い る
72 -75 )
。 こ れ ら の 成 長 促 進 因 子 は GHRP-2
同様の効果を有し、競技者に乱用されることは依然として危惧される状況にある。
今後、これらの成長促進因子の分析法を確立することが課題である。
67
第 ３ 章 エ リ ス ロ ポ エ チ ン 製 剤 ダ ル ベ ポ エ チ ン ア ル フ ァ の UPLC–MS/MS を
用いたドーピング検査法の開発
3.1
序論
EPO は 、 主 に 腎 臓 で 産 生 さ れ る 造 血 ホ ル モ ン で あ り 、 遺 伝 子 組 換 え EPO
（ recombinant EPO: rEPO） 製 剤 は 、 腎 性 貧 血 治 療 薬 と し て 広 く 臨 床 で 使 用 さ れ て い
る
76)
。 rEPO の よ う な 造 血 刺 激 因 子 の 使 用 は 、 赤 血 球 の 分 化 産 生 を 促 進 す る こ と に
より、酸素運搬能を向上させることが可能となり、主に持久力系競技においてのド
ーピング行為が深刻な事態となっている
77 )
。 1990 年 初 め 、 rEPO 製 剤 の 市 場 へ の 流
通 に 呼 応 し て IOC は 、 EPO を 禁 止 リ ス ト に 収 載 し 、 現 在 も ス ポ ー ツ 競 技 者 に よ る
rEPO の 使 用 は WADA に よ っ て 厳 し く 禁 止 さ れ て い る
3)
。ド ー ピ ン グ 検 査 に お い て 、
内 因 性 EPO と rEPO を 確 実 に 識 別 す る こ と が 重 要 で あ る 。 rEPO 製 剤 の 登 場 以 来 10
年 あ ま り 、EPO ド ー ピ ン グ の 直 接 的 な 検 査 法 が 無 か っ た が 、2000 年 に 、Lasne と de
Ceaurriz は 、 rEPO と 内 因 性 の 尿 EPO と で は 糖 鎖 構 造 が 異 な る こ と に 着 目 し 、 両 者
の 等 電 点 の 差 を 利 用 し た 等 電 点 電 気 泳 動 法 （ isoelectric focusing–polyacrylamide gel
electrophoresis: IEF–PAGE） を 開 発 し た
78 -8 0)
。 さ ら に 、 内 因 性 EPO と rEPO の MW
の 違 い に 基 づ い た SDS–PAGE（ sodium dodecyl sulphate–polyacrylamide gel
electrophoresis）が 開 発 さ れ た
81 -8 3)
。IEF–PAGE お よ び SDS–PAGE は 、現 在 、WADA
が 承 認 す る ド ー ピ ン グ 検 査 法 で あ る 。 IEF–PAGE お よ び SDS–PAGE は 、 熟 練 し た 手
技を必要とし、さらに分析所要日数が 3 日間必要なだけではなく、分析コストが高
い 。ま た 、SDS–PAGE は 、EPO 同 族 体 の 正 確 な MW や 構 造 情 報 ま で 得 る こ と は で き
ない。法医鑑定の分野やドーピング検査においては、分子の構造情報に基づく信頼
性 の 高 い 質 量 分 析 に よ る 同 定 が 可 能 な 限 り 求 め ら れ る 。rEPO の 質 量 分 析 に よ る 構 造
解 析 に つ い て は 、 こ れ ま で MALDI–TOF–MS 8 4 - 86 ) 、 さ ら に は capillary electrophoresis
ESI（ CE-ESI）–TOF–MS や nanoLC–TOF–MS な ど が 試 み ら れ て き た
8 7 -8 9)
。著 者 ら は 、
ESI–TOF–MS に よ り 、イ ン タ ク ト rEPO 製 剤 の 分 析 を 行 い 、質 量 ス ペ ク ト ル か ら rEPO
製剤の識別は可能であることを示唆した
90 )
。 し か し 、 ヒ ト 生 体 試 料 中 の EPO を 検
出 す る た め に は 十 分 な 感 度 が 得 ら れ な か っ た 。ま た 、ヒ ト 血 漿 試 料 中 の EPO の 質 量
分析法が報告されているが
91 )
、 内 因 性 EPO と rEPO の 識 別 は 不 可 能 で あ る 。
本 章 で は 、天 然 型 よ り も 血 中 半 減 期 の 長 い rEPO で あ る Darbepoetin alfa の UPLC–
MS/MS に よ る 高 感 度 か つ 迅 速 な ド ー ピ ン グ 検 査 法 の 開 発 を 検 討 し た 。
68
3.2
3.2.1
実験の部
試薬および材料
エ ン ド プ ロ テ イ ナ ー ゼ Glu-C（ V8-プ ロ テ ア ー ゼ , sequencing grade, Staphylococcus
aureus V8, EC 3.4.21.19） は 、 Roche Diagnostics GmbH よ り 購 入 し た 。 凍 結 乾 燥 品 で
あ る V8-プ ロ テ ア ー ゼ は 、 蒸 留 水 に よ り 再 溶 解 し て Working solution（ 500 μg/mL）
と し た 。 EPO 精 製 用 イ ム ノ ア フ ィ ニ テ ィ ー キ ッ ト （ no. 0250） お よ び 尿 試 料 の リ ザ
ー バ ー 容 器（ funnel pack, no. 1340）は 、MAIIA AB（ Uppsala, Sweden）か ら 購 入 し た 。
EPO 精 製 用 イ ム ノ ア フ ィ ニ テ ィ ー キ ッ ト は 、 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 EPO 抗 体 （ 3F6） 固
定 化 モ ノ リ ス カ ラ ム 、urine precipitate dissolution（ UPD）buffer、exposure aid、washing
buffer、 adjustment-buffer component A お よ び desorption-buffer component A か ら 構 成
さ れ て い る 。 マ ウ ス モ ノ ク ロ ー ナ ル IgG 抗 体 （ 抗 ヒ ト EPO, ク ロ ー ン AE7A5） は 、
R&D Systems（ Minneapolis, MN, USA） か ら 購 入 し て 一 次 抗 体 と し て 使 用 し た 。
Polymer–horseradish peroxidase（ HRP, 西 洋 ワ サ ビ ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ ） 標 識 ヤ ギ 抗 マ
ウ ス （ EnVision™ K4001） を Dako（ Glostrup、 Denmark） か ら 購 入 し 、 二 次 抗 体 に 使
用 し た 。N,N,N′,N′-テ ト ラ メ チ レ ン ジ ア ミ ン（ TEMED）お よ び ス キ ム ミ ル ク 粉 末（ 生
化 学 用 ） は 、 和 光 純 薬 か ら 購 入 し た 。 IEF–PAGE 用 の 化 学 発 光 試 薬 キ ッ ト （ ECL
Advance™ Western Blotting Detection Kit ref RPN2135） は 、 GE ヘ ル ス ケ ア （ Tokyo,
Japan） か ら 購 入 し た 。 ウ シ 血 清 ア ル ブ ミ ン （ Bovine serum albumin: BSA, RIA 用 , ref
A-7888）、ペ プ ス タ チ ン A
（ microbial source）、TRIZMA Base
（ Tris base, ref T6066, 99.9%
プ ロ テ ア ー ゼ 非 検 出 ） お よ び 炭 酸 水 素 ア ン モ ニ ウ ム （ NH 4 HCO 3 ） は 、 Sigma か ら 購
入 し た 。 尿 素 お よ び 過 硫 酸 ア ン モ ニ ウ ム （ Ammonium persulfate, 電 気 泳 動 用 ） は 、
バ イ オ ラ ッ ド （ Tokyo, Japan） か ら 購 入 し た 。 プ ロ テ ア ー ゼ 阻 害 剤 カ ク テ ル
（ Complete™） は 、 Roche Diagnostics（ Indianapolis, IN, USA） か ら 購 入 し た 。 界 面
活 性 剤 Tween 80（ Surfact-Amps ® ） は 、 Pierce Chemical Co.（ Rockford, IL, USA） か
ら 購 入 し た 。両 性 担 体 電 解 質（ Servalyte 2–4, 4–6, 6–8）は 、Serva（ Heidelberg, Germany）
か ら 購 入 し た 。 ア ク リ ル ア ミ ド お よ び N,N ′ -メ チ レ ン ジ ア ク リ ル ア ミ ド は 、 Merck
よ り 購 入 し た 。蒸 留 水 は 、Milli-Q ultra pure system（ Millipore）で 製 造 し た も の を 使
用 し た 。Microfiltration Steriflip filters（ 0.22 μm）、Amicon Ultra-4（ カ ッ ト オ フ 30-kDa）、
Amicon Ultra-15
（ カ ッ ト オ フ 30-kDa）、Centricon YM30
（ カ ッ ト オ フ 30-kDa）、Durapore
膜 （ 0.65 μm）、 Centricon YM-10（ カ ッ ト オ フ 10-kDa） Amicon Ultracel-30K（ cut off
30-kDa）、 HPF Millex HV filters（ 0.45 μm, no. SLHVM25NS） お よ び Immobilon-P 膜
（ PVDF membrane） は 、 Millipore か ら 購 入 し た 。 Epoetin alfa 注 射 用 製 剤 （ ESPO ®
Injection Syringe, 3000 IU/2 mL）お よ び Darbepoetin alfa 注 射 用 製 剤（ NESP ® Injection
Syringe, 15 μg/mL） は 、 協 和 発 酵 キ リ ン （ Tokyo, Japan） か ら 購 入 し た 。 Epoetin alfa
と Epoetin beta の 等 量 混 合 物 は 、European Pharmacopoeia Commission for the Biological
Reference Preparation（ BRP, Strasbourg, France）か ら 購 入 し た 。ヒ ト 尿 中 EPO の 標 準
69
品 は 、 NIBSC か ら 購 入 し た 。 I.S.と し て 使 用 し た 合 成 ペ プ チ ド で あ る ヘ キ サ レ リ ン
（ Hexarelin, His-D-(2-methyl-)Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH 2 , C 4 7 H 58 N 12 O 6 , 96.7%)は 、
Sigma か ら 購 入 し た 。合 成 ペ プ チ ド
90
TLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKE 117（ V 11 ,
97.4%）、63 VWQGLALLSE 7 2（ V 9 , 97.3%）、56 VGQQAVE 6 2（ V 8 , 95.0%）お よ び
14
RYLLE 1 8
（ V 2 , 98.2%） は 、 RS Synthesis（ Louisville, KY, USA） か ら 購 入 し た 。 ペ プ チ ド マ ッ
ピ ン グ 用 に 、 Epoetin alfa お よ び Darbepoetin alfa の 標 準 品 は 、 そ れ ぞ れ の 注 射 剤 を
Amicon Ultracel-30K filter に よ り 限 外 ろ 過 後 に 、 25 mM NH 4 HCO 3 buffer（ pH 7.8） に
再 溶 解 し た も の を 使 用 し た 。Darbepoetin alfa の Working solution は 、調 製 濃 度 が 1000、
200、50、20 お よ び 10 ng/mL に な る よ う に NESP ® 注 射 剤 を 0.1% BSA/50mM Tris-HCl
（ pH 7.4）に よ り 希 釈 し て 、調 製 し た 。合 成 ペ プ チ ド V 11 、V 8 お よ び V 2 の Stock solution
は 水 溶 液 と し た 。 合 成 ペ プ チ ド V 9 は 、 そ の 溶 解 性 か ら 30% CH 3 CN で 調 製 し た 。 ヘ
キ サ レ リ ン の Stock solution は 、 蒸 留 水 に よ り 1 mg/mL に 調 製 し 、 そ の Working
solution は 、 25 mM NH 4 HCO 3 buffer（ pH 7.8） に よ り 10 ng/mL に 調 製 し た 。 す べ て
の 標 準 溶 液 は 、 吸 着 を 防 ぐ た め Eppendorf protein low-binding tube（ Eppendorf AG,
Hamburg, Germany） に 保 管 し た 。 ま た 、 凍 結 融 解 を 避 け る た め 、 1 回 使 い 切 り の 小
分 け に し て 、 −20 °C に 保 管 し た 。
3.2.2
Immunopurification
Immunopurification は 、EPO 精 製 用 イ ム ノ ア フ ィ ニ テ ィ ー カ ラ ム に よ り 行 っ た
92 ,9 3 )
尿 試 料 10 mL に 1.5 mL UPD buffer を 加 え 、 82 – 85 °C で 9 分 間 加 熱 し 、 固 形 物 を 溶
解することによりイムノアフィニティーカラム精製における目詰まりを避ける処理
を 行 っ た 。 加 熱 終 了 後 、 た だ ち に 冷 水 中 で 10 分 間 冷 却 し 、 10 mL の 蒸 留 水 お よ び
0.2 mL の exposure aid を 加 え て 混 和 し た 。 混 合 溶 液 を HPF Millex HV 0.45 μm filter
に よ り ろ 過 し 、EPO 精 製 用 イ ム ノ ア フ ィ ニ テ ィ ー カ ラ ム に 全 量 供 し た 。イ ム ノ ア フ
ィ ニ テ ィ ー カ ラ ム の 流 速 は 、 0.8 − 1.0 mL/分 に 設 定 し て QIAvac 24Plus with a QIAvac
connecting system（ キ ア ゲ ン ） に よ り 吸 引 し た 。 引 き 続 き 、 washing buffer を 1 mL
供 し て カ ラ ム を 洗 浄 し た 後 、1000 g で 1 分 間 遠 心 分 離 し て カ ラ ム を 乾 燥 さ せ た 。あ
ら か じ め adjustment-buffer component A 5 μL を 1.5 mL-Eppendorf protein low-binding
tube に と り 、 EPO 抗 体 カ ラ ム を そ の tube に セ ッ ト し た 。 カ ラ ム に 直 接
desorption-buffer component A 50 μL を と り 、 1000 g で 1 分 間 遠 心 分 離 し て 、 EPO を
回 収 し た （ 55 μL）。
70
。
3.2.3
V8-プ ロ テ ア ー ゼ に よ る 消 化
3.2.2 項 に よ り immunopurification を 行 っ た 尿 試 料（ 55 μL）も し く は ペ プ チ ド マ ッ
ピ ン グ 用 の 標 準 試 料 に 、 50 μL の I.S.（ Hexarelin 10 ng/mL in 25 mM NH 4 HCO 3 buffer
(pH 7.8)）お よ び 5 μL の V8-プ ロ テ ア ー ゼ（ 500 μg/mL）を 加 え て 、よ く 混 和 し た（ 全
量 110 μL）。 混 合 溶 液 を Eppendorf Thermo mixer Comfort に よ り 350 rpm で ゆ る や か
に 撹 拌 し な が ら 、 25 °C で 3 時 間 イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン し た 。 消 化 後 の 試 料 を 0.5
mL-Eppendorf protein low-binding tube に と り 、 UPLC シ ス テ ム 注 入 試 料 と し た 。
3.2.4
TOF–MS に よ る ペ プ チ ド マ ッ ピ ン グ
UPLC−TOF–MS シ ス テ ム は 、 Acquity UPLC/Synapt G2 HDMS quadrupole TOF–MS
（ Waters） を 使 用 し た 。 分 析 カ ラ ム は 、 Acquity UPLC charged surface hybrid（ CSH）
C 1 8 column（ 2.1 mm × 50 mm, 粒 径 1.7 μm, Waters） を 使 用 し た 。 プ レ カ ラ ム は 、
Vanguard CSH C 1 8 （ 2.1 mm × 5 mm, 粒 径 1.7 μm, Waters） を 使 用 し た 。 移 動 相 に は 、
0.1% HCOOH（ 移 動 相 A）お よ び 100% CH 3 CN（ 移 動 相 B）を 用 い た 。カ ラ ム 温 度 は
40 °C と し 、グ ラ ジ エ ン ト 溶 出 し た 。グ ラ ジ エ ン ト 条 件 は 、5% B か ら 3.5 分 で 50% B
ま で リ ニ ア グ ラ ジ エ ン ト 溶 出 し （ 流 速 0.3 mL/分 ）、 た だ ち に 90% B と し て 6.3 分 ま
で 保 持 し た（ 流 速 0.5 mL/分 ）。さ ら に 5% B（ 流 速 0.3 mL/分 ）に 戻 し 10 分 ま で 保 持
し て 移 動 相 初 期 条 件 で 平 衡 化 し た 。注 入 量 は 10 μL と し た 。イ オ ン 化 は ESI（ positive
mode） と し た 。 イ オ ン ス プ レ ー 温 度 お よ び 脱 溶 媒 温 度 は 、 そ れ ぞ れ 120 °C お よ び
450 °C に 設 定 し た 。 キ ャ ピ ラ リ ー 電 圧 は 、 3.0 kV に 設 定 し た 。 コ ー ン ガ ス （ 80 L/
時 ） お よ び 脱 溶 媒 ガ ス （ 600 L/時 ） に は 、 窒 素 ガ ス を 使 用 し た 。 CV は 20 V に 設 定
し た 。 TOF–MS の 質 量 範 囲 は m/z 100− 2000（ ス キ ャ ン 時 間 : 0.5 秒 ） と し 、 質 量 分
解 能 は 約 40000（ high-resolution mode） と し た 。 [Glu 1 ]fibrinopeptide B（ GFP, m/z
785.8426 [M + 2H] 2 + , Sigma） に よ る ロ ッ ク マ ス 質 量 校 正 を 行 い 分 析 し た 。 ロ ッ ク ス
プ レ ー の キ ャ ピ ラ リ ー 電 圧 と 流 速 は 、 そ れ ぞ れ 3.0 kV お よ び 20 μL/分 に 設 定 し た 。
測 定 前 に 、 TOF–MS シ ス テ ム の キ ャ リ ブ レ ー シ ョ ン を NaI に よ り 行 っ た 。 ペ プ チ ド
マ ッ ピ ン グ に は 、 BiophamaLynx™ software ver. 1.2（ Waters） を 用 い た 。
3.2.5
UPLC−MS/MS
UPLC–MS/MS シ ス テ ム は 、 Acquity UPLC/ト リ プ ル 四 重 極 型 質 量 分 析 計 Xevo ™
TQ-S（ Waters）を 用 い た 。UPLC 条 件 は 、上 記 3.2.4 項 と 同 じ く 、分 析 時 間 は 10 分
と し た 。注 入 量 は 30 μL と し た 。オ ー ト サ ン プ ラ ー 用 洗 浄 溶 媒 に は 、CH 3 OH（ strong
needle solvent） お よ び 0.1% HCOOH/CH 3 CN（ 95:5, v/v）（ weak needle solvent） を 用
い た 。 イ オ ン 化 は ESI（ positive mode） と し た 。 イ オ ン ス プ レ ー 温 度 お よ び 脱 溶 媒
温 度 は 、 そ れ ぞ れ 150 °C お よ び 450 °C に 設 定 し た 。 キ ャ ピ ラ リ ー 電 圧 は 、 3.3 kV
に 設 定 し た 。 コ ー ン ガ ス （ 150 L/時 ） お よ び 脱 溶 媒 ガ ス （ 800 L/時 ） に は 、 窒 素 ガ
ス を 使 用 し た 。 CID に お け る CV は 26 V に 設 定 し 、 衝 突 ガ ス （ 0.15 mL/分 ） に は 、
71
アルゴンを使用した。プロダクトイオンスキャン測定における消化断片ペプチド
V 11 、V 9 、 V 8 、V 2 お よ び I.S（ Hexarelin）の プ リ カ ー サ ー イ オ ン お よ び CE は 、そ
れ ぞ れ m/z 604.9（ CE: 30 eV）、 m/z 558.3（ CE: 15 eV）、 m/z 365.8（ CE: 14 eV）、 m/z
347.2（ CE: 13 eV） お よ び m/z 444.4（ CE: 20 eV） に 設 定 し た 。 MRM 測 定 パ ラ メ ー
タ ー は 、 Table 3-1 に 示 し た 。 メ ソ ッ ド バ リ デ ー シ ョ ン に 用 い た 分 析 対 象 ペ プ チ ド
V 11 の mass transition は 、m/z 604.9>702.5 と し た 。測 定 前 に 、NaCsI を 用 い て MS/MS
システムの質量校正を行った。
Table 3-1. UPLC−MS/MS parameters of the target peptides
Peptide
Retention
Precursor ion
Product ion
CV
CE
time
(m/z)
(m/z)
(V)
(eV)
558.3 [M+2H]2+
148.0 (y1)
20
25
(min)
V9
V11
2.9
2.6
604.9 [M+5H]
5+
235 .2 (y2)
18
584.3 (b5)
10
187.2 (b2–CO)
20
276.3 (y2)
642.2
24
(y244+)
19
670.4 (y254+)
18
4+
19
698.1 ([y26–H2O] )
702.5 (y264+)
Hexarelin
1.8
444.4 [M+2H]2+
129.1 (y1–NH3)
20
17
35
20
(I.S.)
3.2.6
データベース検索
分 析 対 象 ペ プ チ ド V 11 の ア ミ ノ 酸 配 列 が 、 Darbepoetin alfa に 特 異 的 で あ る こ と を
保 証 す る た め に 、 タ ン パ ク 質 デ ー タ ベ ー ス BLAST ® （ protein-protein BLAST 2.2.27,
National Center for Bioinformatics, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov） に よ り 、 デ ー タ ベ ー
ス検索を行った。
3.2.7
3.2.7.1
UPLC–MS/MS 法 の メ ソ ッ ド バ リ デ ー シ ョ ン
妨害物質の確認
分 析 対 象 ペ プ チ ド V 11 の t R に お い て 、夾 雑 す る ピ ー ク の 有 無 を 確 認 し た 。30 種 類
の 異 な る ブ ラ ン ク 尿 試 料（ 血 尿 , 腐 敗 尿 , 長 期 保 管 尿 な ど を 含 む ）を 3.2.2 項 お よ び
3.2.3 項 に よ り 前 処 理 し 、 3.2.5 項 に 従 い UPLC–MS/MS に お い て 測 定 し た 。
3.2.7.2
直線性
5、 10、 20 お よ び 50 pg/mL に 調 製 し た Darbepoetin alfa 添 加 尿 試 料 を 3.2.2 項 お よ
び 3.2.3 項 に よ り 前 処 理 し 、3.2.5 項 に 従 い UPLC–MS/MS に お い て 測 定 し た 。調 製 濃
度 を x 軸 に 、 得 ら れ た 分 析 対 象 ペ プ チ ド V 11 の ピ ー ク 面 積 の I.S.に 対 す る ピ ー ク 面
72
積 比 を y 軸 に と り 最 小 二 乗 法 に よ り 直 線 一 次 回 帰 式 y = ax + b を 求 め た 。 直 線 性 の
確認は異なる 3 日間で 3 回実施した。
3.2.7.3
回収率
10 種 類 の 異 な る ブ ラ ン ク 尿 試 料 に Darbepoetin alfa を 添 加 し て 100 pg/mL に 調 製
し 、 3.2.2 項 お よ び 3.2.3 項 に よ り 前 処 理 し 、 3.2.5 項 に 従 い UPLC–MS/MS に お い て
測 定 し た 。 一 方 、 10 種 類 の 異 な る ブ ラ ン ク 尿 試 料 を 3.2.2 項 の immunopurification
後 、同 量 の Darbepoetin alfa を 添 加 し た も の を 100%回 収 さ れ た 比 較 試 料 と し て 、3.2.3
項 に 従 い V8-プ ロ テ ア ー ゼ 消 化 し 、 3.2.5 項 に 従 い UPLC–MS/MS 測 定 し た 。 UPLC–
MS/MS 測 定 に よ り 得 ら れ た 分 析 対 象 ペ プ チ ド V 11 の ピ ー ク 面 積 と I.S.の ピ ー ク 面 積
と の 比 率 を 算 出 し 、 immunopurification 前 後 の ピ ー ク 面 積 比 を 比 較 し て 、 10 種 類 の
異なる尿試料における平均回収率を算出した。
3.2.7.4
検出下限
18 種 類 の 異 な る ブ ラ ン ク 尿 試 料 お よ び そ れ ぞ れ に Darbepoetin alfa を 5 pg/mL と
な る よ う に 添 加 し た 尿 試 料 を Calibrator と し て 、 3.2.2 項 お よ び 3.2.3 項 に よ り 前 処
理 し 、 3.2.5 項 に 従 い UPLC–MS/MS に お い て 測 定 し た 。 ブ ラ ン ク 尿 試 料 に お け る 分
析 対 象 ペ プ チ ド V 11 溶 出 位 置 の 平 均 ピ ー ク 面 積 比 と SD n -1 を 算 出 し た 。こ の シ グ ナ ル
の 3 倍 （ S/N ≥ 3） と な る ピ ー ク 面 積 比 を 、 同 時 に 測 定 し た 5 pg/mL 添 加 尿 試 料 の ピ
ー ク 面 積 比 か ら 算 出 し 、 LOD 濃 度 と し た 。
3.2.7.5
日内再現性および日間再現性
精 度 確 認 用 試 料 と し て 、低 濃 度（ 10 pg/mL）、中 濃 度（ 20 pg/mL）お よ び 高 濃 度（ 50
pg/mL） の Darbepoetin alfa 添 加 尿 試 料 を 調 製 し た 。 各 濃 度 n = 5（ 2 回 注 入 ） の 尿 試
料 を 3.2.2 項 お よ び 3.2.3 項 に よ り 前 処 理 し 、 3.2.5 項 に 従 い UPLC–MS/MS に お い て
測 定 し た 。 日 内 再 現 性 と し て 、 そ れ ぞ れ の 濃 度 に お い て ピ ー ク 面 積 比 （ n = 10） の
精度を算出した。また、日間再現性として、異なる 3 日間におけるそれぞれの濃度
に お い て 平 均 ピ ー ク 面 積 比 （ n = 30） の 精 度 を 算 出 し た 。 精 度 は 次 式 （ 7） で 算 出 し
た。
精 度 （ %） ＝ 100 × ピ ー ク 面 積 比 の SD n - 1 /
3.2.7.6
ピーク面積比平均
（ 7）
イオンサプレッション
マトリックスによるイオンサプレッション効果の有無は、ポストカラムインフュ
ー ジ ョ ン に よ り 確 認 し た 。シ リ ン ジ ポ ン プ を カ ラ ム 出 口 に T 字 コ ネ ク タ ー に よ り 装
着 し 、合 成 ペ プ チ ド V 11 の 標 準 溶 液 を 送 液 し た（ ペ プ チ ド V 11 の 濃 度：1.0 μg/mL, 流
速 10 μL/分 ）。 次 に 、 異 な る 3 種 類 の ブ ラ ン ク 尿 試 料 を 3.2.2 項 お よ び 3.2.3 項 に よ
73
り 前 処 理 し 、UPLC–MS/MS に お い て 測 定 し た 。ペ プ チ ド V 11 の t R 近 傍 に お い て 、ベ
ースラインの変動と低下の有無を観測した。
3.2.7.7
定性分析
定 性 試 験 用 の 参 照 標 準 と し て 、 Darbepoetin alfa の 添 加 尿 試 料 を 20 pg/mL に 調 製
し た 。被 験 試 料 と し て 、10 種 類 の 異 な る ブ ラ ン ク 尿 試 料 に Darbepoetin alfa を 5 pg/mL
お よ び 100 pg/mL の 濃 度 と な る よ う に 調 製 し た 。 被 験 尿 試 料 か ら 得 ら れ た 分 析 対 象
ペ プ チ ド V 11 の t R と イ オ ン 比 率 が 参 照 標 準 の そ れ と 一 致 す る か 否 か を 、WADA が 規
定 す る 定 性 分 析 に 関 す る 技 術 文 書 （ WADA TD2010IDCR） を も と に 検 証 し た
3.2.7.8
71)
。
キャリーオーバー
高 濃 度 に 調 製 し た Darbepoetin alfa 添 加 尿 試 料 （ 100 pg/mL） お よ び ブ ラ ン ク 尿 試
料 （ n = 3） を 、 3.2.2 項 お よ び 3.2.3 項 に 従 い 同 時 に 前 処 理 し た 。 次 に 、 高 濃 度 添 加
尿 試 料 を 3.2.5 項 に 従 い UPLC–MS/MS 測 定 の 最 初 に 分 析 し 、引 き 続 き 、ブ ラ ン ク 尿
試 料 を 連 続 し て 測 定 し た 。 ブ ラ ン ク 尿 試 料 か ら 得 ら れ た 分 析 対 象 ペ プ チ ド の MRM
クロマトグラム上の検出位置におけるピークの検出有無を確認した。
3.2.8
Darbepoetin alfa の 単 回 静 脈 内 投 与 試 験
投 与 試 験 お よ び ヒ ト 試 料 の 取 り 扱 い に 関 し て は 、 第 1 章 の 1.2.6 項 に 記 載 ど お り
に 非 盲 検 下 で 行 っ た 。す べ て の 被 験 者 は 試 料 採 取 の 3 日 前 か ら ア ル コ ー ル 、医 薬 品 、
グレープフルーツ、サプリメントの摂取を不可とし、運動も不可とした。食事の制
限 は 特 に 実 施 し な か っ た 。 Darbepoetin alfa の 単 回 静 脈 内 投 与 試 験 と し て 、日 本 人 健
常 男 性 被 験 者 3 名 （ 年 齢 ： 28 – 36 才 、 BMI: 21.6 ± 2.9） を 対 象 と し 、 NESP ® 15 μg
を 静 脈 内 投 与 し た 。薬 剤 の 投 与 は 、午 前 9 時 に 空 腹 下 に 実 施 し た 。採 尿 は −24、−22、
−20、−18、−16、−14、−11、0 時 間（ 投 与 直 前 ）、2、4、6、8、10、13、24、26、28、
30、32、34、37、47 お よ び 48 時 間 に実 施 した。なお、尿 試 料 は、分 析 に供 するまで−20 °C
に保管した。
3.2.9
IEF–PAGE、 ダ ブ ル ブ ロ ッ テ ィ ン グ お よ び 化 学 発 光 検 出
UPLC–MS/MS 法 と の 比 較 の た め 、 WADA が 承 認 し た 現 行 の EPO ド ー ピ ン グ 検 出
法 で あ る IEF–PAGE を 行 っ た
10,8 0 , 90 )
。要 約 す る と 、尿 試 料 10 mL に 、EPO の 消 化 を
防 ぐ た め に 600 μL の プ ロ テ ア ー ゼ 阻 害 剤 カ ク テ ル（ Tris-HCl で pH 7.1 – 8.3 に 調 整 ）
を 加 え 、Steriflip（ 0.22 μm）で 精 密 ろ 過 し た 。さ ら に 、Amicon Ultra-15 お よ び Amicon
Ultra-4 で そ れ ぞ れ 限 外 ろ 過 に よ り 濃 縮 し た 。 次 に 、 MW 約 30-kDa 以 上 の 物 質 を 含
む 濃 縮 液 に 、 可 溶 化 の た め 界 面 活 性 剤 1%（ v/v） Tween 80 を 加 え て 溶 解 し 、 80 °C
で 3 分 間 加 熱 し た 。 ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ス ラ ブ ゲ ル （ pH gradient 2 – 6, 250 mm ×
120 mm × 1 mm） は 、 尿 素 、 Servalyts 2-4 お よ び 4-6 を TEMED で 重 合 し て 作 製 し
74
た 。事 前 泳 動（ 250 V, 30 分 , 8 °C）で ゲ ル に pH 勾 配 を 形 成 さ せ た 後 、ゲ ル を 約 3 時
間 電 気 泳 動 （ 3600 Vh with maximum setting of 2000 V, 50 mA, 30 W） し た 。 陰 極 液 お
よ び 陽 極 液 は 、そ れ ぞ れ 2% Servalyt 6–8 お よ び 1 M リ ン 酸 を 用 い た 。泳 動 後 の ゲ ル
は 、 緩 衝 液 （ 25 mM Tris-192 mM glycine） 中 で 2 分 間 平 衡 化 し た 。 次 に 、 NovaBlot
セ ミ ド ラ イ 式 転 写 シ ス テ ム（ GE ヘ ル ス ケ ア ）に よ り CH 3 OH で 親 水 化 し た PVDF 膜
に 転 写 し た（ 0.8 mA/cm 2 , 30 分 ）。ゲ ル と PVDF 膜 の 間 に ス ペ ー サ ー と し て Durapore
膜 を 置 き 、両 端 に 3 枚 の 転 写 用 ろ 紙（ ref3030917, Whatman, Kent, UK）を 使 用 し た 。
一 次 転 写 後 、PVDF 膜 を 5 mM DTT in PBS 中 で 37 °C で 60 分 間 イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン
し た 。次 に 、PVDF 膜 を 5%ス キ ム ミ ル ク in PBS に 20 分 間 浸 し て ブ ロ ッ キ ン グ し た 。
最 終 濃 度 が 1 μg/mL と な る よ う に 一 次 抗 体 と し て 抗 EPO 抗 体 （ AE7A5） を 1%ス キ
ム ミ ル ク in PBS 中 で 4 °C で 一 昼 夜 穏 や か に 浸 透 し た 。 次 に 、 0.1 M グ リ シ ン /HCl
（ pH 2.5） を 使 っ た キ ャ ピ ラ リ ー プ レ ッ シ ャ ー 法 （ 25 分 間 ） に よ り 、 PVDF 膜 に 二
次転写を行った
12 7 )
。 二 次 転 写 PVDF 膜 を ECL Advance™ で ブ ロ ッ キ ン グ し 、
EnVision™/HRP 抗 マ ウ ス 抗 体 （ in 2% ECL Advance™ blocking reagent） 中 で 、 60 分
間 室 温 で イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン し 、PVDF 膜 を PBS で 洗 浄 し た 。化 学 発 光 試 薬 に は ECL
Advance™ 検 出 キ ッ ト を 使 用 し 、イ メ ー ジ は CCD カ メ ラ LAS-3000（ 富 士 フ ィ ル ム ,
Tokyo, Japan） に よ り 測 定 し た 。 デ ー タ 解 析 は 、 GASepo version 1.3b2（ Seibersdorf,
Austria） お よ び イ メ ー ジ ゲ ー ジ version 4.0（ 富 士 フ ィ ル ム ） を 使 用 し た 。
3.3
結果および考察
タ ン パ ク 質 の 質 量 分 析 ア プ ロ ー チ に は 、 イ ン タ ク ト を 直 接 検 出 す る Top-down 法
も し く は 消 化 酵 素 に よ り ペ プ チ ド 断 片 と し た も の を 測 定 す る Bottom-up 法 が あ る 。
糖 タ ン パ ク 質 で あ る Darbepoetin alfa を 生 体 試 料 中 か ら イ ン タ ク ト の ま ま ESI に よ る
質量分析で測定することは困難であった
90 )
。 そ こ で 、 本 章 で は 、 Bottom-up 法 に よ
る 分 析 法 開 発 を 検 討 し た 。ま ず 、消 化 酵 素 の 選 定 お よ び ペ プ チ ド マ ッ ピ ン グ を 行 い 、
分 析 対 象 と す る 消 化 断 片 ペ プ チ ド を 選 定 し た 。 次 に 、 UPLC–MS/MS 分 析 条 件 検 討 、
尿 試 料 の 前 処 理 法 の 検 討 、 分 析 法 の バ リ デ ー シ ョ ン を 行 っ た 。 さ ら に 、 Darbepoetin
alfa の 投 与 尿 試 料 の 測 定 可 否 な ら び に 現 法 で あ る IEF–PAGE と の 比 較 を 行 い 、 分 析
法の妥当性を検討した。
3.3.1
ペプチド分析対象ペプチドの決定
ヒ ト EPO お よ び Darbepoetin alfa の 消 化 酵 素 に よ る 処 理 後 、 高 分 解 能 TOF–MS に
よ り ペ プ チ ド マ ッ ピ ン グ を 行 っ た 。ヒ ト EPO は 、そ の ア ミ ノ 酸 配 列 が 同 一 の Epoetin
alfa を 代 用 と し た 。 プ ロ テ オ ミ ク ス に お い て の ペ プ チ ド マ ッ ピ ン グ に 用 い ら れ る 消
化 酵 素 を 、Table 3-2 に 示 し た 。酵 素 に よ り ペ プ チ ド 結 合 の 切 断 位 置 は 特 異 的 で あ る
が 、本 章 に お い て は 、NH 4 HCO 3 buffer（ pH 7.8）中 で グ ル タ ミ ン 酸（ E）の C 末 端 側
75
を 特 異 的 に 切 断 す る V8-プ ロ テ ア ー ゼ を 用 い た
94)
。
Table 3-2. List
L
of enzyymatic digeestion for prroteomics
Enzyme
e
Specificityy
Trypsin
Lys(K)-X, Arg(R)-X
Endopro
oteinase Lys-C
C
Lys(K)-X
Endopro
oteinase Asp-N
N
X-Asp(D))
Endopro
oteinase Arg-C
C
Arg(R)-X
X
Proline specific Endop
proteinase
Pro(P)-X
X
Endopro
oteinase Glu-C
C
(V8-protease)
Glu(E)-X
X
in Ammo
onium bicarbonate (pH 7.8)
or Ammo
onium acetate (pH
(
4.0)
oteinase Glu-C
C
Endopro
(V8-protease)
Glu(E)-X
X, Asp(D)-X
in Phosp
phate (pH 7.8)
Darbeepoetin alfaa の 構 造 は 、Figure 3--1 に 示 す よ う に 、165
5 個のアミ ノ酸配列からな
る 。ヒ ト EPO の 5 箇 所 の ア ミ ノ 酸 を 、30（ A→N）
）、32（ H→T
T）、87（ P→V
V）、88（ W→
→N）
お よ び 90（ P→ T）
） の よ う に 改 変 し 、 5 箇 所 の N 型 糖 鎖 結 合 部 位 （ N 22 4 , N 30 , N 38 , N 83
お よ び N 8 8 ）と 1 箇 所 の O 型 糖 鎖 結 合 部 位（ S 12 6 ）を 有 し 、2
、 箇所の ジスルフィッド
3
結 合（ C 7 –C 1 61 お よ び C 2 9 –C 33
）に よ り 高 次 構 造 を 形 成 す る 分 子 量 約 337-kDa の 糖 タ ン
パク質である
95)
。
quences of ddarbepoetin
n alfa (left) and hEPO//epoetins (r ight).
Figurre 3-1. Amiino acid seq
Tablee 3-3 に は 、 ヒ ト EPO
O/Epoetin allfa お よ び Darbepoetin
D
n alfa の V 8-プ ロ テ ア ー ゼ
に よ る 消 化 後 の 断 片 ペ プ チ ド を 示 し た 。 TOF–M
MS 測 定 の 結 果 、 Darbeepoetin alfaa と ヒ
ト EPO /Epoetin al fa に 共 通 の 消 化 断 片 ペ プ チ ド と し て は 、 N-結 合 型 糖 ペ プ チ ド で あ
る V 7（ 3 8 NITVPDT
TKVNFYAW
WKRME 55 ）
）以 外 は す べ て 検 出 し た 。ま た 、共 通 消 化 断 片
ペ プ チ ド V 1 2 （ 11 8 AISPPDAA
ASAAPLRT
TITADTFRK
KLFRVYSN
NFLRGKLK
KLYTGE 1 5 9 ） は
76
O-結 合 型 糖 ペ プ チ ド で あ る が 、 O-結 合 型 糖 鎖 の 無 い V 1 2 も わ ず か に 検 出 さ れ た 。
Darbepoetin alfa は 5 箇 所 の ア ミ ノ 酸 が ヒ ト EPO/Epoetin alfa と 異 な る た め 、 理 論 的
に 3 つ の 消 化 断 片 ペ プ チ ド 、す な わ ち ジ ス ル フ ィ ド 結 合 し た V 5 -V（
6 Darbepoetin alfa：
24
NITTGCNE 3 1 = 32 TCSLNE 3 7 , ヒ ト EPO/Epoetin alfa:
24
NITTGCAE 3 1 = 3 2 HCSLNE 37 ）、V 1 0
（ 73 AVLRGQALLVNSSQVNE 8 9 ） お よ び V 11 に よ り ヒ ト EPO/Epoetin alfa と 識 別 が 可
能 で あ る 。 こ こ で 留 意 す る 点 は 、 Darbepoetin alfa の 90 位 の ア ミ ノ 酸 は ト レ オ ニ ン
（ T）で あ る が 、ヒ ト EPO/Epoetin alfa で は プ ロ リ ン（ P）で あ る 。V8-プ ロ テ ア ー ゼ
消化において、カルボキシル側にプロリンがある場合には切断されない
94)
。故に、
ヒ ト EPO/Epoetin alfa に お い て は 、 V 1 0 と V 11 が 切 断 さ れ な い N-結 合 型 糖 ペ プ チ ド
V 1 0 -V 11 （ 7 3 AVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKE 11 7 ） と
な る 。 Darbepoetin alfa に 特 異 的 な ペ プ チ ド V 5 -V 6 お よ び V 10 に つ い て は 、 両 者 と も
N-結 合 型 糖 ペ プ チ ド で あ る 。本 研 究 で は 、糖 ペ プ チ ド に つ い て は 検 索 し な か っ た が 、
ESI に お い て は 、 一 般 的 に シ ア ル 酸 を 含 む 糖 ペ プ チ ド の イ オ ン 化 効 率 は 悪 く 、 低 感
度 で あ る 。 Darbepoetin alfa の 消 化 断 片 ペ プ チ ド V 11 は 、 そ の ア ミ ノ 酸 配 列 中 に 糖 鎖
結 合 ア ミ ノ 酸 を 含 ま ず 、 ジ ス ル フ ィ ド 結 合 も 有 し て い な い 。 さ ら に 、 Bottom-up 法
によるタンパク質同定の場合、タンパク質もしくはペプチドのシーケンスカバー率
は 10%以 上 で あ る こ と が 推 奨 さ れ て い る
71 )
。 Darbepoetin alfa の 消 化 断 片 ペ プ チ ド
V 11 の シ ー ケ ン ス カ バ ー 率 は 、 17%で あ り 十 分 な ペ プ チ ド 長 が 得 ら れ た 。 ま た 、
NH 4 HCO 3 buffer（ pH 7.8） で は な く 、 PBS（ pH 7.8） を buffer と し て 用 い る と 、 グ ル
タ ミ ン 酸 （ E） と ア ス パ ラ ギ ン 酸 （ D） の カ ル ボ キ シ ル 側 が 切 断 さ れ る
合 、 Darbepoetin alfa に 特 異 的 な 消 化 断 片 ペ プ チ ド は
90
TLQLHVD
96
94 )
。その場
となり、シーケ
ン ス カ バ ー 率 は 4.2%と 不 十 分 と な る 。 故 に 、 本 章 で は 、 NH 4 HCO 3 buffer（ pH 7.8）
を用いることとした。インキュベーション条件について検討した結果、分析対象ペ
プ チ ド の 回 収 率 が 高 い 25 °C で 3 時 間 と し た 。 Table 3-4 に 、 TOF–MS 分 析 に よ る
Darbepoetin alfa の V8-プ ロ テ ア ー ゼ 消 化 断 片 ペ プ チ ド の モ ノ ア イ ソ ト ピ ッ ク イ オ ン
を 示 し た 。 ヒ ト EPO/Epoetin alfa と Darbepoetin alfa に 共 通 の 消 化 断 片 ペ プ チ ド で あ
る V 2 、 V 8 お よ び V 9 は 、 1 価 （ [M+H] + ） お よ び 2 価 （ [M+2H] 2 + ） の プ ロ ト ン 付 加 イ
オ ン が 検 出 さ れ た 。 ま た 、 Figure 3-2 に 示 し た よ う に 、 最 も 強 度 が 強 い イ オ ン は 、
Darbepoetin alfa に 特 異 的 な 消 化 断 片 ペ プ チ ド V 11 の 5 価 の プ ロ ト ン 付 加 イ オ ン
（ [M+5H] 5 + ）で あ っ た 。モ ノ ア イ ソ ト ピ ッ ク イ オ ン と 理 論 値 と の 質 量 誤 差 を 式（ 6）
に よ り 算 出 し た 結 果 、6 ppm 以 内 で 一 致 し た 。さ ら に 、消 化 断 片 ペ プ チ ド で あ る V 2 、
V 8 、V 9 お よ び V 11 を 合 成 し て 精 密 質 量 の 一 致 を 確 認 し た 。以 上 か ら 、ヒ ト EPO/Epoetin
alfa と Darbepoetin alfa を 識 別 す る 消 化 断 片 と し て 、ペ プ チ ド V 11 を 選 定 し た 。ま た 、
ヒ ト EPO/Epoetin alfa と Darbepoetin alfa に 共 通 の 消 化 断 片 ペ プ チ ド V 9 、 V 2 お よ び
V8 の う ち 、 最 も 強 度 が 強 く ペ プ チ ド 鎖 の 長 い 消 化 断 片 ペ プ チ ド V9 を 分 析 対 象 ぺ プ
チドとした。
77
Table 3-3. Predicted peptides after V8-protease digestion of human EPO (epoetin alfa) and
darbepoetin alfa in an ammonium bicarbonate buffer (pH 7.8)
Peptide
Amino acid sequence
Sequence
Origin
Note
11.5%
common
disulfide linked (C7=C161)
3.0%
common
1.8%
common
1.2%
common
8.5%
darbepoetin alfa
coverage
V1-V13
1
APPRLICDSRVLE13
=160ACRTGD165
V2
14
RYLLE18
V3
19
V4
22
V5-V6
24
AKE
AE
21
23
NITTGCNE
32
= TCSLNE
31
37
N-glycosylated (N24, N30)
disulfide linked (C29=C33)
mutated at N30 and T32
24
NITTGCAE
31
human EPO
N-glycosylated (N24)
(epoetin alfa)
disulfide linked (C29=C33)
10.9%
common
N-glycosylated (N38)
4.2%
common
6.1%
common
10.3%
darbepoetin alfa
8.5%
=32HCSLNE37
V7
38
NITVPDTKVNFYAWKR
ME
V8
56
V9
63
V10
73
VGQQAVE62
VWQGLALLSE
72
AVLRGQALLVNSSQVN
E
V10-V11
55
89
mutated at V87 and N88
73
AVLRGQALLVNSSQPW
27.3%
E89=90PLQLHVDKAVSGL
human EPO
N-glycosylated (N83)
(epoetin alfa)
no cleavage
RSLTTLLRALGAQKE117
V11
90
TLQLHVDKAVSGLRSLT
TLLRALGAQKE
V12
N-glycosylated (N83, N88)
at proline residue (P90)
17.0%
darbepoetin alfa
mutated at T90
25.5%
common
O-glycosylated (S126) and non-
117
118
AISPPDAASAAPLRTIT
ADTFRKLFR
O-glycosylated
VYSNFLRGKLKLYTGE159
78
Table 3-4. TOF–MS analysis of synthetic peptides and the selected peptides after
V8-protease digestion of darbepoetin alfa
Monoisotopic ion
Peptide
synthetic
Charge state
V2
V8
V9
V11
after V8-protease digestion
m/z
m/z
error
m/z
error
theoretical
experimental
(ppm)
experimental
(ppm)
2
347.2001
347.1997
-1.15
347.1997
-1.15
1
693.3930
693.3908
-3.17
693.3965
5.05
2
365.6901
365.6903
0.55
365.6903
0.55
1
730.3730
730.3759
3.97
730.3759
3.97
2
558.3084
558.3094
1.79
558.3094
1.79
1
1115.6095
1115.6060
-3.14
1115.6060
-3.14
6
503.9631
503.9614
-3.37
503.9614
-3.37
5
604.5543
604.5524
-3.14
604.5524
-3.14
4
755.4410
755.4398
-1.59
755.4398
-1.59
3
1006.9189
1006.9136
-5.26
1006.9136
-5.26
2
1509.8748
1509.8726
-1.46
1509.8726
-1.46
study121010A08 264 (2.379)[M+5H]
604.7519
100
5+
1: TOF MS ES+
2.03e5
604.7519
100
[M+5H]5+
604.9515
604.9515
604.5524
605.1565
%
[M+6H]6+
604.5524
%
504.1288
605.3561
605.5558
605.1565
[M+4H]4+
755.6870
0
605
606
m/z
503.9614
756.1935
[M+3H]3+
1007.2477
756.4407
1007.9161
756.6941
0
200
400
600
800
1000
1200
[M+2H]2+
1400
1600
1800
Figure 3-2. TOF mass spectrum of the peptide V 11 .
79
m/z
3.3.2
データベース検索
Darbepoetin alfa 由 来 の 酵 素 消 化 断 片 ペ プ チ ド V 11 と 同 じ ア ミ ノ 酸 配 列 を 有 す る タ
ンパク質もしくはペプチドが尿試料中に共存する場合、ドーピング検査において、
偽 陽 性 結 果 を 導 く 可 能 性 が あ る 。 そ こ で 、 消 化 断 片 ペ プ チ ド V 11 の 相 同 性 、 す な わ
ち 、 そ の ア ミ ノ 酸 配 列 を 公 開 さ れ て い る タ ン パ ク 質 デ ー タ ベ ー ス BLAST ® と 照 合 し
た 。 そ の 結 果 、 分 析 対 象 ペ プ チ ド V 11 の ア ミ ノ 酸 配 列 と 完 全 に 一 致 す る タ ン パ ク 質
およびペプチドは、データベース上には存在しなかった。最も相同性の高かったタ
ン パ ク 質 は 、 EPO（ Homo sapiens） で あ り 96%の 相 同 性 で あ っ た
（ PLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKE）。2 番 目 は 、EPO（ Felis catus）の 93%で
あ っ た （ TLQLHVDKAVSSLRSLTSLLRALGAQKE）。 馬 （ Equus caballus） の EPO に
お い て は 、 89%（ TLRLHVDKAVSSLRSLTSLLRALGAQKE） で あ っ た 。 こ の よ う に 、
デ ー タ ベ ー ス と 照 合 し た 結 果 か ら 、 分 析 対 象 ペ プ チ ド V 11 の ア ミ ノ 酸 配 列 は
Darbepoetin alfa に 特 異 的 で あ る こ と を 確 認 し た 。 以 上 の こ と か ら 、消 化 断 片 ペ プ チ
ド V 11 を 測 定 対 象 と す る こ と は 、 Darbepoetin alfa ド ー ピ ン グ の 検 出 に 適 し て い る こ
とが裏付けられた。
3.3.3
Darbepoetin alfa の UPLC–MS/MS に よ る 分 析 法 の 開 発
分 析 対 象 ペ プ チ ド V 11 の プ ロ ダ ク ト イ オ ン 質 量 ス ペ ク ト ル を 、 Figure 3-3a に 示 し
た 。プ リ カ ー サ ー イ オ ン m/z 604.9（ [M+5H] 5+ ）の CID に よ り 得 ら れ た プ ロ ダ ク ト イ
オ ン は 、m/z 670.4（ y 25 4+ ）、m/z 698.1（ [y 2 6 –H 2 O] 4+ ）、m/z 702.5（ y 2 6 4 + ）、m/z 642.2（ y 24 4 + ）
お よ び m/z 276.3（ y 2 ） で あ っ た 。 最 も 強 度 の 強 い ベ ー ス ピ ー ク イ オ ン は 、 m/z 187.2
で あ っ た 。 こ こ で 、 追 加 の MS 3 測 定 を リ ニ ア イ オ ン ト ラ ッ プ 型 質 量 分 析 計 （ LTQ
Velos, Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany） に よ り 行 っ た 。 そ の 結 果 、 観 測 さ
れ た m/z 187.2 の イ オ ン は 、 b 2 -ion（ m/z 215.2） か ら CO（ –28 u） の 脱 離 し た イ オ ン
と 帰 属 し た 。 Darbepoetin alfa と ヒ ト EPO/Epoetin alfa に 共 通 の 消 化 断 片 ペ プ チ ド V 9
の プ ロ ダ ク ト イ オ ン 質 量 ス ペ ク ト ル を 、 Figure 3-3b に 示 し た 。 プ リ カ ー サ ー イ オ ン
m/z 558.3（ [M+2H] 2 + ）の CID に よ り 、m/z 148.0（ y 1 ）、m/z 235.2（ y 2 ）お よ び m/z 584.3
（ b 5 ）な ど 多 く の b イ オ ン お よ び y イ オ ン が 観 測 さ れ た 。Hexarelin（ I.S.）に 関 し て
は 、 プ リ カ ー サ ー イ オ ン m/z 444.4（ [M+2H] 2 + ） か ら 主 に m/z 129.1（ y 1 –NH 3 ） が 観
測 さ れ た 。な お 、価 数 に つ い て は quadrupole−TOF–MS 分 析 に よ り 確 認 し た 。ド ー ピ
ン グ 検 査 に お け る 定 性 分 析 で は 、1 成 分 あ た り 少 な く と も 3 つ の mass transition に お
いてピークを検出する必要がある
71)
。 本 研 究 で は 、 分 析 対 象 ペ プ チ ド V 11 に は 、 6
つ の mass transition を 設 定 し た 。
80
(a)
b2–CO478 (4.892) Cm (475:482)
study121001038
b2 b3 b4
187.2
100
2: Daughters of 605ES+
1.88e7
T L Q L H V D K A V S G L R
y 26 y 25 y 24
S L T T L L R A L G A QK E
y2
study121001038 478 (4.892) Cm[y(475:482)
26–H2O]
698.1
100
y 264+
4+
6.16e6
%
%
702.5
129.1
670.4
642.2
666.2
639.1
0
600
y 254+
y 244+
604.9
620
640
693.9
703.2
693.0
660
680
700
730.8
720
738.7 750.0
740
m/z
698.1
b2
702.5
215.2
[M+5H]5+
670.4
604.9
y2
276.3
379.2 503.8
0
200
400
838.8
844.2
558.8
905.6 1027.4
600
800
1000
(b)
y 2 141 (2.905)
study121001100
235.2
100
1165.7
m/z
1200
4: Daughters of 558ES+
2.57e7
b2 b3 b4 b5 b6 b7 b8
V W Q G L A L L S E
%
y5 y4 y3 y2 y1
y1
148.0
y3
348.5
85.8
b2
286.2
y4
461.3
441.5
y5
532.3
584.3
b5
b6
b7
768.7
751.1 782.5
0
200
400
600
800
b8
881.7
999.7
1000
m/z
1200
Figure 3-3. ESI product ion mass spectra of the peptides V 11 (a) and V 9 (b).
81
次 に 、 カ ラ ム 分 離 を 検 討 し た 。 一 般 に 用 い ら れ る HPLC
C 条 件 、 す な わ ち BEH
H C18
カ ラ ム を 用 い て 、 HCOOH/C
CH 3 CN を 移 動 相 と し て 分 析 し た 結 果 を Fiigure 3-4 に 示 し
た 。 分 析 対 象 ペ プ チ ド V 11 の ピ ー ク 形 状 は 、 他 の 消 化 断 片 ペ プ チ ド の そ れ と 比 較 し
て ブ ロ ー ド と な っ た 。さ ら に 、ポ ア サ イ ズ 130-Å
Å お よ び 300-Å に お い て も 同 様 の 結
果 で あ っ た 。次 に 、移 動 相 に 少 量 の T
TFA（ 0.01%
%, v/v）を 加 え る こ と で 、TFA と ペ プ
チ ド の イ オ ン ペ ア に よ り 、シ ラ ノ ー ル の 相 互 作 用 を 抑 える こ と で ピ ー ク 形 状は 改 善
し た が 、 感 度 の 低 下 を 招 く 結 果 と な っ た 。 こ れ は 、 ESI イ オ ン 化 の 際 の TFA 帯 電 液
滴 の 表 面 張 力 が 高 い こ と によ る 効 率 的 な イ オ ン 形 成 の 妨げ と 、 気 相 に お け るペ プ チ
ド の 塩 基 性 部 位 と TFA の イ オ ン ペ ア 形 成 に よ る も の と 考 え ら れ た
9 66 -9 8)
。
urface hybrid (CSH) C 1 8 column and
a
C 18
Figure 33-4. Compaarison of pe ak shape inn charged su
column..
82
CSH パ ー テ ィ ク ル は 、 エ チ レ ン 架 橋 型 ハ イ ブ リ ッ ド （ BEH） パ ー テ ィ ク ル の 表 面
に極微量のチャージを結合させることで、酸性の低イオン強度移動相条件（例えば
0.1% HCOOH） 下 で 使 用 し た 場 合 に 、 塩 基 性 化 合 物 の ピ ー ク 形 状 を 向 上 さ せ る よ う
に デ ザ イ ン さ れ た カ ラ ム で あ る 。 そ こ で 、 分 析 カ ラ ム に は CSH C 18 カ ラ ム を 用 い る
こ と と し た 。 Figure 3-5 に 示 す よ う に 、 消 化 断 片 ペ プ チ ド V 11 、 V 9 お よ び Hexarelin
（ I.S.） の t R は そ れ ぞ れ 2.6 分 、 2.9 分 お よ び 1.8 分 に 検 出 さ れ 、 他 の 消 化 断 片 ペ プ
チ ド V 8 お よ び V 2 と 明 瞭 に 分 離 し 、 良 好 な ピ ー ク 形 状 が 得 ら れ た 。 最 終 的 に 、 CSH
カ ラ ム を 使 用 す る こ と で 、 移 動 相 に TFA を 用 い る こ と な く 、 分 析 対 象 ペ プ チ ド V 11
を良好なピーク形状で高感度に測定が可能となった。
study121001100
(a)
1.79
Hexarelin (I.S.)
3: Daughters of 444ES+
TIC
7.61e8
%
100
0
0.00
study121001100
2.00
(b)
3.00
2.62
0
0.00
study121001100
1.00
2.00
3.00
(c)
2.90
4.00
5.00
4: Daughters of 558ES+
TIC
1.08e8
V9 : VWQGLALLSE
%
100
4.00
5.00
5: Daughters of 605ES+
TIC
1.46e8
V11 : TLQLHVDKAVSGLR
SLTTLLRALGAQKE
%
100
1.00
0
0.00
study121001100
(d)
2.00
3.00
4.00
5.00
2: Daughters of 366ES+
TIC
5.56e7
3.00
4.00
5.00
1: Daughters of 347ES+
TIC
1.39e8
3.00
4.00
1.18
V8 : VGQQAVE
%
100
1.00
0
0.00
study121001100
(e)
2.00
1.68
V2 : RYLLE
%
100
1.00
0
0.00
1.00
2.00
Time
5.00
Figure 3-5. Product ion mass chromatograms of hexarelin (I.S.) (a), V 11 (b),
V 9 (c), V 8 (d) and V 2 (e).
83
次 に 、メ ソ ッ ド バ リ デ ー シ ョ ン を 行 っ た 。Figure 3-6 に は 、合 成 ペ プ チ ド V 11 、V 9
お よ び Darbepoetin alfa の 添 加 尿 試 料 （ 5 pg/mL お よ び 20 pg/mL） の 典 型 的 な MRM
ク ロ マ ト グ ラ ム 示 し た 。最 下 段 は ペ プ チ ド V 9 の イ オ ン（ m/z 558>584）、上 か ら 4 段
は ペ プ チ ド V 11 の 4 つ の イ オ ン （ m/z 604.9>702.5, m/z 604.9>670.4, m/z 604.9>642.2,
m/z 604.9>187.2） の MRM ク ロ マ ト グ ラ ム を 示 す 。
604.9 >702.5
9.95e4
V 11
%
2.75
0
3.00
604.9 >670.4
4.00e4
2.61
V 11
0
0
0
3.00
604.9 >642.2
2.15e4
2.61
V 11
2.50
2.75
2.75
2.63
100
0
3.00
604.9 >187.2
1.59e5
2.61
V 11
V 11
604.9 >642.2
4.76e3
2.50
2.75
2.75
2.63
100
2.89
558.3 >584.3
9.63e4
V 11
604.9 >187.2
2.69e4
2.50
100
2.75
2.50
2.75
3.00
(a) Synthetic peptide
Time
0
100
V9
0
3.00
2.90 558.3 >584.3
2.50
2.75
2.63
V 11
2.50
2.75
2.62
V 11
2.50
2.75
2.63
V 11
2.50
100
2.75
V9
6.01e3
%
%
V9
0
3.00
100
0
3.00
%
2.50
100
0
3.00
%
2.50
100
0
V 11
604.9 >670.4
4.76e3
3.00
604.9 >670.4
2.05e4
3.00
604.9 >642.2
1.66e4
%
2.75
%
100
2.63
0
3.00
%
2.50
%
100
2.75
V 11
604.9 >702.5
7.05e4
3.00
604.9 >187.2
1.01e5
%
0
100
2.50
V 11
2.63
%
2.50
%
100
2.63
100
3.00
2.90 558.3 >584.3
1.23e4
%
0
604.9 >702.5
2.66e4
100
%
2.61
%
100
2.50
2.75
Time
3.00
(b) 5 pg/mL spiked urine
0
2.50
2.75
3.00
Time
(c) 20 pg/mL spiked urine
Figure 3-6. Typical MRM chromatograms generated from the authentic synthetic peptides
(a), urine spiked with 5 pg/mL of darbepoetin alfa (b) and urine spiked with 20 pg/mL of
darbepoetin alfa (c).
30 種 類 の 異 な る ブ ラ ン ク 尿 試 料 に お い て 、分 析 対 象 ペ プ チ ド V 11 の t R に 夾 雑 す る ピ
ー ク は 観 測 さ れ な か っ た （ Figure 3-7a）。 5 – 10 pg/mL の 濃 度 範 囲 に お い て 、 直 線 一
次 回 帰 式 は 、 y = 0.003x – 0.003（ R = 0.988, 3 回 の 平 均 ） で あ っ た 。 Darbepoetin alfa
の immunopurification に お け る 回 収 率 は 、44 ± 11%（ 平 均 ± SD n - 1 , n = 10）で あ っ た 。
Guan ら は 、 ト リ プ シ ン 消 化 お よ び peptide-N-glycosidase F（ PNGaseF） を 併 用 し 、
N-結 合 型 糖 鎖 を 切 断 し た 消 化 断 片 ペ プ チ ド
77
84
GQALLVNSSQVNETLQLHVDK 9 7 （ T 9 ）
を 分 析 対 象 と し て 、 馬 お よ び ヒ ト の 血 漿 中 の Darbepoetin alfa の LC–MS/MS 分 析 法
に適用できることを報告した
99 ,100 )
。し か し な が ら 、こ の 方 法 の LOD は 0.1ng/mL と
さ ら な る 高 感 度 化 が 必 要 で あ っ た 。今 回 開 発 し た 方 法 は 、LOD は 1.2 pg/mL で あ り 、
高 感 度 に 検 出 が 可 能 で あ る 。 日 内 お よ び 日 間 再 現 性 は 、 そ れ ぞ れ 8.6 − 9.4%お よ び
11.3 − 13.7%と 、良 好 な 再 現 性 を 示 し た 。な お 、安 定 同 位 体 標 識 し た Darbepoetin alfa
を I.S.に 使 用 す る こ と が 可 能 で あ れ ば 、immunopurification お よ び 引 き 続 い て の 酵 素
消化の成否を監視することが可能である。しかし、今回は入手および合成が困難で
あったため使用できなかった。そこで、イオンサプレッションによる影響を検討し
た 。 そ の 結 果 、 分 析 対 象 ペ プ チ ド V 11 の t R 近 傍 に お い て は 、 ベ ー ス ラ イ ン の 変 動 す
なわち、イオンサプレッションは認められなかった。次に、質量分析による定性分
析 に お け る WADA 基 準 に 適 用 し て 、 本 法 の 妥 当 性 を 検 討 し た 。 WADA 基 準 で は 、
参 照 標 準 物 質 の tR お よ び 3 つ の 特 異 的 な 診 断 イ オ ン の 強 度 比 が 測 定 対 象 物 質 と 一 致
することと規定されている
71 )
。Table 3-5 に 示 し た よ う に 、Darbepoetin alfa 添 加 尿 試
料（ 5 pg/mL お よ び 100 pg/mL）か ら 得 ら れ た 分 析 対 象 ペ プ チ ド V 11 の 6 つ の プ ロ ダ
ク ト イ オ ン の イ オ ン 比 率 な ら び に I.S.に 対 す る 相 対 t R は 、参 照 標 準（ Darbepoetin alfa
20 pg/mL 添 加 尿 試 料 ）と 一 致 し た 。こ の WADA 定 性 分 析 基 準 を 満 た す 最 小 濃 度 は 、
5 pg/mL で あ り 、 確 認 分 析 に お け る LOD と し た 。 キ ャ リ ー オ ー バ ー は 、 高 感 度
LC−MS/MS 分 析 に お い て し ば し ば 問 題 と な り 、実 検 体 測 定 に お い て は 排 除 し な け れ
ばならない問題である
1 01 )
。今 回 、高 濃 度 添 加 尿 試 料（ Darbepoetin alfa 100 pg/mL 添
加尿試料）の測定に引き続き、3 種類のブランク尿試料を測定した。その結果、分
析 対 象 ペ プ チ ド V 11 の t R に お い て 夾 雑 す る ピ ー ク は 検 出 さ れ な か っ た 。 し か し 、 分
析 対 象 ペ プ チ ド V 11 は 非 常 に 強 い 吸 着 性 を 有 し て い る こ と に 留 意 す る 必 要 が あ っ た 。
今 回 、オ ー ト サ ン プ ラ ー の 注 入 ニ ー ド ル の 材 質 を ス テ ン レ ス 製 で は な く Peek 製 と し 、
さらに、洗浄溶媒を最適化したことで試料注入時のキャリーオーバーを回避するこ
と が 可 能 で あ っ た 。高 濃 度 の Darbepoetin alfa を 分 析 し た 後 に 見 ら れ る カ ラ ム へ の メ
モ リ ー 効 果 は 、 低 濃 度 の Darbepoetin alfa を 検 出 す る 際 に 非 常 に 大 き な 問 題 と な る 。
本 検 討 の 結 果 、 高 濃 度 Darbepoetin alfa（ >100 pg/mL） を 分 析 し た 後 、 100% CH 3 CN
を 複 数 回 （ 少 な く と も 2 回 ） 注 入 す る こ と で 、 分 析 対 象 ペ プ チ ド V 11 の カ ラ ム 吸 着
は回避することが可能であった。
85
3.3.4
尿 中 Darbepoetin alfa の 分 析
1 名 の 被 験 者 の 投 与 前 、投 与 後 2 時 間 お よ び 投 与 後 47 時 間 の 尿 試 料 を 分 析 し て 得
ら れ た MRM ク ロ マ ト グ ラ ム を Figure 3-7 に 示 し た 。 ヒ ト EPO/Epoetin alfa お よ び
Darbepoetin alfa に 共 通 の 消 化 断 片 ペ プ チ ド V 9 の ピ ー ク は 、 投 与 前 後 の 尿 試 料 に お
い て t R = 2.9 分 に 検 出 さ れ た （ Figure 3-7 最 下 段 ）。 投 与 前 の 尿 試 料 に お け る ペ プ チ
ド V 9 は 内 因 性 EPO 由 来 で あ り 、 投 与 後 尿 試 料 に お い て は 、 内 因 性 EPO お よ び
Darbepoetin alfa の 両 者 由 来 で あ る と 推 測 さ れ る 。 投 与 後 2 時 間 （ Figure 3-7b） お よ
び 47 時 間 （ Figure 3-7c） で は 、 ペ プ チ ド V 11 の ピ ー ク が 、 4 つ の mass transition に
お け る MRM ク ロ マ ト グ ラ ム に お い て t R = 2.6 分 に 検 出 さ れ た 。 一 方 、 投 与 前 で は
V 11 の ピ ー ク は 、い ず れ の mass transition に お い て も 検 出 さ れ な か っ た（ Figure 3-7a）。
他 の 2 名 の 被 験 者 に お い て も 同 様 の 結 果 が 得 ら れ た 。 こ の よ う に 、 Darbepoetin alfa
投 与 後 に 採 取 し た 尿 試 料 す べ て か ら 分 析 対 象 ペ プ チ ド V 11 を 検 出 し た 。
2.75
0
3.00
604.9 >670.4
1.73e3
100
2.50
2.75
0
3.00
604.9 >670.4
3.85e4
2.63
V 11
0
3.00
604.9 >642.2
1.57e3
2.50
2.75
2.75
0
3.00
604.9 >187.2
1.84e4
604.9 >642.2
3.31e4
2.63
V 11
2.50
2.75
100
2.75
2.90 558.3 >584.3
604.9 >187.2
2.07e5
2.63
V 11
2.50
100
2.75
V9
2.99e3
100
0
3.00
2.91 558.3 >584.3
2.50
2.75
3.00
604.9 >670.4
1.82e4
2.63
V 11
2.50
2.75
3.00
2.63
604.9 >642.2
1.45e4
V 11
2.50
2.75
3.00
2.63
604.9 >187.2
9.06e4
V 11
2.50
2.75
3.00
2.91
100
V9
2.22e4
%
%
V9
0
3.00
3.11
558.3 >584.3
1.24e4
%
2.50
100
0
3.00
%
%
100
V 11
%
2.50
100
0
3.00
%
%
100
604.9 >702.5
5.72e4
2.63
%
2.75
100
0
3.11
%
%
2.50
100
0
V 11
100
%
2.50
100
0
604.9 >702.5
1.41e5
2.63
%
%
0
100
%
604.9 >702.5
2.90e4
100
3.04
0
2.50
2.75
3.00
Time
(a) Pre-administration
0
2.50
2.75
3.00
(b) Post 2 h
Time
0
2.50
2.75
3.00
Time
(c) Post 47 h
Figure 3-7. Typical MRM chromatograms generated from urine samples collected before
and after intravenous injection of 15 μg darbepoetin alfa: (a) pre-administration, (b) post 2
h and (c) post 47 h.
86
ド ー ピ ン グ 検 査 に お け る LC−MS に よ る 定 性 分 析 に お い て は 、 参 照 標 準 の t R お よ
び 成 分 の 構 造 的 特 徴 を 示 す 診 断 イ オ ン と WADA に よ り 設 定 さ れ た 基 準 範 囲 内
（ torelance） で 一 致 す る こ と に よ り 測 定 試 料 中 の 成 分 を 同 定 す る こ と と 規 定 さ れ て
いる
71 )
。 Table 3-5 に 、 Darbepoetin alfa 投 与 尿 試 料 の 定 性 分 析 結 果 を 示 し た 。
Table 3-5. Compatibility of the relative retention times and the relative abundances of
diagnostic ions with the identification criteria for qualitative assay
Analyte
RRT
Abundance (Peak area)
Diff.%
Relative%
m/z 604.9
m/z 604.9
m/z 604.9
m/z 604.9
m/z 604.9
m/z 604.9
> 187.2
> 670.4
> 698.1
> 702.5
> 642.2
> 276.3
Reference
1.461
3778
868
2338
2548
661
336
20 pg/mL
−
100%
23.0%
61.9%
67.4%
17.5%
8.9%
Post 2 h
Post 47 h
1.461
7717
1615
5038
5128
1240
666
100%
100%
20.9%
65.3%
66.5%
16.1%
8.6%
1.461
3303
800
2252
2041
490
286
100%
100%
24.2%
68.2%
61.8%
14.8%
8.7%
Spiked
1.461
1023
191
614
639
159
124
5 pg/mL
100%
100%
18.7%
60.0%
62.5%
15.5%
12.1%
Spiked
1.461
16416
3411
10281
10566
2304
1190
100 pg/mL
100%
100%
20.8%
62.6%
64.4%
14.0%
7.2%
99–
−
3.9–13.9%
Tolerance71)
101%
18.0–
51.9–
57.4–
12.5–
28.0%
71.9%
77.4%
22.5%
ま ず 、 参 照 標 準 （ Darbepoetin alfa 20 pg/mL 添 加 尿 試 料 , Table 3-5 最 上 段 ） お よ び
測 定 試 料 に お い て 、分 析 対 象 ペ プ チ ド V 11 の I.S.（ Hexarelin）に 対 す る 相 対 t R（ relative
retention time: RRT） を 算 出 し た 。 LC−MS に お け る t R の 一 致 基 準 範 囲 （ torelance）
は 、参 照 標 準 の RRT に 対 し て 測 定 試 料 の RRT の 差 が ± 0.1 %と 規 定 さ れ て い る（ Table
3-5 最 下 段 ）。 Darbepoetin alfa 投 与 尿 試 料 の RRT は 、 参 照 標 準 の RRT（ 1.461） と 完
全 に 一 致 し た 。次 に 、分 析 対 象 ペ プ チ ド V 11 の ベ ー ス ピ ー ク イ オ ン（ m/z 604.9>187.2）
に 対 す る 各 診 断 イ オ ン （ m/z 604.9>670.4, m/z 604.9>698.1, m/z 604.9>702.5, m/z
604.9>642.2, m/z 604.9>276.3）の 強 度 比（ rerative abundance: Relative%）を 算 出 し た 。
参 照 標 準 に お け る 診 断 イ オ ン の Relative%が >50 %の 場 合 、 torelance は 参 照 標 準 の
Relative% ± 10 %、 ま た 、 5% − 25%の 場 合 の torelance は 参 照 標 準 の Relative% ± 5 %
と 規 定 さ れ て い る 。 故 に 、 診 断 イ オ ン m/z 604.9>698.1 お よ び m/z 604.9>702.5 の
torelance は 、 参 照 標 準 の Relative% ± 10 %と な る 。 ま た 、 m/z 604.9>670.4, m/z
604.9>642.2 お よ び m/z 604.9>276.3 の torelance は 、 参 照 標 準 の Relative% ± 5 %と な
る （ Table 3-5 最 下 段 ）。 Darbepoetin alfa 投 与 尿 試 料 に お け る 各 診 断 イ オ ン の
Relative%は 、torelance を 満 た し た 。こ の よ う に 、本 分 析 法 は 、WADA が 要 求 す る 定
性分析基準を満足し、ドーピング検査に適用可能であると云える。
87
次 に 、本 章 で 開 発 し た UPLC−MS/MS 法 の 妥 当 性 を 検 討 す る た め に 、現 在 の WADA
承 認 rEPO 検 査 法 で あ る IEF−PAGE に よ り 、同 一 尿 試 料 を 分 析 し た 。Figure 3-8 に 示
し た よ う に 、 Darbepoetin alfa の 同 族 体 バ ン ド （ lane 1 お よ び lane 8 の 酸 性 領 域 ） は
他 の EPO 同 族 体 の バ ン ド（ lane 1 お よ び lane 8 の 塩 基 性 領 域 : Epoetins , lane 2: urinary
EPO） と 比 較 し て 、 際 立 っ て 酸 性 側 に シ フ ト し て お り 、 少 な く と も 4 つ の バ ン ド か
ら 構 成 さ れ て い る 。 IEF−PAGE に よ る Darbepoetin alfa 5 pg/mL の 尿 試 料 の バ ン ド
（ lane 3）は 、不 鮮 明 で あ り 、Darbepoetin alfa を 検 出 す る の は 困 難 で あ っ た 。IEF−PAGE
のみでドーピング判定することは偽陽性結果を導く可能性があった。このような場
合 、 SDS−PAGE な ど の 追 加 分 析 が 必 要 で あ る 。 こ の 尿 試 料 を 本 研 究 で 開 発 し た
UPLC−MS/MS 法 に 適 用 し た 場 合 は 、明 瞭 に 検 出 が 可 能 で あ っ た（ Figure 3-6b お よ び
Table 3-5）。 Darbepoetin alfa 投 与 尿 試 料 に つ い て は 、 IEF−PAGE に よ り WADA の 検
出 基 準 （ WADA TD2009EPO） 10 ） を 満 た し 、 良 好 に 検 出 可 能 で あ っ た （ lane 5: 投 与
前 , lane 6: 投 与 2 時 間 後 , lane 7: 投 与 47 時 間 後 ）。同 一 の 尿 試 料 を UPLC−MS/MS 法
に 適 用 し た 場 合 も 良 好 に 検 出 が 可 能 で あ っ た（ Figure 3-7 お よ び Table 3-5）。こ の よ
う に 、本 章 に お い て 開 発 し た UPLC−MS/MS 法 は 現 行 の rEPO ド ー ピ ン グ の 検 出 法 で
あ る IEF−PAGE の 確 認 分 析 と し て 有 用 で あ る こ と が 確 認 さ れ た 。 タ ン パ ク 質 に 結 合
した糖鎖のシアル酸含量の増大は、血清中の半減期を延長させる効果がある
102 )
。
Darbepoetin alfa は 、 IEF–PAGE に よ り 皮 下 投 与 後 の 尿 中 か ら 長 期 間 に わ た り 検 出 が
可能であることが報告されている
1 03 , 10 4 )
。 本 研 究 に お い て 、 Darbepoetin alfa は 静 脈
内投与を行い、投与 2 日後でも検出が可能であった。静脈内投与は皮下投与と比較
して消失が早いと考えられる。検出可能期間についての調査は、より長期間に尿試
料を採取して確認する必要がある。
–
Basic area
Epoetins
Endogenous area
Urinary human EPO
Acidic area
Darbepoetin alfa
+
1
2
3
4
5
6
7
8
Figure 3-8. Immunoblots data separated by IEF−PAGE. 1: standard epoetins/darbepoetin
alfa, 2: urinary EPO, 3: 5 pg/mL-urine of darbepoetin alfa, 4: 20 pg/mL-urine of
darbepoetin alfa, 5: pre-administration, 6: post 2 h, 7: post 47 h, 8: standard
epoetins/darbepoetin alfa.
88
3.4
小括
Darbepoetin alfa の 静 脈 内 投 与 後 に 採 取 さ れ た ヒ ト 尿 試 料 か ら 、高 感 度 か つ 迅 速 に
Darbepoetin alfa の 検 出 を 可 能 と す る UPLC−MS/MS 法 を 開 発 し た 。 本 法 は 、 質 量 分
析 に よ り ヒ ト 尿 中 の EPO 製 剤 Darbepoetin alfa の 検 出 を ド ー ピ ン グ 検 査 に 適 用 可 能
と し た 最 初 の 報 告 で あ る 。ド ー ピ ン グ 検 査 に お い て 違 反 が 疑 わ れ る 分 析 結 果（ AAF）
報 告 を 可 能 と す る LOD は 、 尿 中 の Darbepoetin alfa 濃 度 と し て 5 pg/mL と 高 感 度 分
析 が 可 能 で あ っ た 。 ま た 、 現 行 の IEF−PAGE で は 分 析 に は 3 日 間 を 要 す る の に 対 し
て 、本 法 で の 尿 試 料 の 前 処 理 は 約 6 時 間 、1 試 料 あ た り の UPLC–MS/MS 分 析 所 要 時
間 は 10 分 と ハ イ ス ル ー プ ッ ト で あ り 、検 査 員 の 仕 事 量 も 劇 的 に 減 少 す る こ と が 可 能
と な っ た 。 本 法 は 、 Darbepoetin alfa に 特 化 し た 分 析 法 で あ る た め 、 rEPO を 網 羅 的
に 分 析 す る ス ク リ ー ニ ン グ 法 と し て は IEF−PAGE は 引 き 続 き 必 要 で あ る 。 し か し 、
IEF−PAGE に お い て Darbepoetin alfa が 疑 わ れ る 結 果 が 得 ら れ た 際 の 確 認 分 析 法 と し
て 有 用 と な る 。ま た 、分 析 対 象 ペ プ チ ド V 11 お よ び V 9 の 検 出 は 、競 走 馬 に お け る ド
ーピング検査にも適用が期待できる。さらに、数年後の日本および欧米諸国におけ
る Darbepoetin alfa の 特 許 期 間 満 了 以 降 に 、Darbepoetin alfa の 後 続 品 が 登 場 す る こ と
が 予 想 さ れ る 。2010 年 に は イ ン ド の 製 薬 企 業 Dr. Reddy’s Laboratories Ltd.
（ Hyderabad,
India）が 、世 界 初 の Darbepoetin alfa の 後 続 品（ Cresp ® ）の 製 造 販 売 を 開 始 し た 。こ
のようなバイオ企業において製造される糖タンパク質は、使用する細胞株が同一で
も細胞の培養条件や精製方法の違いにより、オリジナル先行品と完全に同一の糖鎖
構造を有する糖タンパク質を製造することは困難であることが知られている
105 )
。
そ の た め 、 Darbepoetin alfa の 後 続 品 も オ リ ジ ナ ル 製 品 と は 異 な る 糖 鎖 構 造 を 有 し 、
様 々 な IEF プ ロ フ ァ イ ル を 示 す こ と が 予 想 さ れ る 。本 章 に よ り 開 発 し た Darbepoetin
alfa の UPLC−MS/MS 法 で は 、消 化 断 片 ペ プ チ ド V 11 の ア ミ ノ 酸 配 列 を 基 に し て い る
た め 糖 鎖 構 造 の 違 い に 影 響 を 受 け な い 。故 に 、こ う し た Darbepoetin alfa の 後 続 品 が
登場した場合でも検出が可能であると考えられる。
以上により、本研究で開発した分析法は、ドーピング検査において、ヒト尿中の
Darbepoetin alfa を 質 量 分 析 に よ り 高 精 度 か つ 迅 速 に 検 出 可 能 と す る 革 新 的 な 手 法 で
あ る 。 著 者 は 、 他 の rEPO 製 剤 に つ い て 、 内 因 性 の EPO と 識 別 可 能 な 質 量 分 析 法 の
開発を今後の課題として研究を開始している。
89
総括
スポーツ基本法の基本理念は、
「 ス ポ ー ツ は 、こ れ を 通 じ て 幸 福 で 豊 か な 生 活 を 営
むことが人々の権利であることに鑑み、国民が生涯にわたりあらゆる機会とあらゆ
る場所において、自主的かつ自律的にその適性および健康状態に応じて行うことが
で き る よ う に す る こ と を 旨 と し て 、 推 進 さ れ な け れ ば な ら な い 。」 と 謳 わ れ て い る 。
スポーツの価値を守るためにも、アンチ・ドーピング活動はますます重要視され、
効果的なドーピング検査や新たな検査技術開発はますます期待されている。
本研究は、アンチ・ドーピング活動における競技者からの検体分析を有効的なも
のとするべく、現行の検査法の妥当性の検討とそこから見える新たな課題の解決を
まとめたものである。ドーピング検査においては、ホルモン製剤のように元来生体
内に存在する物質の使用を証明することが最も困難である。本研究では、3 つのホ
ルモン製剤に焦点を当てた。タンパク同化ステロイドホルモンに関しては第 1 章、
GH お よ び 成 長 促 進 因 子 に 関 し て は 第 2 章 、 そ し て 造 血 ホ ル モ ン で あ る EPO に 関 し
ては第 3 章に述べた。
第 1 章 で は 、 日 本 人 に お け る Testosterone 製 剤 の ド ー ピ ン グ 検 査 に お け る 妥 当 性
に つ い て 検 討 し た 。Testosterone ド ー ピ ン グ の 検 出 用 パ ラ メ ー タ ー で あ る T/E に は 人
種 差 が あ り 、 日 本 を 含 む 東 ア ジ ア 人 の T/E が 欧 米 人 の そ れ よ り も 低 い 傾 向 で あ る と
考 え ら れ て き た 。 本 研 究 で は 、 日 本 人 競 技 者 （ 男 性 255 名 お よ び 女 性 256 名 ） に お
け る Testosterone の グ ル ク ロ ン 酸 抱 合 に 関 与 す る 遺 伝 子 UGT2B17 の 遺 伝 子 多 型 に つ
い て 調 査 し た 。そ の 結 果 、日 本 人 競 技 者 の UGT2B17 遺 伝 子 の ホ モ 接 合 型 欠 失（ del/del
型 ） は 男 性 で 74.5%、 女 性 で 60.2%を 占 め 、 UGT2B17 ホ モ 接 合 型 挿 入 （ ins/ins 型 ）
は 男 性 で わ ず か 1.2%、 女 性 で 2.7%で あ り 、 欧 米 諸 国 と は 対 照 的 で あ る こ と を 明 ら
か と し た 。 さ ら に 、 こ れ ま で 実 施 例 の ほ と ん ど な か っ た 女 性 に 対 す る Testosterone
製 剤 使 用 後 の T/E を 含 む steroid profile の 変 化 に つ い て も 検 討 し た 。そ の 結 果 、ins/ins
お よ び del/ins 型 で は 、WADA 承 認 試 験 法 で あ る 世 界 統 一 基 準 に よ る T/E に よ る 判 定
法 は 有 効 で あ る も の の 、 del/del 型 で は ほ と ん ど 検 知 で き な い こ と を 明 ら か に し た 。
こ の 事 実 は 、日 本 を 含 む ア ジ ア 地 域 に お け る WADA 認 定 試 験 所 に 対 し て 警 鐘 を 鳴 ら
す こ と と な っ た 。 こ れ ま で T/E の 世 界 統 一 基 準 閾 値 （ T/E>4） を も と に Testosterone
ドーピングの検査が実施されてきたが、本研究によりその有効性には限界があるこ
と が 明 確 と な っ た 。 WADA の 集 計 に よ る と
5)
、 2012 年 の 違 反 が 疑 わ れ る 分 析 結 果
（ AAF） の 報 告 率 は 、 日 本 （ WADA Tokyo Laboratory） に お い て 0.16%で あ り 、 全
WADA 認 定 試 験 所 集 計 で の 1.19%と 比 較 し て 顕 著 に 低 い 。 こ の 傾 向 は 例 年 み ら れ る
傾向である。日本人競技者は、過去オリンピックで一人の陽性者も出さなかったよ
うに、薬物に対してクリーンであると考えられてきた。本研究の結果から、日本人
競 技 者 の 低 い 陽 性 率 は Testosterone ド ー ピ ン グ を 検 知 で き て い な い た め で あ る と 諸
外国からの指摘を受ける可能性もある。故に、日本としては早急に対処する必要性
90
が あ る 。本 研 究 の 結 果 は 、Testosterone の よ う な 内 因 性 ス テ ロ イ ド ホ ル モ ン の 異 同 識
別においては、単に基準値の見直しでは解決し得ないことを明らかにしただけでは
な く 、Testosterone ド ー ピ ン グ の 検 出 率 向 上 に 対 す る 確 か な 対 応 を 必 要 と し て い る こ
と を 示 し た 。ア ス リ ー ト 生 体 パ ス ポ ー ト（ ABP）の よ う に 個 人 の T/E や steroid profile
を追跡していくことでその変動を捉える手法は、日本をはじめとするアジア地域の
ア ン チ ・ ド ー ピ ン グ 機 関 に お い て は 重 要 で あ る 。 こ の 研 究 結 果 を 踏 ま え 、 2013 年 4
月 か ら 日 本 で は ア ス リ ー ト 生 体 パ ス ポ ー ト （ ABP） の 導 入 を 開 始 し て い る
106 )
。
第 2 章 で は 、現 行 の WADA 承 認 試 験 法 で あ る「 GH isoform differential immunoassay」
の 世 界 統 一 基 準 に よ る rhGH ド ー ピ ン グ 検 査 法 の 妥 当 性 に つ い て 検 討 し た 。rhGH お
よ び 成 長 促 進 因 子 GHRP-2 の 投 与 試 験 を 実 施 し 、WADA 承 認 試 験 法 の 妥 当 性 を 明 確
化 し 、さ ら に は 検 出 法 の 原 理 の 弱 点 を 明 ら か と し た 。 GHRP-2 の 使 用 は WADA 承 認
試 験 法 で は 検 出 で き な い ば か り か 、 rhGH と 併 用 使 用 し た 場 合 に は 、 rhGH ド ー ピ ン
グ の 検 出 を 隠 ぺ い す る 効 果 を 有 し て い る こ と も 明 ら か と し た 。そ こ で 、rhGH ド ー ピ
ン グ 検 出 法 の 弱 点 を 補 う た め に 、GHRP-2 を 直 接 的 に 分 析 す る 手 法 の 開 発 を 行 っ た 。
そ の 結 果 、 尿 試 料 中 か ら GHRP-2 代 謝 物 D-Ala-D-(β-naphthyl-)Ala-Ala-OH（ AA-3）
を 見 出 し 、 そ れ を UPLC−MS/MS に よ り 分 析 す る こ と で GHRP-2 ド ー ピ ン グ の 検 出
を 直 接 的 に 可 能 と し た 。 本 章 で 同 定 し た 代 謝 物 AA-3 は 、 そ の 後 、 ド イ ツ の WADA
認 定 試 験 所 で の 追 試 に お い て 、 イ ン タ ー ネ ッ ト 上 で 流 通 し て い る GHRP-2 含 有 サ プ
リ メ ン ト Hemogex TM の 経 口 服 用 後 の 尿 中 か ら AA-3 が 高 感 度 に 検 出 さ れ る こ と が 実
証された
107 )
。 現 在 、 WADA 認 定 試 験 所 で GHRP-2 ド ー ピ ン グ 検 出 の 対 象 物 質 と し
て検査が実施されるに至っている。
第 3 章 で は 、 rEPO の 一 つ Darbepoetin alfa の 質 量 分 析 法 の 開 発 を 行 っ た 。
Darbepoetin alfa は ヒ ト の EPO の 5 箇 所 の ア ミ ノ 酸 残 基 を 変 更 し 、シ ア ル 酸 含 量 を 高
め て 血 中 半 減 期 を 延 長 さ せ た 165 個 の ア ミ ノ 酸 残 基 か ら な る 分 子 量 約 35-kDa の 糖 タ
ンパク質である。インタクトで質量分析により測定することは感度面で困難であっ
た が 、Bottom-up 法 に よ り ヒ ト 尿 試 料 中 の Darbepoetin alfa の 質 量 分 析 法 を 開 発 し た 。
測 定 原 理 は 、尿 試 料 を 抗 EPO モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 に よ る イ ム ノ ア フ ィ ニ テ ィ ー に よ
り 精 製 し 、 NH 4 HCO 3 buffer（ pH 7.8） 中 で V8-プ ロ テ ア ー ゼ に よ る 消 化 （ 25 °C, 3 時
間 ） 後 、 得 ら れ た Darbepoetin alfa に 特 異 的 な ペ プ チ ド V 11
（ 90 TLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKE 11 7 ）を UPLC−MS/MS に よ り 測 定 す る も
の で あ る 。Darbepoetin alfa 投 与 後 に 採 取 さ れ た 尿 試 料 か ら 極 微 量（ LOD：1.2 pg/mL）
の Darbepoetin alfa を 検 出 可 能 と し て い る 。 本 法 は 、 現 行 の WADA 承 認 試 験 法 で あ
る IEF−PAGE が 分 析 に 3 日 を 要 す る の に 対 し 、 わ ず か 半 日 で の 高 感 度 か つ 迅 速 分 析
を可能とした同定の信頼性が高い質量分析法である。本法は、糖鎖構造の違いに依
存 し な い た め 、特 許 切 れ 以 降 に 上 市 さ れ る こ と が 予 想 さ れ る Darbepoetin alfa の 後 続
品 に も 適 用 可 能 と 考 え ら れ る 。ま た 、ペ プ チ ド V 11 の ア ミ ノ 酸 配 列 は 、馬 の EPO と
の 相 同 性 が 無 い た め 、競 走 馬 に お け る Darbepoetin alfa の ド ー ピ ン グ 検 査 に も 適 用 可
91
能 で あ る と 考 え ら れ る 。 医 薬 品 開 発 に お け る rEPO 製 剤 の 体 内 動 態 試 験 で は 、 内 因
性 EPO も 同 時 に 測 り こ む イ ム ノ ア ッ セ イ が 用 い ら れ て き た 。本 法 を 最 適 化 す る こ と
で 、 定 量 分 析 も 可 能 と 考 え ら れ る 。 Darbepoetin alfa の 体 内 動 態 を 正 確 に 調 査 す る こ
とが可能となることが期待できる。
2013 年 9 月 7 日 、2020 年 東 京 で の オ リ ン ピ ッ ク 開 催 が 決 定 し た 。オ リ ン ピ ッ ク 成
功 の 一 つ に は 、ド ー ピ ン グ の な い 大 会 で あ る こ と が 挙 げ ら れ る 。2012 年 の ロ ン ド ン
大 会 で は 、 参 加 競 技 者 の 30%以 上 で ド ー ピ ン グ 検 査 が 実 施 さ れ た 。 尿 試 料 と 血 液 試
料 あ わ せ て 過 去 最 高 の 5132 検 体 が 分 析 さ れ 、8 件 の 違 反 が 疑 わ れ る 分 析 結 果（ AAF）
が報告された
1 08 )
。これまでで最も陽性事例の少ないクリーンな大会となり、近年
のアンチ・ドーピング活動の成果と云える。一方で、ロンドン大会前に全世界で
71649 検 体 の 競 技 会 外 検 査 が 実 施 さ れ 、107 件 の ド ー ピ ン グ 違 反 を 摘 発 し て 、ロ ン ド
ン五輪本大会への出場を阻止した事実もある
1 09 )
。さらに、競技スポーツにおける
ド ー ピ ン グ 陽 性 事 例 数 は 、2012 年 は WADA の 統 計 に よ る と 年 間 5000 件 を 超 え て い
るのが実態である
5)
。加えて、様々な種類の薬物によるドーピングの拡大も懸念さ
れている。検査のすり抜けを意図する不法な合成薬物、デザイナードラッグや未承
認の新規薬物の使用なども危惧されている。創薬の分野では、持続的な薬効を示す
ポリエチレングリコール結合タンパク製剤などが、新たな新薬候補として開発が見
込まれている。こうした背景の中、ドーピング検査法の開発はますます重要性を増
していくであろう。
最後に、著者は本研究成果が健全なスポーツの脅威であるドーピングの撲滅に寄
与し、競技者のみならず青少年への健康被害を防止することを願うものである。ま
た、新たな分析技術の開発、分析精度の向上および分析の効率化を達成することで
アンチ・ドーピングを推進し、スポーツの価値を守る所存である。
92
謝辞
本論文をまとめるにあたり、終始ご懇篤なるご指導とご鞭撻を賜りました東京薬
科大学薬学部薬物生体分析学教室教授 渋沢庸一博士ならびに東京薬科大学薬学部
薬 学 教 育 推 進 セ ン タ ー 教 授 篠 原 佳 彦 博 士 に 心 よ り 感 謝 申 し 上 げ ま す 。ま た 、暖 か い
激励とご助言を賜りました東京薬科大学薬学部病態生理学教室講師 長谷川弘博士
に深謝いたします。
試料採取にご協力いただきましたボランティアならびに関係者の皆様に心より感
謝申し上げます。
本 研 究 の 遂 行 に あ た り 、多 大 な ご 協 力 を 賜 り ま し た 株 式 会 社 LSI メ デ ィ エ ン ス（ 旧
社名
三 菱 化 学 メ デ ィ エ ン ス 株 式 会 社 ） 陰 山 信 二 氏 、池 北 紋 子 氏 、佐 藤 充 彦 氏 な ら
びに職員の皆様に深謝いたします。
なお、本研究は、文部科学省ならびにスポーツ振興くじ助成による研究助成、資金
負担により実施されたものです。ここに記して感謝の意を表します。
93
研究結果の掲載誌
第 1章
M. Okano, T. Ueda, Y. Nishitani, H. Kano, A. Ikekita, S. Kageyama.
UDP-glucuronosyltransferase 2B17 genotyping in Japanese athletes and evaluation of the
current sports drug testing for detecting testosterone misuse. Drug Test. Anal. 2013, 5,
166–181.
第 2章
M. Okano, Y. Nishitani, M. Sato, A. Ikekita, S. Kageyama. Influence of intravenous
administration of growth hormone releasing peptide-2 (GHRP-2) on detection of growth
hormone doping: growth hormone isoform profiles in Japanese male subjects. Drug Test.
Anal. 2010, 2, 548–556.
M. Okano, M. Sato, A. Ikekita, S. Kageyama. Determination of growth hormone
secretagogue pralmorelin (GHRP-2) and its metabolite in human urine by liquid
chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry. Rapid Commun. Mass
Spectrom. 2010, 24, 2046–2056.
第 3章
M. Okano, M. Sato, S. Kageyama. Identification of the long-acting
erythropoiesis-stimulating agent darbepoetin alfa in human urine by liquid
chromatography-tandem mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 2014, 406, 1317–1329.
94
引用文献
1)
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