Hirosaki University Repository for Academic Resources Title Author(s) Citation Issue Date URL Attenuation of collagen-induced arthritis in mice by salmon proteoglycan Yoshimura, Sayuri BioMed Research International, 2014, 2014, ID 406453 2014-05 http://hdl.handle.net/10129/5478 Rights Text version ETD http://repository.ul.hirosaki-u.ac.jp/dspace/ 医共様式１ 学位請求論文の内容の要旨 論文提出者氏名 病態制御科学領域 感染生体防御学教育研究分野 氏名 吉村 小百合 （論文題目） Attenuation of collagen-induced arthritis in mice by salmon proteoglycan （サケ・プロテオグリカンによるコラーゲン誘導関節炎の抑制） （内容の要旨） 【 目 的 】 プ ロ テ オ グ リ カ ン は 、コ ア タ ン パ ク 質 に グ リ コ サ ミ ノ グ リ カ ン が 共 有 結 合 し た 糖 タ ン パ ク 質 で あ り 、軟 骨 や 皮 膚 な ど の 結 合 組 織 を 構 成 す る 物 質 の 一 つ で あ る 。当 該 研 究 室 で は 、サ ケ 鼻 軟 骨 プ ロ テ オ グ リ カ ン フ ラ ク シ ョ ン（ PGF）が 過 剰 な 炎 症 を 抑 制 す る 作 用 を 報 告 し て き た 。 た と え ば 、 マ ウ ス に PGF を 連 日 経 口 投 与 す る と 、 潰 瘍 性 大 腸 炎 モ デ ル に お い て 、 腸 炎 の 発 症 や 増 悪 が 抑 制 さ れ る 。 そ の メ カ ニ ズ ム と し て TH17 (T-helper 17)細 胞 や TH1 細 胞 へ の 分 化 抑 制 と 制 御 性 T 細 胞 の 増 加 に よ り 炎 症 を 抑 制 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。関 節 リ ウ マ チ（ rheumatoid arthritis：RA）は TH17 型 の 炎 症 反 応 を 示 し 、破 骨 細 胞 、滑 膜 線 維 芽 細 胞 が 活 性 化 し 、骨 破 壊 が 繰 り 返 さ れ 、骨 が 変 形 す る 重 要 な 自 己 免 疫 疾 患 で あ る 。 そ こ で 、 本 研 究 で は 、 RA の モ デ ル マ ウ ス を 用 い て 、 PGF の関節炎に対する抑制効果とそのメカニズムを解析 した。 【 方 法 】 DBA/1J マ ウ ス を II 型 コ ラ ー ゲ ン （ Type II collagen:CII） と 完 全 フ ロ イ ン ド ア ジ ュ バ ン ト で 皮 下 免 疫 す る こ と に よ り 、コ ラ ー ゲ ン 誘 導 関 節 炎（ collagen-induced arthritis : CIA） マ ウ ス モ デ ル を 作 製 し た 。 CII 免 疫 マ ウ ス に リ ン 酸 緩 衝 生 理 食 塩 水 （ phosphate buffered saline：PBS）に 溶 解 し た サ ケ 鼻 軟 骨 PGF 2 mg を 連 日 経 口 投 与 し た （ PGF 投 与 群 ）。 ま た 、 比 較 対 照 と し て CII 免 疫 マ ウ ス に PBS の み を 連 日 経 口 投 与 し た （ PBS 投 与 群 ）。 PGF 投 与 群 及 び PBS 投 与 群 に 対 し て 四 肢 関 節 の 発 赤 、 腫 脹 な ど の 臨 床 症 状 を ス コ ア に よ り 評 価 し た 。 ま た 、 HE（ Hematoxylin and Eosin） 染 色 に よ る 関 節 組 織 の 組 織 学 的 評 価 を 行 な っ た 。さ ら に 、関 節 組 織 の 薄 切 切 片 を 用 い て 、好 中 球 及 び マ ク ロ フ ァ ー ジ に 対 す る 抗 体 を 用 い た 免 疫 染 色 、 破 骨 細 胞 に 対 し て TRAP （ tartrate-resistant acid phosphatase） 染 色 を 行 っ た 。 関 節 に お け る 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン IFN（ interferon）-、IL（ interleukin）-6、IL-1、IL-17A 及 び ケ モ カ イ ン CCL （ C-C chemokine ligand）2、CXCL（ C-X-C chemokine ligand）1、CXCL2 の 発 現 は 、 定 量 的 逆 転 写 酵 素 ポ リ メ ラ ー ゼ 連 鎖 反 応 法 （ quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction：RT-PCR）を 用 い て 比 較 し た 。免 疫 応 答 に よ る 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン 産 生 量 を 調 べ る た め に マ ウ ス 脾 細 胞 を CII で 再 刺 激 し 、 上 清 中 の IFN- 、 IL-17A を ELISA（ enzyme-linked immunosorbent assay）法 に よ り 定 量 し た 。血 清 中 の CII 特 異 IgG1 及 び IgG2a 抗 体 は 、 ELISA 法 に よ り 測 定 し た 。 【 結 果 】 CII 免 疫 後 26 日 目 頃 か ら CIA を 発 症 し た 。PGF 投 与 群 は PBS 投 与 群 に 比 べ 四 肢 関 節 の 臨 床 症 状 が 緩 和 さ れ 、 ス コ ア に よ る 評 価 に お い て 45 日 目 以 降 に 有 意 差 が 得 ら れ た 。 ま た 、 発 症 率 は 49 日 目 以 降 に 有 意 差 が 得 ら れ た 。 関 節 組 織 の HE 染 色 か ら 、 PGF 投 与 群 で は 滑 膜 に お け る 炎 症 は 悪 化 せ ず 、 PBS 投 与 群 で は 炎 症 細 胞 浸 潤 及 び 滑 膜 増 生 が み ら れ 、炎 症 の 悪 化 が 観 察 さ れ た 。関 節 組 織 内 で は 、好 中 球 及 び マ ク ロ フ ァ ー ジ の 浸 潤 が 低 下 し 、骨 組 織 で の 破 骨 細 胞 の 蓄 積 が 抑 制 さ れ た 。関 節 に お け る サ イ ト カ イ ン 及 び ケ モ カ イ ン の mRNA 発 現 は 、 IL-6、 IL-1、 IL-17A、 CCL2、 CXCL1、 CXCL2 に 対 し て 、 PGF 投 与 群 が PBS 投 与 群 に 比 べ 低 値 を 示 し た 。 CII で 再 刺 激 し た CII 免 疫 マ ウ ス の 脾 細 胞 に お け る 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン 産 生 量 は 、 PGF 投 与 群 が IFN-及 び IL-17A で 低 値 を 示 し た 。 CII 特 異 的 抗 体 の 産 生 量 は 、 PBS 投 与 群 と PGF 投 与 群 で 差 は み ら れ なかった。 【 考 察 】 慢 性 の 関 節 炎 は 、 RA 及 び CIA 共 通 の 特 徴 で あ る 。 RA の 滑 膜 炎 で は 、 炎 症 性 細 胞 の 浸 潤 と ケ モ カ イ ン 産 生 が 特 徴 と し て み ら れ る 。CIA に お い て は 、単 球 の 遊 走 は CCL2 が 担 い 、 マ ク ロ フ ァ ー ジ か ら の CXCL1 及 び CXCL2 は 好 中 球 の 走 化 性 因 子 で あ る こ と が 報 告 さ れ て い る 。ま た 、滑 膜 炎 中 の TH17 細 胞 や マ ク ロ フ ァ ー ジ は 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン を 介 し て 破 骨 細 胞 を 活 性 化 す る 。 さ ら に 、 IL-17A は 関 節 に お い て マ ク ロ フ ァ ー ジ を 活 性 化 し 、 マ ク ロ フ ァ ー ジ に よ っ て 産 生 さ れ る IL-1や IL-6 が 破 骨 細 胞 形 成 を 誘 導 す る こ と 知 ら れ て い る 。 こ れ ら の 結 果 か ら 、 PGF は ケ モ カ イ ン 及 び 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン を 抑 制 す る こ と に よ り 炎 症 性 細 胞 浸 潤 を 抑 制 し 、CIA 発 症 と 進 行 を 緩 和 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。 一 方 、 PGF の 効 果 は 抗 体 非 依 存 性 で あ っ た 。 本 研 究 に お い て 、 PGF の 経 口 摂 取 が RA に 対 し て 有 効 性 を 示 す 可 能 性 が 考 え ら れ た 。
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