KURENAI : Kyoto University Research Information Repository Title Author(s) Citation Issue Date URL Compensated endocytosis of LDL by hamster cells coexpressing the two distinct mutant LDL receptors defective in endocytosis and ligand binding( Abstract_要旨 ) Yoshida, Hiroyuki Kyoto University (京都大学) 1999-03-23 http://hdl.handle.net/2433/181746 Right Type Textversion Thesis or Dissertation none Kyoto University 氏 名 島 岩 士 違 学 位 (専 攻 分 野 ) 博 学 位 記 番 号 医 博 学 位 授 与 の 目付 平 成 11年 3 月 23 日 学位 授 与 の要件 学 位 規 則 第 4条 第 1項 該 当 研 究 科 ･専 攻 医 学 研 究 科 内 科 系 専 攻 学 位 論 文題 目 Compe ns a t e de ndoc yt os i sofLDLbyha ms t e rc e l l sc oe x pr e s s l ngt het wodi s - 第 ( 医 芝 学) 21 3 2 号 t i nc tmut a ntLDLr e c e pt or sde f e c t i v ei ne ndoc yt os i sa ndl i g a ndbi ndi ng ( エ ン ドサ イ トー シス欠 損 及 び リガ ン ド結 合 とい う異 な る二種 類 の変 異 型 低 比 重 リポ蛋 白受 容 体 を ともに発 現 したハ ムス ター 細 胞 にお い て は 低 比 重 リポ蛋 白のエ ン ドサ イ トー シス の補 填 的 な改 善 が認 め られ る) ( 主査) 論 文 調 査 委 員 教 授 中 尾 - 和 論 文 内 教 授 西 川 伸 一 容 の 要 教 授 北 徹 旨 動脈硬化症 の最大の リス クファクターであるコ レステ ロール は,主に低比重 リポ蛋 白 ( 以下LDL)粒子 に含 まれ て血液 中を運搬 されてい る｡ LDLはLDL受容体 によ り血 中か ら主に肝臓 に取 り込 まれ ,LDL受容体 は血 中 コレステ ロール値 を制 以下FH)は,著明 御す る上で最 も主要な分子 である｡ LDL受容体 の変異 による疾患 である家族性高 コ レステ ロール血症 ( な高 コ レステ ロール血症 をきたす疾患 として最 も高頻度で, 日本 人の心筋梗塞患者 の内の十数パーセ ン トがFHを基 に発症 す ると考 え られ てい る｡従来の研究か ら,細胞表面においてLDL受容体は多量体 として存在す る可能性 が示唆 されてい る｡ 多量体が形成 され るのであれ ば,FHにおいては異なるLDL受容体分子間に-テ ロ多量体が形成 され る可能性 が考 え られ る が,その病態 に及 ぼす影響 はいまだ不 明である｡ 異 なるLDL受容 体分子間に多量体 が形成 され ることを示 し,それ がLDL の取 り込みに及 ぼす影響 を検討す ることが本論文の 目的である｡ LDL受容体欠損細胞株 l dl A7に二種類 の変異 ヒ トLDL受容体遺伝子 を リン酸カル シウム法で導入 して永久発現株 を作成 し 0 7ア ミノ酸がチ ロシンか らシステイ ンに置 き換わ りエ ン ドサイ トーシスが障害 されている ( 以下Y8 0 7 C た｡ 一方 の変異 は第8 受容体)｡他方 の変異 は第 1 8 9ア ミノ酸 がイ ソロイ シンか らアスパ ラギン酸 に置 き換 わ りLDLの結合 が障害 されてお り, さ らにY8 07 C受容体 と異なる抗体で区別す る 目的で受容体機能 に影響 のない部位 をラ ッ ト配列 に置 き換 えたキメラである ( 以 1 8 9 Dh/ r 受容体)0 LDLのエ ン ドサイ トー シス効率 は,1 2 5 Ⅰ 標 識 したLDLのl nt e r na l i z at i o nl nde x( Ⅰ . Ⅰ ∴ 分解 +取 り込 下1 み/表面結合) で評価 した｡蛍光免疫組織法で二種類 のLDL受容 体 を二重染色 し,蛍光お よび共焦点顕微鏡 でその細胞 内 と表面にお ける分布 を検討 した｡ 1 8 9 Dh/ r 受容体 は野生型受容体 と同様 に細胞 内の核周辺 に集 中 していたが,Y8 0 7 C受容体は細胞表 単独 で発現 した時,1 07 C受容体がⅠ 1 8 9 Dhノ r 受容体 とともに発現 した時,細胞表 面 にび漫性 に散在 し核周辺 には見 られ なかった｡ 一方, このY8 面のび漫性 の分布 とともに核周辺の強い集 中が見 られた｡ これ を共焦点顕微鏡 で観 察 した ところ,核周辺 において二つの変 . Ⅰ . を1 0 0% とした とき,Y8 0 7 C受容体 のみ を発 現 した細胞株 のⅠ. Ⅰ . は3 1 % 異受容体 の局在 は一致 していた｡ 野生型受容体 のⅠ であった｡ 二つの変異受容体 を ともに発現 した細胞株 のⅠ . Ⅰ . は平均 5 5 %であ り,1 1 8 9 Dh/ r 受容体 の発現 レベルが同程度 な ら 0 7 C受容体 の発現 レベル が低 い細胞株 ほ どⅠ. Ⅰ . が高い傾 向が見 られた｡ ニつの変異受容体 を ともに発現 した細胞株 にお ばY8 0 7 C受容体の発現 レベル に正比例 し,Ⅰ 1 8 9 Dhノ r 受容体の発現 レベル とは無 関係 であった｡ いてLDLの結合量はY8 Y8 0 7 C受容体 は1 1 8 9 Dh/ r 受容体 と共 に発現 した時エ ン ドサイ トーシスが改善 され る｡ この際LDLのエ ン ドサイ トーシス 07 C受容体のエ ン ドサイ トーシスの増加 に伴 うも も改善 され るが, これ はLDLの受容体-の結合親和性 の変化 によ らず,Y8 1 8 9 Dh/ r 受容体 とY8 0 7 C受容体の発現 レベル比 とⅠ . Ⅰ . との関係 は,Y8 07 C受容 体のエ ン ドサイ トー シスの の と考 え られた｡ Ⅰ -6 2 2- 改善の機序 が-テ ロ多量体形成 に よる可能性 を示唆す る と考 え られ た｡従来 のL DL受容体 の研 究 は単一 の変異受容体 を細 DL受容体分子 が共存 した場合 に起 こ りうる現象 については見過 ご 胞やマ ウスに導入す るものがほ とん どであ り,異 な るL H-テ ロ接合体お よび複合型-テ ロ接合体患者 の遺伝子診 断 を行 うにあた り,異 な るLDL受容体分子 間の相 されてきた｡ F 互作用について考慮す る必要がある と考 え られた｡ 論 文 審 査 の 結 果 の 要 旨 DL)受容体 の変異 による疾患,家族性高 コ レステ ロール血症 において,異 な るLDL受容体分子 低比重 リポ蛋 白 ( 以下L DL受容体欠損細胞株 に二種類 の変 間に-テ ロ多量体 が形成 され る可能性 があるがその病態 に及 ぼす影響 は不 明で ある｡ L DL受容体遺伝子 を導入 して永久発現株 を作成 した｡一方の変異 ( 以下Y8 0 7 C受容体)はエ ン ドサイ トー シスが障害 異 ヒ トL されてい る｡他方 の変異 ( 以下1 1 8 9 Dh / r 受容体) はL DLを結合 できず,一部 をラ ッ ト配列 に置 き換 えたキメラ分子 である｡ LDLのエ ン ドサイ トー シス効率 は, 125Ⅰ標識 したLDLのⅠ n t e r na l i z a t i o nf nd e x( Ⅰ . Ⅰ .:分解 +取 り込み/表 面結合) で評価 0 7 C受容体 は細胞表面 にび漫 した｡蛍光免疫組織法で二種類 の変異受容体 を二重染色 し分布 を検討 した｡ 単独 で発現 したY8 性 に散在 し細胞 内には見 られず,Ⅰ . Ⅰ . は野性型受容体 の31 %で あった｡ このY8 0 7 C受容 体がⅠ 1 8 9 Dh / r 受容体 とともに発現 し DLの結合量 はY8 0 7 C受容体 の発現 レベル に正比例 し,Ⅰエの改善 た時,細胞 内-分布 が移行 し,Ⅰ . Ⅰ . は平均 55% であった｡ L はL DLと受容体 との親和性 に関係 な く,Y8 0 7 Cの受容体のエ ン ドサイ トー シスの増加 に よる と考 え られ た0 I 1 8 9 Dh / r 受容 0 7 C受容体 の発現 レベル が低 い細胞株 ほ どⅠ . Ⅰ . が高 く,改善の機序 が-テ ロ多量体形成 に 体の発現 レベル が同程度 な らばY8 よる可能性 が示唆 された｡ 以上の研 究は単一の変異分子 を用いた従来の研究では見過 ごされてきた分子 間相互作用が病態 に影響 を与 え得 るこ とを示 し,今後診断す る際に意義 をもつ と思われ る｡ したがって,本論文 は博士 ( 医学)の学位論文 として価値 あるもの と認 める｡ なお,本学位授与 申請者 は,平成 11 年 3月 1日実施 の論文内容 とそれ に関連 した試 問を受 け,合格 と認 め られ た ものであ る｡ -6 23-
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