免疫組織染色 Immunohistochemistry : IHC 単一組織サンプルの複数抗原を効果的に検出する優れた MultiView™ IHC キット マルチプレックス IHC 検出キット ● 複数の抗原検出に優れたビオチンフリーのナノポリマーベースシステム ● 高感度で鮮明な 2 色発色用の HighDefTM 完全キット ● 試薬や人件費を減少させるほか、貴重な組織を保存 ● 追加色素と合わせても使用可能（3 ページ） 構成内容 構成品 MultiViewTM (mouse-HRP/rabbit-AP) IHC kit 品番 ADI-950-100-0001 MultiViewTM (mouse-HRP/mouse-AP) IHC kit 品番 ADI-950-101-0001 ペルオキシダーゼブロッカー ○ ○ PolyView™ IHC 試薬 (mouse-HRP) ○ ○ PolyView™ IHC 試薬 (rabbit-AP) ○ - PolyView™ IHC 試薬 (mouse-AP) - ○ HighDef™ IHC (DAB, stable) 色素 & バッファー ○ ○ HighDef™ red IHC 色素 (AP) & バッファー ○ ○ - ○ ○ ○ 抗体除去バッファー ミキシングボトル ホルマリン固定パラフィン包埋したヒト扁桃腺について、MultiView (mouse-HRP/rabbit-AP) IHC kit ( 品番 ADI-950-100) を使った二重染色。 ウサギ抗 Ki67 抗体 /HighDef red IHC chromogen (AP) ( 品番 ADI-950-140)、 マ ウ ス 抗 HMW CK 抗 体 /HighDef yellow IHC chromogen (HRP) ( 品 番 ADI-950-170、sold separately)。これら組み合わせにより鮮赤色と対比 をなす黄橙色。 Enzo Life Sciences, Inc. メーカー略号：ENZ 品名 品番 包装 MultiViewTM (mouse-HRP/rabbit-AP) IHC kit ADI-950-100-0001 100 test ¥57,000 MultiView ADI-950-101-0001 100 test ¥52,000 TM (mouse-HRP/mouse-AP) IHC kit 希望販売価格 MultiViewTM Q & A Q1 : MultiViewTM キットを使うとき、一次抗体と検出試薬の交差反応はどうやって防ぐことができますか？ A1 : MultiViewTM (mouse-HRP/mouse-AP) IHC キットについて、抗体、検出及び色素の各ステップでの十分な洗浄 ( 洗浄バッファーで 1 分 ×3 回 ) が余分な抗体、検出試薬、色素を除去します。抗体除去はそのため必要ありません。 また一次レイヤー ( 初めの染色 ) の色素がブロッキング色素として働き、その後に続く反応から初めの染色を保護してくれます。 DAB はよい保護色素で、初めの染色の色素が DAB の場合は、抗体除去バッファーをスキップすることができます。 Q2 : MultiViewTM IHC キットを使って多重染色を行う予定ですが、ターゲットが同じ場所にある場合、どうしたらよいでしょうか？ A2 : IHC では、正確に実験をデザインすることが大切です。理想的な状況は、他の標識マーカーの干渉を受けずに、組織中のユニークなタンパ ク質、抗原を標識するということです。核、細胞質、あるいは膜に存在し、オーバーラップしない異なるマーカーを選ぶとよいでしょう。 初めに DAB 色素を使用し、次に赤色素をお薦めします。もし両抗体が同じサイト ( 例えば、両抗体が細胞質膜に存在するターゲットを認 識する ) に対してのものであるなら、互いに影響している染色を観察するでしょう。結果を予測することはできませんが、可能性として、 非常に強い発色が観察できるかもしれません。しかしながら一次抗体の特異性にも依存します。もし抗体がとても特異性が高く、エピトー プ結合部位においてオーバーラップしないのであれば明確な色素染色が観察できるでしょう。 Q3 : 品番 ADI-950-101 Multi ViewTM (mouse-HRP/mouse-AP) IHC キットの抗体除去バッファーの役割は何ですか？ A3 : 抗体除去バッファーは多機能なバッファーで、一次 / 二次抗体の除去、AP 酵素や HRP 酵素の不活性化を行います。 多重染色では、最初の染色時に使用した一次抗体や関連酵素が 2 番目の染色時に使用する関連試薬に影響を及ぼす可能性があります。 この抗体除去バッファーを使うことでそれらを防ぐことができます。 Q4 : どのようなサンプルが MultiViewTM IHC キットに適していますか？ A4 : 凍結切片、ホルマリン固定パラフィン包埋切片どちらでも使用可能です。 Q5 : MultiViewTM IHC キットで提供されるペルオキシダーゼブロッカー溶液は IHC 組織プライマー (ADI-950-234) と同じですか？ A5 : ペルオキシダーゼブロッカー溶液は IHC 組織プライマーと機能は同じですが組成が異なります。 IHC 組織プライマーは西洋わさびペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼベースの IHC 染色に使用する ユニバーサル酵素ブロッキング試薬です。一方ペルオキシダーゼブロッカー溶液は内在性ペルオキシダーゼ活性に特化した試薬です。 ① HighDef™ 色素と一緒に使用する超高感度、超低バックグラウンドの PolyView™ ナノポリマー検出試薬 ナノポリマー検出試薬 ● 細胞内ビオチンバックグラウンドを回避するビオチンフリーナノポリマー検出 ● シャープで鮮明な染色をもたらす高明度の発色現像 ● お好みの HighDef™ (3 ページ ) 色素と合わせてカスタマイズもできます。 構成内容 PolyViewTM IHC 試薬 (mouse on mouse-HRP) キット ● IHC 組織プライマー ● ブロッキング試薬 ● Anti-Mouse HRP ポリマー ● DAB バッファー ● DAB 色素 ● DAB 用のミキシングボトル その他 PolyViewTM IHC 試薬キット ● Anti-HRP もしくは AP ポリマー ホルマリン固定パラフィン包埋ヒト扁桃腺の二重染色 茶：CK5/14 マウス抗体 (PolyView™ IHC reagent (mouse-HRP) ( 品番 ADI-950-112） 、HighDef™ IHC substrate (DAB, stable) （品番 ADI-950-212） ） 青：CD8 マウス抗体（PolyView™ IHC reagent (mouse-AP) ( 品番 ADI-950-110） 、HighDef™ blue IHC chromogen (AP) （品番 ADI-950-150）） Enzo Life Sciences, Inc. メーカー略号：ENZ 品名 品番 PolyViewTM (mouse on mouse) IHC kit 包装 希望販売価格 ADI-950-114-0025 25 test ¥36,000 ADI-950-114-0100 100 test ¥144,000 PolyViewTM IHC reagent (mouse-AP) ADI-950-110-0100 100 test ¥41,000 PolyViewTM IHC reagent (rabbit-AP) ADI-950-111-0100 100 test ¥45,000 PolyViewTM IHC reagent (mouse-HRP) ADI-950-112-0100 100 test ¥39,000 PolyViewTM IHC reagent (mouse/rabbit-HRP) ADI-950-113-0100 100 test ¥43,000 PolyViewTM IHC reagent (rabbit-HRP) ADI-950-115-0025 25 test ¥21,000 ADI-950-115-0100 100 test ¥45,000 高感度、低バックグラウンドの SAView™ IHC 検出キット ストレプトアビジン IHC 検出キット ● Ready-to-use 試薬 ● カスタム多重 IHC プロトコールに最適 ● ABC に対して糖およびビオチンバックグラウンドを 軽減したストレプトアビジンベース検出 ● ABC 検出法よりも 5 ∼ 10 倍以上の感度 構成内容 ペルオキシダーゼ試薬 アルカリホスファターゼエンハンサー リンカー試薬 ( 標識 Ig 抗体 ) トレーサー試薬 ( ストレプトアビジン HRP 試薬 ) AEC 基質 & バッファー 3% 過酸化水素 DAB 基質 & バッファー HighDef™ red IHC 色素 (AP) & バッファー ミキシングバイアル ミキシングボトル mouse/rabbit-AP ADI-950-120-0100 ○ ○ ○ ○ ○ mouse/rabbit-HRP, AEC ADI-950-121-0100 ○ ○ ○ ○ ○ - mouse/rabbit-HRP, DAB ADI-950-122-0100 ○ ○ ○ ○ ○ - mouse-HRP, AEC ADI-950-123-0100 ○ ○ ○ ○ ○ - rabbit-HRP, AEC ADI-950-124-0100 ○ ○ ○ ○ ○ - Enzo Life Sciences, Inc. メーカー略号：ENZ 品名 SAView TM (mouse/rabbit-AP) IHC kit 品番 包装 希望販売価格 ADI-950-120-0100 100 test ¥32,000 SAViewTM(mouse/rabbit-HRP, AEC) IHC kit ADI-950-121-0100 100 test ¥32,000 SAView TM (mouse/rabbit-HRP, DAB) IHC kit ADI-950-122-0100 100 test ¥32,000 SAViewTM (mouse-HRP, AEC) IHC kit ADI-950-123-0100 100 test ¥32,000 SAView ADI-950-124-0100 100 test ¥32,000 TM (rabbit-HRP, AEC) IHC kit SAViewTM 検出技術は従来の ABC 検出方法よりも優れているのはなぜですか？ ビオチンとストレプトアビジン間の非共有結合の高親和性 (Kd 4x10-14M) が SAViewTM 染色キットの基礎になっています。 ストレプトアビジンはビオチン 4 分子に結合する 4 量体です。アビジン (ABC システムで使用されている ) は生理的 pH ではプラスに荷電して いるのに対し、ストレプトアビジンの等電点は中和 pH に近く、優れた結果をもたらします。さらに、ストレプトアビジンは糖鎖を持たないの でアビジン ( アビジンは糖 70% から成っています ) よりも非特異的結合がより少ないという利点があります。 ② マルチプレックス IHC プロトコールに最高のフレキシビリティを与える広範囲な色幅パレット HighDefTM 色素 ● 色選択の幅広いパネル ● ユニークな黄、黒、青の HRP 色素 ● HRP & AP オプションに向上したフレキシビリティ ● 高鮮明な色素発色 ホルマリン固定パラフィン包埋したヒト扁桃腺について、 希 釈 済 み マ ウ ス CD68 抗 体 /HighDef IHC chromogen substrate (DAB, HC) ( 品番 ADI-950-211、茶色 )、希釈済み ウサギλ鎖抗体 /HighDef blue IHC chromogen (AP) ( 品番 ADI-950-150、青色 )、希釈済みウサギκ鎖抗体 /HighDef red IHC chromogen (AP plus) ( 品番 ADI-950-141、赤色 )、 高 分 子 量 サ イ ト ケ ラ チ ン 抗 体 /HighDef yellow IHC chromogen (HRP) ( 品番 ADI-950-170、黄色 ) で染色し、 そしてメチルグリーンでの対比染色を行った。 HighDefTM DAB (Brown) HRP HighDefTM Yellow HRP HighDefTM AEC (Red) HRP HighDefTM Red AP HighDefTM Blue HRP HighDefTM Blue AP HighDefTM Green AP HighDefTM Black HRP HighDefTM Hematoxylin HighDefTM Red HRP Enzo Life Sciences, Inc. メーカー略号：ENZ 品名 品番 包装 希望販売価格 ADI-950-211-0200 200 mL ¥35,000 HighDefTM IHC chromogen substrate (DAB, stable) ADI-950-212-0200 200 mL ¥35,000 HighDef TM IHC chromogen substrate (DAB, HC) yellow IHC chromogen (HRP) ADI-950-170-0030 30 mL ¥28,000 HighDefTM IHC chromogen substrate (AEC, stable) ADI-950-210-0030 30 mL ¥18,000 HighDef HighDef TM ADI-950-140-0030 30 mL ¥14,000 HighDefTM red IHC chromogen (AP, plus) ADI-950-141-0030 30 mL ¥20,000 HighDef ADI-950-151-0006 6 mL ¥10,000 ADI-950-151-0030 30 mL ¥28,000 ADI-950-150-0030 30 mL ¥17,000 ADI-950-160-0030 30 mL ¥25,000 ADI-950-171-0006 6 mL ¥10,000 ADI-950-171-0030 30 mL ¥28,000 ADI-950-220-0100 100 mL ¥18,000 ADI-950-142-0006 6 mL ¥10,000 ADI-950-142-0030 30 mL ¥28,000 TM TM HighDef TM red IHC chromogen (AP) blue IHC chromogen (HRP) blue IHC chromogen (AP) HighDefTM green IHC chromogen (AP) HighDef TM HighDef TM black IHC chromogen (HRP) IHC hematoxylin HighDefTM red IHC chromogen (HRP) IHC 色素 Q & A Q1 : ADI-950-140-0030 (HighDefTM red chromogen (AP)) と ADI-950-141-0030 (HighDefTM red chromogen (AP, plus)) の違いは何ですか？ A1 : 赤色アルカリホスファターゼ色素の中には混ぜると不安定になるものがあります。これは自動化スライド染色装置で使用するには問題に なります。HighDefTM red IHC 色素 (AP, plus) (ADI-950-141-0030) は自動染色装置に適した構成になっていて ( 手動でも使用できます )、 DI-950-140-0030 ( 標準の HighDefTM red) よりも異なる赤色 ( ピンク∼濃紅：brilliant dark red) を呈します。 Q2 : マニュアルによると、HighDef™ red IHC chromogen (AP, plus) (ADI-950-141-0030) は赤色を呈しますが、 その範囲はピンクから濃紅：brilliant dark red となっています。この範囲は何によるものですか？ A2 : カラー強度は興味ある抗原の発現レベルに依存します。 Q3 : HighDef™ IHC chromogen substrate (DAB, HC) (ADI-950-211-0200) と HighDef™ IHC chromogen substrate (DAB, stable) (ADI-950-212-0200) の違いは何ですか？ A3 : 違いは最終産物の色です。ADI-950-212-0200 は茶色になり、ADI-950-211-0200 はより高いコントラストのチョコレート色です。 Q4 : HighDef™ Chromogens を ABC 等の別の検出システムで使用することはできますか？ A4 : 理論的には可能ですがお勧めはしません。最適な結果を得るためには、やはり PolyView 検出システムを使用してください。 ナノポリマー検出試薬のおかげでバックグランドのないより好感度で特異的な結果を得ることができます。 ③ 4 重染色プロトコール プロトコールには染色過程の順番が記載されていますが、ご希望の色数に対応させるためには、抗体 / 検出 / 発色ステップの追加・ 省略の必要があります。多重染色時の抗原選択、インキュベーション時間はスライドごとに注意が必要です。ブロッキングステップの 追加が抗体アプリケーション間で必要になる場合もあります。 本プロトコールではホルマリン固定パラフィン包埋されたヒト扁桃腺切片について、マウス抗ヒトマクロファージ (CD68) モノクロー ナル抗体、ウサギ抗ヒトλ鎖ポリクローナル抗体、ウサギ抗ヒトκ鎖ポリクローナル抗体、マウス抗ヒトサイトケラチン ( 高分子量 ) モノクローナル抗体を使った 4 重染色の方法を記載しています。 必要な試薬 ● IHC Tissue Primer ● IHC Background Blocker ● IHC Wash Buffer ● IHC Antigen Retrieval Reagent (Tris-EDTA, pH 9.0) 試薬調製 ● PolyViewTM IHC Reagent (mouse-HRP) ● PolyViewTM IHC Reagent (rabbit-AP) ● HighDefTM IHC Chromogen Substrate (DAB, stable) ● HighDefTM Blue IHC Chromogen (AP) ● HighDefTM Red IHC Chromogen (AP) ● HighDefTM Yellow IHC Chromogen (HRP) 試薬によっては 1 週間まで安定ですが、最適な結果を得るために、試薬は新たに調製したものをご使用ください。 1. 1× HighDef IHC Chromogen Substrate (DAB, stable) 希釈標準溶液： ミキシングボトルに HighDefTM DAB を 1 滴 ( およそ 200 µL) と HighDefTM DAB 基質バッファー 1 ml を加え、よく混ぜる。希釈標準溶液は暗所で 7 日間安定。 TM 2. 1× HighDefTM Blue IHC Chromogen (AP) 希釈標準溶液： ミキシングボトルに HighDefTM Blue 色素を 1 滴 ( およそ 200 µL) と HighDefTM Blue バッファー 1 ml を加え、よく混ぜる。希釈標準溶液は暗所で 6 時間安定。 3. 1× HighDefTM Red IHC Chromogen (AP) 希釈標準溶液： ミキシングボトルに HighDefTM Red 色素を 1 ドロップ ( およそ 200 µL) と HighDefTM Red バッファー 1 ml を加え、よく混ぜる。フレッシュなものを調製してください。 希釈標準溶液は 20 ∼ 30 分ほどしか安定ではありません。 4. 1× HighDefTM yellow IHC Chromogen (HRP) 希釈標準溶液： ミキシングボトルに HighDefTM Yellow 色素を 1 滴 ( およそ 200 µL) と HighDefTM Yellow バッファー 1 ml を加え、よく混ぜる。希釈標準溶液は暗所で 1 日間安定です。 染色過程 注意：洗浄操作は、バックグラウンドブロッキングステップ以降を除いて各ステップ後に 1×IHC 洗浄バッファーで行ってください。 1. 抗原賦活化 a. 必要に応じて抗原賦活化を行います。推奨溶液：IHC 酵素抗原賦活化試薬 ( 品番 ADI-950-280)、IHC 抗原賦活化試薬 (クエン酸、pH6.0) ( 品番 ADI-950-270) もしくは 10×IHC 抗原賦活化試薬 (EDTA、pH8.0) ( 品番 ADI-950-273)。 2. 組織調製 a. IHC Tissue Primer で 5 分間スライドをインキュベートする。1× 洗浄バッファーで 1 分間の洗浄操作を 3 回行う。 b. IHC Background Blocker で 5 分間ブロックする。 3. 染色パート 1 a. マウス抗ヒトマクロファージ (CD68) モノクローナル抗体を添加し、30 分間インキュベートする。1× 洗浄バッファーで 1 分間の洗浄操作を 3 回行う。 b. mouse-HRP PolyView™ IHC 試薬溶液を加え、20 分間インキュベートする。1× 洗浄バッファーで 1 分間の洗浄操作を 3 回行う。 c. 1× HighDef™ IHC Chromogen Substrate (DAB, stable) 希釈標準溶液を添加し、5 分間置く。1× 洗浄バッファーで 1 分間の洗浄操作を 3 回行う。 4. 染色パート 2 a. ウサギ抗ヒトλ鎖ポリクローナル抗体を添加し、30 分間インキュベートする。1× 洗浄バッファーで 1 分間の洗浄操作を 3 回行う。 b. rabbit-AP PolyView™ IHC 試薬溶液を加え、20 分間インキュベートする。1× 洗浄バッファーで 1 分間の洗浄操作を 3 回行う。 c. 1× HighDef™ Blue IHC Chromogen (AP) 希釈標準溶液を添加し、5 分間置く。1× 洗浄バッファーで 1 分間の洗浄操作を 3 回行う。 5. 染色パート 3 a. ウサギ抗ヒトκ鎖ポリクローナル抗体を添加し、30 分間インキュベートする。1× 洗浄バッファーで 1 分間の洗浄操作を 3 回行う。 b. rabbit-AP PolyView™ IHC 試薬溶液を加え、20 分間インキュベートする。1× 洗浄バッファーで 1 分間の洗浄操作を 3 回行う。 c. 1× HighDef™ Red IHC Chromogen (AP) 希釈標準溶液を添加し、5 分間置く。1× 洗浄バッファーで 1 分間の洗浄操作を 3 回行う。 6. 染色パート 4 a. マウス抗ヒトサイトケラチン ( 高分子量 ) モノクローナル抗体を添加し、30 分間インキュベートする。1× 洗浄バッファーで 1 分間の洗浄操作を 3 回行う。 b. mouse-HRP PolyView™ IHC 試薬溶液を加え、20 分間インキュベートする。1× 洗浄バッファーで 1 分間の洗浄操作を 3 回行う。 c. 1× HighDef™ Yellow IHC Chromogen (AP) 希釈標準溶液を添加し、5 分間置く。1× 洗浄バッファーで 1 分間の洗浄操作を 3 回行う。 7. 対比染色 a. ヘマトキシリン (HighDef™ IHC Hematocylin、品番 ADI-950-220) もしくはメチルグリーンのどちらかを添加。2 分間インキュベートする。 8. 後処理 a. 蒸留水か脱イオン水でスライドをリンスする。 b. 組織切片を乾燥させずにスライドから余分な水分を除去する。組織が封入する前に湿っていることを確かめる。アルコールやキシリンでの 脱水は行わないでください。 c. Permanent Mounting Medium、HighDef™ IHC Mount (ADI-950-261) を 2-3 滴スライドに垂らして覆う。 ● 希望販売価格 ･･･「希望販売価格」は参考であり、販売店様からの販売価格ではございません。 記載の希望販売価格は２０１4 年 4 月１日現在の希望販売価格です。 予告なしに改定される場合がありますので、ご注文の際にご確認下さい。消費税は含まれておりません。 ● 使 用 範 囲 ･･･ 記載の商品は全て、「研究用試薬」です。 人や動物の医療用・臨床診断用等としては使用しないよう、十分ご注意下さい。 （12012）
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