Human/Mouse/Rat C-Peptide Competitive EIA Kit

製品コード
MK155
研究用
Human/Mouse/Rat
C-Peptide Competitive EIA Kit
説明書
v201402
I．製品概要
C-Peptide は膵臓の細胞内小胞分泌器官であるβ細胞よりプロインスリンとして産生されます。
以下の模式図が示す通りプロインスリンの中央部に位置しており、N 末側のインスリン B 鎖（30
アミノ酸残基）と C 末端側のインスリン A 鎖（21 アミノ酸残基）の間にある 31 アミノ酸からな
る１本鎖ペプチドです。プロインスリンのプロセッシングにより、インスリン 1 分子に対して
C-Peptide 1 分子が分離されます。
本製品は、種網羅的 C-Peptide に反応するウサギポリクローナル抗体を用いた 1 抗体タイプ抗
原競合 EIA 法（酵素免疫測定法）により、血清、血漿、尿および細胞培養上清中のインスリン
C-Peptide を定量するキットです。ヒト、マウス、ラットを測定対象とすることができます。あ
らかじめ特異抗体捕捉用二次抗体（Anti Rabbit 抗体）を固定化したプレコートタイプで、再現性
も高く操作性に優れています。アビジン・ビオチンシステムを利用することで、約 5 時間で多検
体の高感度測定が容易にできます。
プロインスリン
インスリンと C-Peptide
C - Peptide
C - Peptide
RK
A chain
A chain
Pro- Insulin
Insulin
B chain
B chain
RR
N term
N term
［プレプロインスリンのアミノ酸配列］
プレプロインスリンからシグナルペプチドが切り離され、プロインスリンとなる。
B chain
10
20
30
40
50
70
80
90
100
110
60
insulin I _Mouse
insulin II_Mouse
insulin I _Rat
insulin II_Rat
insulin _Human
insulin _Macaca
insulin _Pig
insulin _Cow
insulin _Guinea Pig
insulin _Degu
insulin _Rabbit
insulin I _Mouse
insulin II_Mouse
insulin I _Rat
insulin II_Rat
insulin _Human
insulin _Macaca
insulin _Pig
insulin _Cow
insulin _Guinea Pig
insulin _Degu
insulin _Rabbit
C-Peptide
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A chain
2
製品コード MK155
C-Peptide 自体の生理活性機能については詳細は明らかになっていませんが、インスリンに比べ
て体内での半減期が 2 ～ 5 倍も長いので、健常人の末梢血中での C-Peptide の濃度はインスリン
濃度よりも高いとされています。そのため、血中の C-Peptide 濃度は、インスリン濃度よりも膵
臓でのプロインスリン産生量をより正確に反映していると考えられます。
また、C-Peptide はインスリンと異なり腎臓から体外に排出されるので、尿中の存在レベルが血
中の 20 ～ 50 倍にもなります。食事により測定値が変動するインスリンと異なり、24 時間蓄尿
で C-Peptide の排出量をモニタリングすることで、平均的な膵β細胞のインスリン産生能を知る
ことができます。
C-Peptide の定量は、以下のような研究分野で利用されています。
a) インスリン投与状態での膵β細胞の残された機能評価
b) 糖尿病 I 型・Ⅱ型の分類評価
c) 低血糖状態での膵機能評価
インスリンの投与は、
C-Peptide 濃度を上昇させることなく血糖値を下げることができる。
d) 病態モデル動物で外部からのインスリン投与を受けながらのインスリノーマの検出・評価
試験
e) 正常血糖状態でインスリン抑制試験を実施し、C-Peptide 測定を行ってインスリノーマの
検出・評価が可能かどうかを見る動物試験
f) 実験的膵切除後の残存している膵臓組織の機能マーカーとして有用。また、膵臓もしくは
β細胞移植の経過モニタリングにも有用
II．測定原理
本製品は、1 抗体タイプ抗原競合 EIA 法による抗原検出の原理を利用しています。この測定には
C-Peptide 特異抗体を捕捉するための二次抗体をコーティングした 96 ウェル固相プレートを用い
ます。はじめに、C-Peptide に特異的なウサギポリクローナル抗体を 96 ウェル固相プレートに固
定した二次抗体で補足し、反応後の余剰抗体はウェルを洗浄して除去します。次に、あらかじめ
別の容器で調製した、標準液または検体と規定濃度のビオチン標識 C-Peptide を 1：1 に混合した
サンプルを、C-Peptide 特異抗体固相化プレートの各ウェルに加え、抗 C-Peptide 特異抗体上で競
合反応させます。反応後、洗浄により余剰のサンプルを除去して、HRP 標識ストレプトアビジン
をウェルに加えます。再度各ウェルの洗浄を行い、TMB 基質液を加えると抗 C-Peptide 抗体に結
合したビオチン標識 C-Peptide の濃度依存的に青色に発色します。未知検体中に C-Peptide が多
く含まれていると、反応系で競合するため各ウェルに残留するビオチン標識 C-Peptide は少なく
なり、
発色強度は減少します。最後に反応停止液を加えると、
色調は青から黄に変化します。プレー
トリーダーにより 450 nm の吸光度を測定し、得られた測定値より解析を行います。
本製品は、C-Peptide に特異的に反応し、インスリン A 鎖・B 鎖には交差反応しません。
洗浄
洗浄
洗浄
P
二次抗体
プレート
特異抗体
の捕捉
未知サンプル
および
ビオチン標識抗原
同時添加 ⇒ 競合反応
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P
HRP標識
ストレプト
アビジン添加
3
P
P
基質添加
P
P
反応停止液
添加
450 nm 吸光度測定
製品コード MK155
III．キットの内容
（1） Secondary Antibody Microtiterplate
二次抗体コーティングプレート（96 ウェル：8 ウェル× 12 strips）
1 plate
（2） Wash Buffer Concentrate (×20)
20 倍濃縮洗浄液
（3） Standard C-Peptide（100 μg/ml)
合成ペプチド C-Peptide
（4） Anti C-Peptide PoAb
抗 C-Peptide ウサギポリクローナル抗体
（5） Assay Diluent A
検体希釈液（血清または血漿用）
※防腐剤として 0.09% アジ化ナトリウムを含む。
30 ml
（6） Assay Diluent B (×5) 検体（培養上清、尿用）および試薬調製用希釈液
15 ml
（7） Biotinylated C-Peptide（10 μg/ml）
ビオチン標識 C-Peptide
（8） HRP-Streptavidin Concentrate HRP 標識ストレプトアビジン濃縮液
0.6 ml
（9） Positive Control 陽性コントロール
0.1 ml
25 ml
10 μl × 2
5 μl × 2
20 μl × 2
（10）
Substrate Solution (TMBZ)
3,3’,5,5’- テトラメチルベンジジン溶液
12 ml
（11）
Stop Solution without Sulfuric Acid
反応停止液（硫酸不含）
12 ml
IV．キット以外に必要な試薬及び器具（主なもの）
・マイクロプレートリーダー（450 nm の吸光度測定が可能な機器）
・96 ウェルプレートまたはマイクロチューブ
・マイクロピペットおよびチップ
・マルチチャンネルピペット
・プレート洗浄装置
※Personal Microplate Washer（製品コード MK950）が便利です。
※ELISA 工程をオートメーション装置で実施する際、洗浄液（Wash Buffer）が不足
する場合は、Wash and Stop Solution for ELISA without Sulfuric Acid（製品コー
ド MK021）を用いて、0.1% Tween 20/PBS を調製して洗浄液としてご使用くだ
さい。
・プレートミキサー
・必要に応じて、空調式恒温槽（20 ～ 30℃）
・1 ～ 25 ml のピペット（試薬調製用）
・100 ml と 1 L のメスシリンダー
・ペーパータオル
・蒸留水
・ELISA データ解析ソフト、両対数グラフ用紙等
・検体希釈および標準液調製用チューブ
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製品コード MK155
V．保存
本製品は、ー 20℃以下で輸送されます。
解凍しない場合は、外箱ラベルに記載の有効期限まで－ 20℃で保存可能です。
凍結融解の繰り返しは避けてください。
いったん解凍した場合は、2 ～ 8℃で約 6 か月保存可能です。
・開封後のマイクロプレートや試薬類は 2 ～ 8℃で約 1 ヵ月の保存が可能。未使用の
マイクロプレートのウェルは乾燥剤入りのパウチに戻し、密封する。
VI．使用目的
血清、血漿および尿、細胞培養上清中の C-Peptide 量の測定
※ 本製品は、ヒト、マウス、ラットを測定対象としています。
VII．準備
全ての試薬及び検体は使用前に室温（20 ～ 30 ℃）に戻す。
1．試薬の調製
・二次抗体プレート［（1）Secondary Antibody Microtiterplate］
使用前に室温にもどしてから開封する。
・洗浄液
25 ml の（2）Wash Buffer Concentrate（×20）を 475 ml の蒸留水で希釈して、よ
く混和し、洗浄液とする。
※万一、析出物が認められた場合、室温まで温めて緩やかに混和して結晶を溶解
してください。
※ELISA 工程をオートメーション装置で実施する際、洗浄液が不足する場合があ
ります。その際には、Wash and Stop Solution for ELISA without Sulfuric Acid（製
品コード MK021）を用いて、0.1% Tween 20/PBS を調製してご使用ください。
・ Assay Diluent A（血清、血漿検体希釈用）
（5）Assay Diluent A をそのまま使用する。防腐剤として 0.09% アジ化ナトリウム
が含まれている。血清または血漿測定の場合、標準液および検体の希釈に用いる。
・ Assay Diluent B（細胞培養上清検体や尿検体の希釈および試薬調製用）
（6）Assay Diluent B
（×5）を蒸留水で 5 倍希釈して 1 × Assay Diluent B を調製する。
培地や培養上清、または尿の測定の場合、標準液および検体の希釈に用いる。
・C-Peptide 標準液［（3）Standard C-Peptide］
1 本の分注量がわずかなため（10 μl）
、肉眼で内容量を確認することは難しい
が、バイアルを軽くスピンダウンしてから開封する。 Assay Diluent A または 1 ×
Assay Diluent B（検体の希釈と同じ種類の希釈液を使用）のいずれかを 490 μl バイ
アルに加え、ピペットで丁寧に混和し、C-Peptide 2,000 ng/ml の標準液を調製する。
希釈後の Standard C-Peptide 溶液（2,000 ng/ml）はー20℃以下で保存可能（ー80℃
推奨）
。
VII-3. に従って、標準液の希釈系列を調製する。
・抗 C-Peptide ウサギポリクローナル抗体［（4）Anti C-Peptide PoAb］
1 本の分注量がわずかなため（5 μl）、肉眼で内容量を確認することは難しいが、
軽くスピンダウンしてから蓋をあけ、50 μl の 1 × Assay Diluent B をバイアルに
加えてよくピペッティングする。これを二次抗体プレートに捕捉させる特異抗体
の原液とする。この溶液は測定方法に従って 100 倍希釈して使用する。
1 バイアルには 48 ウェル相当分が含まれる（2 本添付）。
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製品コード MK155
・ビオチン標識 C-Peptide［（7）Biotinylated C-Peptide（10 μg/ml）］
1 本の分注量がわずかなため（20 μl）、肉眼で内容量を確認することは難しい
が、バイアルを軽くスピンダウンしてから開封する。12 μl を量りとり、6 ml の
1 × Assay Diluent B で 500 倍に希釈し、20 ng/ml ビオチン標識 C-Peptide を調製
して測定に使用する。キットには 2 本添付されている。
・HRP 標識ストレプトアビジン［（8）HRP-Streptavidin Concentrate］
バイアルを軽くスピンダウンしてから開封する。HRP 標識ストレプトアビジン濃
縮液を 1 × Assay Diluent B で 200 倍希釈して使用する。
調製例：スピンダウンして開封する。
HRP 標識ストレプトアビジン濃縮液をピペットで丁寧に混和する。
1 Plate 分として 60 μl を量りとり、1 × Assay Diluent B 12 ml とよく
混和して 200 倍希釈液を調製する。
調製した HRP 標識ストレプトアビジンは 24 時間内に使用する。
希釈溶液は保存不可。
・陽性コントロール［（9）Positive Control］
測定系の動作確認のための陽性コントロールである。
検体の希釈と同じ希釈液を用いて 2 倍希釈して測定すると、1 ～ 100 ng/ml の範
囲で検出される。
・反応停止液［（11）Stop Solution without Sulfuric Acid］
そのまま使用する。
※粘度の高い溶液のため、投入後プレートミキサー等で十分に撹拌してくだ
さい。発色後の色素安定性に優れており、6 時間は吸光度が安定しています。
2．検体
・血清または血漿検体の希釈には（5）Assay Diluent A を用いる。
・尿あるいは培養上清検体の希釈には 1 × Assay Diluent B を調製して用いる。
・標準液の調製は検体希釈と同じ種類の希釈液を使用することで測定精度が向上する。
正常血清および血漿の標準的な希釈倍率：2 ～ 4 倍希釈
尿サンプルの標準的な希釈倍率
：2 ～ 16 倍希釈
※ C-Peptide 量は検体によって異なるので、希釈率の検討を行ってください。
注）
本製品で 10% ウシ胎児血清含有培地を含むサンプルを測定対象とする時、培地に
含まれるウシ抗原の割合は検出感度を下回る場合が多いですが、使用するウシ胎
児血清のロットにより差がある場合も想定されます。念のため、培地ブランクを
設定して測定してください。
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3．標準曲線作成のための標準液希釈系列の調製
検体の希釈に用いた希釈液と同じものを用いて、調製した標準液（2,000 ng/ml)
の 2 倍希釈物を最高濃度としてさらに 10 倍希釈段階をとり、標準液（1,000、
100、10、1、0.1 ng/ml）を調製する。
希釈ごとによく混和し、ピペットチップを交換すると技術精度が向上する。
上記の 5 濃度の標準液に加え、希釈液のみ（Assay Diluent A または 1 × Assay
Diluent B）の 0 ng/ml の標準液を 1 本準備する。
10 μl 標準液 (100 μg/ml)
＋ 490 μl サンプル希釈液
100 μl
100 μl
100 μl
100 μl
2 倍希釈
2,000
ng/ml
1,000
ng/ml
100
ng/ml
10
ng/ml
1
ng/ml
0.1
ng/ml
0
ng/ml
溶解後、さらに 2 倍希釈した標準液 1,000 ng/ml を最高濃度とし、900 μl の
サンプル希釈液に標準液 100 μl を加えて 10 倍希釈を段階的に繰り返す。
希釈ごとによく混和する。
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VIII．測定方法
使用前に試薬や検体を室温（20 ～ 30℃）に戻す。標準液および検体の測定は少なくとも 2 重
測定で行うことが望ましい。
1. 調製した抗 C-Peptide ウサギポリクローナル抗体の原液を 1 × Assay Diluent B で 100 倍
希釈して、二次抗体プレートに 100 μl/well で投入し、室温で 1.5 時間静置反応させる。
その日に測定を実施しない場合は、4℃で一晩反応させることができる。
＜特異抗体プレートの作製＞
2. 特異抗体液を除去して、洗浄液で 4 回洗浄する。プレート洗浄装置およびマルチチャン
ネルピペットを使用して洗浄液 300 μl を各ウェルに加えて洗浄する。各ステップで反応
液を完全に除去することが良い結果を得るために重要である。洗浄後、アスピレーター（吸
引）またはデカント（振り落し）で洗浄液を充分に除く。さらに、プレートを逆さにして、
ペーパータオルに何度か打ちつけて液を切る。
3. 各濃度の標準液および希釈した測定サンプルを、あらかじめ別の 96 ウェルプレート、ま
たはマイクロチューブに各 50 μl ずつ加え、さらに 500 倍希釈して調製したビオチン標
識 C-Peptide（20 ng/ml）を 50 μl ずつ添加し、測定サンプルとビオチン標識 C-Peptide
を 1：1 としてよく混合する。
4. 洗浄液を充分除いた特異抗体プレートに 3. の混合液全量＊（100 μl）を投入し、室温で 2.5
時間静置反応する。＜ 1 抗体抗原競合反応＞
＊ : 液の移し換えなどで液量が不足する場合は、すべてのサンプル・標準品の投入量を
統一する。
5. 反応液を除去して、洗浄液で 4 回洗浄する。2. と同様に行う。
6. 調製した HRP 標識ストレプトアビジンを 100 μl ずつ各ウェルに加える。室温で 45 分静
置反応する。＜アビジン・ビオチン反応＞
7. 反応液を除去して、洗浄液で 4 回洗浄する。2. と同様に行う。
8. Substrate Solution (TMBZ) を 100 μl ずつ各ウェルに加える。
遮光、室温で 15 分間発色反応させる。
9. 基質液を添加した順に反応停止液を 100 μl ずつ各ウェルに加え、プレートミキサーで充
分に混合撹拌する。
10. プレートリーダーを用いて 450 nm で吸光度測定する。
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製品コード MK155
【測定法の概略】
1. 試薬を調製する。
検体と標準液を調製し、配置を決める。
2. 抗 C-Peptide 抗体を二次抗体固相プレートの各ウェル
に 100 μl ずつ加え、室温で 1.5 時間または 4℃で一晩
反応させて特異抗体プレートを作製する。
使用前に洗浄
3. 標準液および検体とビオチン標識 C-Peptide を 50 μ l
ずつ 1：1 で混合する。
混合液全量を特異抗体プレートの各ウェルに加える。
室温で 2.5 時間反応させる。
洗浄
4. HRP 標識ストレプトアビジンを 100 μl ずつ各ウェルに
加える。
室温で 45 分反応させる。
洗浄
5. TMBZ を 100 μl ずつ各ウェルに加える。
室温で 15 分間反応させる。
第一反応
第二反応
第三反応
6. Stop Solution を 100 μl ずつ各ウェルに加える。
450 nm で吸光度を測定する。
IX．定量値算出方法
両対数グラフ用紙または専用のソフトウェアを用いて、2 重測定した標準液の濃度を X 軸に、
吸光度を Y 軸にとり、標準液の結果をプロットして検量線を作成する。2 重測定したコントロー
ルおよび検体の吸光度値をもとに検量線より検体定量値を算出する。本測定系は、1 抗体に
よる競合 ELISA 法のため、標準液ゼロ濃度値の吸光度がもっとも高値となり、サンプル中に
存在する C-Peptide 量が増えるにしたがって吸光度が減少する。
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製品コード MK155
X．性能
1．標準曲線
下記の標準曲線は代表的な一例である。測定ごとに標準曲線を作成してください。
Standard Curve
Mean Value
1.5
1
0.5
0
0.1
1
10
100
1000
Conc.
4-P Fit : y = (A - D)/( 1 + (x/C)B ) + D :
A
1.6
B
0.857
C
30.1
D
0.0812
R2
1
C-Peptide 濃度
（ng/ml)
1,000
100
10
1
0.1
0
A450
0.155
0.479
1.183
1.512
1.602
1.683
2．測定範囲と検出感度
C-Peptide の測定範囲：0.1 ～ 1,000 ng/ml
C-Peptide の信頼範囲：1 ～ 1,000 ng/ml
C-Peptide の検出感度：0.8 ng/ml
3．再現性
同時再現性：CV ＜ 10%
日差再現性：CV ＜ 15%
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10
製品コード MK155
4．希釈直線性
＜ 2 種の高濃度ペプチドサンプルを Assay Diluent A で希釈した例＞
1,200
y = 1124.9x - 1.5595
濃度（ng/ml）
1,000
800
y = 871.7x + 3.0344
600
A
400
B
200
0
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
倍率
倍率
×1
（1）
× 10
（0.1）
× 100
（0.01）
× 1,000 （0.001）
× 10,000 （0.0001）
定量値（ng/ml）
A
B
874
1,124
98
104
7.9
12
0.8
1.7
0.37
＜マウス随時尿を 1 × Assay Diluent B で希釈した例＞
濃度（ng/ml）
5
4
3
×4
×8
2
y = 11.08x + 1.736
R² = 1
1
0
倍率
定量値（ng/ml)
(0.25）
4.5
(0.125)
3.1
0
0.1
0.2
0.3
倍率
5．特異性
本製品は、以下の物質と交差反応しないことを確認している。
Insulin-A chain Insulin-B chain
Angiotensin ll NPY
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Ghrelin
APC
11
Nesfatin
製品コード MK155
XI．参考文献
1) Marques RG, Fontaine MJ, Rogers J., C-Peptide: much more than a byproduct of insulin
biosynthesis., Pancreas 29 (3):231–8 (2004)
2) Wahren J, Ekberg K, Samnegård B, Johansson BL., C-Peptide:a new potential in the
treatment of diabetic nephropathy., Curr. Diab. Rep. 1 (3): 261–6 (2001)
3) Wahren J., C-Peptide: new findings and therapeutic implications in diabetes., Clin Physiol
Funct Imaging 24 (4): 180–9 (2004)
XII．注意
・本製品は研究用として販売しております。ヒト、動物への医療、臨床診断用には使用しな
いようご注意ください。また、食品、化粧品、家庭用品等として使用しないでください。
・タカラバイオの承認を得ずに製品の再販・譲渡、再販・譲渡のための改変、商用製品の製
造に使用することは禁止されています。
・ライセンスに関する最新の情報は弊社ウェブカタログをご覧ください。
・本説明書に記載されている会社名及び商品名などは、各社の商号、または登録済みもしく
は未登録の商標であり、これらは各所有者に帰属します。
v201402

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