こちら - 国立循環器病センター

仕様書１．調達件名マイクロミニブタ心筋梗塞モデルにおける化合物 X の薬理作用検討業務委託契約２．目的マイクロミニブタ心筋梗塞モデルにおいて、化合物 X の心筋梗塞後の心筋量減少（梗塞領域）
及び心機能低下に対する薬理作用を検討する。３．契約期間契約締結日∼平成 28 年 3 月 22 日４．業務の内容国立研究開発法人国立循環器病研究センター（以下「当センター」という）が提供する化合物
（DNW-14021）について以下に記載する試験の試験計画書（和文）を当センターと協議のうえ作
成し、当センターの承認を得た後、試験を実施して各試験について試験報告書を作成する。 ※記載内容のうち、「○○○○○（Ａ）」の（Ａ）は後述の参考文献に対応。（１）予備試験１＜目的＞・結紮部位によるリスク領域の個体差の検討・リスク領域等のコントロール値（リスク領域の面積／左心室全面積、左心室前壁、中壁、後
壁の厚さ）の取得・本試験に使用する化合物 X 用量の確認・心エコー測定手技の確認＜使用動物＞・雄性マイクロミニブタ（8∼12kg、5 ヶ月令以上）。なお、体重は目安とする。注：原則として雄性ブタとするが、供給不足等やむを得ない事情により必要数を確保できな
い時は当センターと協議の上、雌性ブタを使用しても良い（以下、同様）。＜動物数＞ 5 頭＜方法＞・ケタミンの筋肉内注射とイソフルランの吸入を基本とした適切な麻酔下（５、７）で、心エコー
装置を用いて複数のレベルで心機能（LVEDD、 LVESD、EF、FS、LVPW、IVS 等）を測定・算出
（５、６、７）
する。・化合物 X（低用量群、中用量群、高用量群のいずれか）を 1 時間静脈内に持続投与し、血行
動態（血圧、心拍数）等を連続的にモニターし、30 分及び 60 分の測定値を求める。・持続投与終了 5 分前に採血し、血漿 2.5ml を-70℃以下で凍結保存する。試験終了後、当センター又は当センターが指定する研究施設に送付する。（当センター以外
の研究施設に送付する場合は、別途協議とする）・開胸し、左前下行枝全長の心尖側から 1/3 の部位で冠血管を結紮（１）する。注：致死性の不整脈を抑制するために、塩酸アミオダロン（５、７）あるいはリドカイン（１）を
虚血前に投与しても良い。また、冠結紮により不整脈が生じた場合はリドカインを投与
しても良い。心室細動が生じた場合は電気的除細動を行う。 ※塩酸アミオダロンについては、受託者内でマイクロミニブタへの投与実績があればニ
コランジルを代用することができる。その際は、当センターの承認を得ること。・冠結紮後直ちにフルオレセント・チオフラビンＳ溶液（９）を左心房に挿入したカテーテルよ
り投与する。・3∼5 分後、第二対角枝直後の部位（１）で冠血管を結紮する。注：冠血管の結紮部位は、状況に応じて、両者協議の上で左前下降枝の中間部等に変更する
ことができる。・結紮後速やかにエバンスブルー溶液を左心房に挿入したカテーテルより投与する。注：心室細動で心停止し、電気的除細動によっても回復しない場合は、心臓を摘出し、60mmHg
の圧で大動脈に挿入したカテーテルからエバンスブルーを投与する。必要ならば、左前下行枝の結紮部位末梢にもカテーテルを挿入し、60mmHg の圧で媒体を
エバンスブルーと同時に投与する。・エバンスブルー溶液投与後、直ちに塩化カリウム等で心停止させ、心臓を摘出し、氷冷した
生理食塩水へ投入する。・房室間溝に平行（短軸方向）に輪切り標本を作製（3x2 分割：3 分割後、各々の切片を 2 分
割する）する。その中の 3 輪切り切片（心尖部から 1、3、5 番目の切片の両面、計 5 断面）
について UV ライト照射下と非照射下でデジタル写真を撮影する（９）。デジタル写真から非灌
流領域（リスク領域）及び灌流領域の面積をイメージアナライザー等で計算する。また、前
壁、中壁、後壁の壁厚（各輪切り切片毎）等も測定（５、７）する。・リスク領域の面積／左心室全面積とそのバラつき（SD、CV）を計算し、結紮部位間の比較を
行う。・上記方法で１例実施し、フルオレセント・チオフラビンＳによるリスク領域の測定が十分機
能しないときは、左前下行枝全長の心尖側から 1/3 の部位で冠血管を結紮し、フルオレセ
ント・チオフラビンＳを投与することは中止する（第二対角枝直後の部位での結紮は実施）。その場合、当センターと協議の上、心摘出後に左前下行枝に結紮予定部位までカテーテルを
挿入・結紮し、フルオレセント・チオフラビンＳあるいはエバンスブルー等の色素を注入し、
リスク領域等を測定する等の方法で実施する。その他の手順についても、状況に応じて両者協議の上で変更することができる。 ※予備試験１を実施した結果に問題が無ければ、予備試験２を実施する。（２）予備試験２＜目的＞・心エコー装置による心機能評価の精度と虚血後の変化の検出可能性の確認・一連の作業手順の確認＜使用動物＞・雄性マイクロミニブタ（8∼12kg、5 ヶ月令以上）。なお、体重は目安とする＜動物数＞・完成例として 2 例（冠血管の結紮 4 週間後の試験まで実施できたものを完成例とする）＜方法＞・ケタミンの筋肉内注射とイソフルランの吸入を基本とした適切な麻酔下（５、７）で（以下、同
様）、心エコー装置を用いて適正なレベルで心機能（LVEDD、LVESD、EF、FS、LVPW、VS 等）
を測定・算出（５、６、７）する（前値）。・開胸し、予備試験１の結果等で当センターが決定した部位で冠血管を結紮する。注：致死性の不整脈を抑制するために、塩酸アミオダロン（５、７）あるいはリドカイン（１）を
虚血前に投与しても良い。また、冠結紮により不整脈が生じた場合はリドカインを投与しても良い。心室細動が生
じた場合は電気的除細動を行う。 ※塩酸アミオダロンについては、受託者内でマイクロミニブタへの投与実績があればニ
コランジルを代用することができる。その際は、当センターの承認を得ること。・結紮 2 時間後（閉胸後）に心エコー装置を用いて心機能を測定する（虚血後 2 時間値）。・心機能測定後ただちに媒体あるいは化合物 X（低用量）の静脈内持続投与を開始する（2 週
間連続持続投与）。なお、媒体及び化合物 X は少なくとも 1 日に 1 回以上、新規に調製した溶液と交換する。・媒体あるいは化合物 X 投与終了日（冠結紮から 2 週間後）、適切な麻酔下で心エコー装置を
用いて心機能（同上）を測定する（虚血後 2 週間値）。・冠結紮から 4 週間後、適切な麻酔下で心エコー装置を用いて心機能（同上）を測定する（虚
血後 4 週間値）。・心機能を測定後、開胸し、心停止後心臓を摘出し、氷冷した生理食塩水中へ投入する。房室
間溝に平行（短軸方向）に輪切り標本を作製（3x2 分割）する。その中の 3 切片（心尖部か
ら 1、3、5 番目の切片の両面、計 5 断面）を TTC 染色し、デジタル写真を撮影する（５、７）。
デジタル写真からイメージアナライザー等で梗塞面積／左心室面積を算出する（５、７）。また、梗塞領域の中心線での長さと非梗塞領域の中心線の長さ（３、４）及び梗塞領域と非梗塞
領域の壁厚（５、８）も同様に測定する。注：右心室にも梗塞が及ぶ場合は、梗塞面積（右心室）／右心室面積も算出する。・残りの 3 切片から MTC 染色、免疫染色及び生化学検査のため心筋組織を切り出し（２）、包埋
（パラフィン、OCT compound）または凍結して当センター又は当センターが指定する研究施
設に送付する。（当センター以外の研究施設に送付する場合は、別途協議とする）・以上の手順等については、予備試験１の結果に基づき、両者協議の上で変更することができ
る。 ※予備試験２を実施した結果に問題がなければ、本試験を実施する。（３）本試験＜目的＞・心筋梗塞後の心筋量減少（梗塞領域）に対する化合物 X の薬理作用の検討・心筋梗塞後の心機能低下に対する化合物 X の薬理作用の検討＜使用動物＞・雄性マイクロミニブタ（8-12kg、5 ヶ月令以上）。なお、体重は目安とする。＜動物数＞・完成例として媒体群、低用量群、中用量群、高用量群を各 2 例、追加検討例として媒体群を
4 例と化合物 X 投与群（選択した 1 群）を 4 例の計 16 例（冠血管の結紮 4 週間後の試験まで
実施できたものを完成例とする。化合物 X 投与の計画の項、参照のこと）。＜方法＞・ケタミンの筋肉内注射とイソフルランの吸入を基本とした適切な麻酔下（５、７）
（以下、同様）
で、心エコー装置を用いて適切なレベルで心機能（LVEDD、LVESD、EF、FS、LVPW、IVS 等）
を測定・算出（５、６、７）する（前値）。・開胸し、予備試験１の結果等で当センターが決定した部位で冠血管を結紮する。注：致死性の不整脈を抑制するために、塩酸アミオダロン（５、７）あるいはリドカイン（１）を
虚血前に投与しても良い。また、冠結紮により不整脈が生じた場合はリドカインを投与しても良い。心室細動が生
じた場合は電気的除細動を行う。なお、電気的除細動により心臓に明らかな障害が見られると試験実施者が判断した場合
は、試験例から除外する。 ※塩酸アミオダロンについては、受託者内でマイクロミニブタへの投与実績があればニ
コランジルを代用することができる。その際は、当センターの承認を得ること。・結紮 2 時間後（閉胸後）に心エコー装置で心機能を測定する（虚血後 2 時間値）。・心機能測定後ただちに媒体群あるいは化合物 X（低用量、中用量、高用量のいずれか）の静
脈内持続投与を開始する（2 週間連続持続投与）。なお、媒体及び化合物 X は、少なくとも 1 日に 1 回以上、新規あるいは新規に調製した溶液
と交換する。・最終投与（冠結紮から 2 週間後）終了前に採血し、血漿 2.5ml を-70℃以下で凍結保存する。試験終了後、当センター又は当センターが指定する研究施設に送付する。（当センター以外
の研究施設に送付する場合は、別途協議とする）・媒体あるいは化合物 X 投与終了前に、適切な麻酔下で心エコー装置を用いて心機能（同上）
を測定する（虚血後 2 週間値）。・冠結紮から 4 週間後、適切な麻酔下で心エコー装置を用いて心機能（同上）を測定する（虚
血後 4 週間値）。・心機能を測定後、開胸し、心停止後心臓を摘出し、氷冷した生理食塩水中へ投入する。房室
間溝に平行（短軸方向）に輪切り標本を作製（3x2 分割）する。その中の 3 切片（心尖部か
ら 1、3、5 番目の切片の両面、計 5 断面）を TTC 染色し、デジタル写真を撮影（５、７）する。
デジタル写真からイメージアナライザー等で梗塞面積／左心室面積を算出（５、７）する。また、梗塞領域の中心線での長さと非梗塞領域の中心線の長さ（３、４）及び梗塞領域と非梗塞
領域の壁厚（５、８）も同様に測定する。注：右心室にも梗塞が及ぶ場合は、梗塞面積（右心室）／右心室面積も算出する。・残りの 3 切片から MTC 染色、免疫染色及び生化学検査のための心筋組織を切り出し（２）、包
埋（パラフィン、OCT compound）または凍結して当センター又は当センターが指定する研究
施設に送付する。（当センター以外の研究施設に送付する場合は、別途協議とする）・以上の手順等については、予備試験１及び２の結果に基づき、両者協議の上で変更すること
ができる。＜化合物 X 投与の計画＞・用量の決定のため、媒体群、低用量群、中用量群、高用量群の 4 群について、上記試験を完
成例が各群 2 例得られるように実施する。注：各用量について、3 例（化合物 X を投与した例）以上実施しても完成例が 2 例確保でき
ない場合であって、両者協議の結果、化合物 X に原因があると当センターが判断した場
合は、それまでに得られた完成例で評価する。・当センターは、低用量群、中用量群、高用量群の中から、追加検討すべき 1 群を選択する。・選択された化合物 X 投与群 1 群と媒体群について、完成例が各 4 例得られるように追加実施
する。注：5 例（化合物 X を投与した例）以上実施しても完成例を 4 例確保できない場合であって、
両者協議の結果、化合物 X に原因があると当センターが判断した場合は、それまでに得
られた完成例で評価する。＜統計解析＞（１）4 週目の梗塞面積／左心室面積の媒体投与群と化合物 X 投与群の比較（２）4 週目の梗塞領域及び非梗塞領域の壁厚の媒体投与群と化合物 X 投与群の比較（３）4 週目の心機能（LVEDD、LVESD、EF、 FS 等）の媒体投与群と化合物 X 投与群の比較（４）4 週目の梗塞領域の中心線での長さ／左心室の中心線での長さの媒体投与群と化合物 X 投
与群の比較（５）心機能（LVEDD、LVESD、EF、FS、 LVPW、 IVS 等）の経時的な変化と各時点での媒体投与
群と化合物 X 投与群の比較（６）その他、本試験前に両者で合意した項目＜適応基準＞なし＜略語＞ LVEDD：左室拡張末期径 LVESD：左室収縮末期径 EF：駆出率、 FS：左室内径短縮率 LVPW：左室後壁厚 IVS：心室中隔厚 MTC 染色：マッソントリクローム染色 TTC 染色：トリフェニルテトラゾリウムクロライド染色＜試薬等＞・化合物 X は約 1.5g を当センターから供給する。・その他の試験実施に必要な試薬等については受託者が調達すること。＜参考文献＞（１）Huang Z et al.: Ligating LAD with its whole length rather than diagonal branches as coordinates is more advisable in establishing stable myocardial infarction model of swine. Exp Anim. 2010;59(4):431-9. （２）Li X et al.: Intramyocardial Injection of Pig Pluripotent Stem Cells Improves Left Ventricular Function and Perfusion: A Study in a Porcine Model of Acute Myocardial Infarction. PLoS One. 2013;8(6):e66688. （３）Takagawa J et al.: Myocardial infarct size measurement in the mouse chronic infarction model: comparison of area- and length-based approaches. J Appl Physiol. 2007;102(6):2104-11. （４）Chen CH et al.: Injection of autologous bone marrow cells in hyaluronan hydrogel improves cardiac performance after infarction in pigs. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2014;306(7):H1078-86. （５）Chua S et al.: Intra-coronary administration of tacrolimus markedly attenuates infarct size and preserves heart function in porcine myocardial infarction. J Inflamm (Lond). 2012;9(1):21. （６）Hasegawa H et al. Cardioprotective effects of granulocyte colony-stimulating factor in swine with chronic myocardial ischemia. J Am Coll Cardiol. 2006;47(4):842-9. （７）Yang CH et al.: Effect of tacrolimus on myocardial infarction is associated with inflammation, ROS, MAP kinase and Akt pathways in mini-pigs. J Atheroscler Thromb. 2013;20(1):9-22. （８）Sheu JJ et al.: Six-month angiographic study of immediate autologous bone marrow mononuclear cell implantation on acute anterior wall myocardial infarction using a mini-pig model. Int Heart J. 2009;50(2):221-34. （９）Zhao JL et al.: Pretreatment with simvastatin reduces myocardial no-reflow by opening mitochondrial K(ATP) channel. Br J Pharmacol. 2006;149(3):243-9. ４．納入成果物及び納品場所納入成果物納品場所試験報告書大阪府吹田市藤白台５‐７‐１（加工前の試験デー
国立研究開発法人国立循環器病研究センター細胞生物学
タを添付のこと）部なお、納入成果物の詳細については、以下５．のとおり５．納入成果物（試験報告書）・紙媒体 2 部・電子媒体 2 部にて納品すること。・紙及び電子媒体（CD-R、CD-RW 等）により日本語で提供すること。・紙のサイズは、日本工業規格 A 列 4 番を原則とする。・電子媒体に保存する形式は、原則 PDF 並びに Microsoft Office 2007 及びそれより新しいバ
ージョンの Microsoft Office で扱える形式とすること。ただし、当センターが別に形式を定めて提出を求めた場合はこの限りでない。・予備試験１を実施した結果、予備試験２に進むべき結果が得られなかった場合には、予備試
験１に係る試験報告書を最終的な納入成果物とする。・予備試験２を実施した結果、本試験に進むべき結果が得られなかった場合には、予備試験１
及び予備試験２に係る試験報告書を最終的な納入成果物とする。６．検収納入成果物については、適宜、当センターに進捗状況の報告を行うとともに、レビューを受ける
こと。最終的な納入成果物については、５．に記載の全てが揃っていること及びレビュー後の改
訂事項等が反映されていることを当センターが確認し、これらが確認され次第、検収終了とする。また、以下についても遵守すること。（１）検査の結果、納入成果物の全部または一部に不備不合格品を生じた場合には、受託者は直ち
に引き取り、必要な修復を行った後、当センターの承認を得て、指定した日時までに修正が
反映された全ての納入成果物を納入すること。（２）納入成果物に規定されたもの以外にも、必要に応じて提出を求める場合があるので、作成資
料を常に管理し、最新状態に保っておくこと。（３）当センターが検査を行った結果、不適切と判断した場合は、当センターの指示に従い遅滞な
く手直しをし、再検査を受け、これに合格しなくてはならない。７．調達の条件（１）本調達の業務遂行にあたって発生した一切の経費については、受託者の負担とする。（２）納品日時は当センターと調整の上、決めること。（３）本仕様における参考使用機器・器具及び参考使用試薬については、参考として記載するもの
であって本調達にあたって、当該製品の使用を強制するものではない。ただし、当該製品以外を使用する場合は、当センターの承認を得ること。（４）受託者は、以下に示す本調達の業務に関する記録及び資料を試験終了後 10 年間保存するも
のとし、10 年経過後の保存資料の扱いについては当センターと協議のうえ決定するものとす
る。本調達の業務に関する記録及び資料とは、試験計画書、被験物質に関する記録、試験系
に関する記録、生データ、最終報告書、当センターの交信記録、その他本調達に関する記録
を示す。８．受託者の条件（１）「個人情報の保護に関する法律」（平成 15 年 5 月 30 日法律第 57 号）を遵守し、個人情報の
適切な管理能力を有していること。（２）動物実験実施場所においては、AAALAC インターナショナル（Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International：国際実験動物管理公認協会）、
HS 財団他の第三者認証を得ていること。（３）入札公告日から過去 5 年間において、動物における心筋梗塞モデルの試験業務の受託経験が
複数件あること。（４）入札公告日から過去 5 年間において、心エコーを用いた心機能の評価業務の受託経験が複数
件あること。（５）従事者のうち、循環器系の薬理に精通した研究者等を配置できること。（６）契約締結後、実験動物倫理に関して、動物実験委員会に提出した動物実験計画書とその審議
結果を提出できること。（７）契約締結後、「動物実験に関する自己点検・評価報告書」を提出できること。９．留意事項（１）契約締結時において、予備試験１、予備試験２及び本試験の金額の内訳（作業毎の工程単価
等の詳細）がわかるものを当センターに提出すること。（２）契約金額の支払い等 ①予備試験１を実施した結果、予備試験２に進むべき結果が得られなかった場合には、（１）
で提出した金額の内訳に記載の予備試験２、本試験に係る費用を支払わないものとする。 ②予備試験２を実施した結果、本試験に進むべき結晶が得られなかった場合には、（１）で提
出した金額の内訳に記載の本試験に係る費用を支払わないものとする。（３）成果物の帰属等本業務において作成・取得されたデータを含む一切の成果物の所有権及び著作権、著作隣接権、
報酬請求権及び二次使用料請求権及び外国における当該権利に相当する権利は、当センターに
帰属する。なお、受託者は著作者人格権を行使しないものとする。また、受託者は、当センターの承諾なしに、本業務により作成された成果物を自ら使用し又は
第三者に利用させてはならない。（４）知的財産等本業務において新たに生じた発明に係る特許権（特許を受ける権利を含む）、その他の知的財
産権（その他の知的財産権を受ける権利を含む）及びノウハウ等に関する権利は、当センター
に属する。（５）再委託受託者は、本業務の全部又は主要部分を第三者に再委託することはできない。本業務の一部を
再委託する場合は、事前に再委託する業務、再委託先等を当センターに報告し、承認を受ける
こと。受託者は、９．留意事項（３）
（４）
（６）を含む本仕様書が定める受託者の責務を再委
託先業者も負うよう、必要な処置を実施し、当センターに報告し、承認を受けること。なお、第三者に再委託する場合は、その最終的な責任を受託者が負うこと。（６）秘密保持守秘義務等については次の事項を遵守すること。 ①本業務に必要な従事者以外は本業務に従事させてはならない。 ②本業務に関して、媒体および手段を問わずに当センターから開示もしくは提供された秘密情
報（以下「本件秘密情報」という）を第三者に対して開示してはならない。ただし、以下のいずれかに該当する情報については秘密情報に含まない。・受託者が当センターより開示を受けた時点で既に公知であった情報・受託者が当センターより開示を受けた時点で既に所有していたことを文書で証明できる情報・受託者が当センターより開示を受けた後に受託者の責によらずに公知となった情報・受託者が正当な権限を有する第三者から適法に入手したことを証明できる情報・受託者が当センターより開示を受けた情報によることなく独自に開発・取得していたこと
を証明できる情報 ③本業務のために必要な従業員がそれ以外の者に本件秘密情報を開示しないよう、厳正な措置
を講じること。 ④本件秘密情報を本業務のみを目的として使用するものとし、他の目的には一切使用してはな
らない。 ⑤当センターの書面による事前の承諾なしに、本業務のため必要な最小限度の範囲を超えて本
件秘密情報を複写または複製してはならない。また、必要に応じて施錠可能な保管庫に格納する等、適正に管理すること。 ⑥当センターから要請がある場合または本業務終了後は直ちに本件秘密情報（複写及び複製し
たものを含む）を当センターに返還または秘密保持上問題のない方法により処分すること。 ⑦受託者が（６）秘密保持の内容に違反したことにより本件秘密情報が漏洩し、当センターに
損害が発生した場合には、当センターに対しその損害を賠償しなければならない。なお、賠償額については、当センターと受託者にて別途協議して定めるものとする。 ⑧（６）秘密保持の内容は、本業務終了後も本件秘密情報が秘密性を失う日まで有効に存続す
るものとする。 ⑨受託者は、秘密保持に係る措置の実施状況について、当センターが定期または不定期の検査
を行う場合には、これに応じること。（７）遵守事項 ①当センターへ納品する電子ファイルは事前にウイルスチェック等を行い、悪意のあるソフト
ウェア等が混入していないことを確認すること。 ②関連法規を遵守すること。 ③受託者は、本業務において取り扱う情報の漏洩、改ざん、滅失等が発生することを防止する
観点から、情報の適正な保護・管理対策を実施するとともに、これらの実施状況について、
当センターが定期若しくは不定期の検査を行う場合においてこれに応じること。万一、情報の漏洩、改ざん、滅失等が発生した場合に実施すべき事項及び手順等を明確にす
るとともに、事前に当センターに提出すること。また、そのような事態が発生した場合は、当センターへ報告するとともに、当該手順等に基
づき可及的速やかに修復すること。（８）契約締結後、速やかに作業場所を当センターに届け出ることとし、当センターの承認を得る
こと。（９）実験動物倫理受託者は、動物の愛護及び管理に関する法律（昭和 48 年 10 月 1 日法律第 105 号）及び動物の
愛護及び管理に関する施策を総合的に推進するための基本的な指針（平成 25 年環境省告示第
80 号）等の法令・基準を遵守し、飼育・試験が行われる動物を適切に飼養・保管するものとし、
動物実験及び飼養管理に携わる者は、動物愛護の精神をもってこれを遵守するものとする。１０．その他本業務は、当センターと十分な協議の上、実施することとし、本仕様書に掲げる事項の他、本業
務遂行のために必要な事項については、当センターと協議することとする。

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