IFN-α1 - 新技術説明会

立命館大学新技術説明会１０
制御性RNAとDDSの一体開発による 抗インフルエンザ予防・治療薬
立命館大学薬学部薬学科教授木村富紀 RITSUMEIKAN1
遺伝子の発現を制御する技術
•  核酸を用いた従来法とその問題点:
リボザイム法、RNA干渉法、アンチセンス
DNAオリゴヌクレオチド法、デコイ核酸法並
びにRNAアプタマー法がある。
これらの方法は、発現の抑制（低下）
のみを可能にする。
RITSUMEIKAN 2
新技術の特徴
•  内因性のアンチセンスRNAを用いるわれわれ
の制御方法は、特定の遺伝子の発現を
seODN (mRNA上の標的配列）により抑制で
きるだけでなく、asORN（アンチセンスRNA機
能ドメイン配列）の使用によりその発現の増強
を可能にする（NATRE technology)。
•  これまで不可能であった双方向性の遺伝子の
発現制御が可能となる点で独創的であり、
従来法にない新規性並びに優位性を有する。
RITSUMEIKAN3
ゲノムからの転写産物の大部分はタンパク質を
コードしない非コードRNAである
ヒトゲノム(ca 3 Gb)
3% (20,687 遺伝子)
ヒトトランスクリプトーム
ENCODE project "
Consortium (2012)
(制御性, 非コードRNA)
90%<
Human genome "
sequencing "
consortium, ʻ03 Protein-coding genes
Rest Rest
Protein-‐coding genes Transcripts
Rest Rest
Transcripts RITSUMEIKAN4
新技術を応用した新規抗ウイルス薬の開発
•  選択毒性に左右されない標的分子の設定。
•  宿主防御免疫応答の利用。
•  防御免疫応答エフェクター発現の人為的な調節。
•  生理的な範囲における発現の早期化と増大。
副作用が少ない汎抗ウイルス薬の開発
5
何故インターフェロン-α1 (IFNA1)遺伝子に着目したか
IFN-α1 mRNA
AUG
208"
452"
BSL
487
487 UAA
AREs
5ʼ
1
An 3ʼ
68"
SL1"
637
SL2"
876
Nuclear export of IFN-α1 mRNA
IFN-!1
1
IFN-α
mRNA
mRNA 352"
BSL!
IFN-!11
IFN-α
mRNA/
mRNA
!SLII
ΔSL2
SL2"
322"
305"
SL1"
229"
434"
308"
IFN-!1
mRNA/
IFN-α
!SLI1
A
C
mRNA
ΔSL1
mRNA
ΔBSL
B
CSS
RITSUMEIKAN 6 IFN-!1
mRNA/
IFN-α
1
!bulge
D
Kimura et al., J.Cell Sci., 2004
Kimura et al., Med.Mol.Morp.,2010
Matsui, Kimura et al., Hepatology, 2008
ヒトInterferon-α1 antisense RNA (IFN-α1 AS)の同定
IFNA1
SeV"
Infection -
1
+
+
-
+
IFN-α1 !
AS"
RNA
+
+
+
BSL
876/ 0
-242
SL1" SL2"
28S
18S
IFN-α1 !
mRNA
100 nt
IFNA1�
5ʼ
CDS
5’
3ʼ
3’Probe (200 nt x 4)
Northern-blot analysis
Genomic location of IFN-α1 !
AS exons センスオリゴヌクレオチド (seODNs) によるIFN-α1 AS発現の抑制
IFN-α1 mRNA S4"
AAA
IFN-α1 AS
S3"
Sense ODN
S2"
RNase HによるIFN-α1 AS発現の抑制
S1"
Time after
transfection
Nc2"
S1
S2
S3
S4 Nc1 Nc2
hr"
IFN-α1 AS
18S rRNA
Nc1"
RT-minus
RITSUMEIKAN8 IFN-α1 AS発現抑制が同mRNA発現に及ぼす効果 IFN-α1 mRNA (fold)
Time after SeV infection (hr) 1.25
12 13 14 15 16 17
KD(-)/18S KD(+)/18S 1.00
0.75
5.1hr
0.50
0.25
0
0.9hr
KD(-)/mRNA KD(+)/mRNA 1
2
3
4
5 0
Actinomycin D treatment (hr)
T1/2 of IFN-α1
mRNA (<80% )
IFN-α1 mRNA 発現レベルの低下
RITSUMEIKAN9 IFN-α1 AS の過剰発現が同mRNA の発現に及ぼす効果 Control
876
0
IFNA1
1
3
6 12 24 0
1
3
Time after inf.
6 12 24
IFN-α1 AS IFN-α1 mRNA (fold)
ATG
CMV pro
AS over-expression
1.4
1.2
Over-expression(+)/ 18S Control/ 18S 1.0
0.8
8.1 hr
0.6
2.8 hr
0.4
Over-expression(+)/ mRNA
0.2
0
Control/ mRNA
0
1
2
3
4
5
Actinomycin D treatment (hr)
T1/2 of IFN-α1 mRNA (290%
)
IFN-α1 mRNA 発現レベルの増大
RITSUMEIKAN10 mRNAを安定化するIFN-α1 AS機能ドメインの決定
Overexpression of truncated IFN-α1 AS mutants
Cont
AREs 5ʼ"
AUG CSS+R"
UAA ED7R"
IFN-α1 "
AS
CSSR"
CSS SL2R"
BSLR!
SL2 BSL 0"
1"
2"
3"
4"
Relative IFN-α1 mRNA "
expression (fold)"
IFN-a1 AS
5ʼUTRR
5'UTRR
3ʼUTRR"
3'UTRR
DSR"
DSR
DS
3ʼ"
mRNAR"
Cont
DS
Cont"
0
1
2
3
4
0"
1"
2"
3"
4"
Relative IFN-α1 mRNA "
expression (fold)"
IFN-α1 AS BSLR ドメインが IFN-α1 mRNA の安定性制御
のための中心領域である
RITSUMEIKAN11 25塩基長のBSLR塩基配列からなるアンチセンスリボオリゴヌクレオチド
(asORN)は全長のAS RNA と同程度にIFN-α1 mRNAの発現量を増加する
IFN-α1 mRNA
AAA asORN (corresponding to BSLR)
IFN-α1 AS
"
15
322
229"
"
IFN-α1 AS (fold)
asORN
10
5
208"
30
0
5
10
15 20 25
2.3 fold
increase
20
asORN
10
ncORN
mock
0
0
ncORN"
IFN-α1 mRNA
40
IFN-α1 mRNA (fold)
352
0
5
10
15
20 25
Time after SeV infectin (hr)
RITSUMEIKAN12 想定される用途
【アンチセンスリボオリゴヌクレオチド】 • 
現行INF製剤では適応がなく、又抗ウイルス薬が
存在しない呼吸器ウィルス感染症の治療： 1.コロナウイルス、パラインフルエンザウイルスやRSV
による乳幼児冬期感冒
2.ライノウイルスやコロナウイルス等による風邪症候群等
３.抗ノイラミニダーゼ阻害薬抵抗性のインフルエンザ
ウイルスによるインフルエンザ
【センスリボオリゴヌクレオチド】 •  IFN-αの過剰産生に起因する自己免疫疾患（SLE、
皮膚筋炎等）
RITSUMEIKAN13
ここ迄の発表に関わる知的財産権
•  発明の名称：インターフェロン-αモジュレーター
•  出願番号
：特願2011-536201
•  出願人
：学校法人立命館、
学校法人関西医科大学、
株式会社アミノアップ化学
•  発明者
：木村富紀、西澤幹雄、蒋時文、
西川正雄
発表論文： Kimura et al., CMLS 70 (8):1451-67, 2013)
この発明は、ヒトIFN-α1 ASを用いて。ヒト細胞で証明。
RITSUMEIKAN14
実用化に向けた課題
•  POC実験：asORN効果の生体内における検証
•  インフルエンザウイルス感染動物モデルの構築
•  DDSの開発
RITSUMEIKAN15
モルモット感染モデルの採用
モルモット
• 機能性のMx1遺伝子を持つので、IFN-αによる
刺激応答、抗ウイルス効果を生体レベルで検討
できる。
• インフルエンザに罹患しても死亡せず、感染を
水平伝播するため、実験結果をヒトに外挿可能
である。
マウス
• Balb/c やC57BL/6等のマウスはIFN-α
刺激応答遺伝子の主体となるMx1遺伝子が
変異している。IFN応答を解析できない。
・インフルエンザウイルスに感染すると死ぬ。
RITSUMEIKAN16
モルモット感染モデル：IFN-α1遺伝子の特定 •  モルモットIFNA1遺伝子候補の選択
•  候補遺伝子が示す抗ウイルス効果の検証
•  モルモットIFNA1遺伝子の決定(DDBJ/ EMBL/
GenBank accession number, AB671739)
RITSUMEIKAN17
モルモットIFN-α1 mRNA共通二次構造の選択 •  mfoldを用いたモルモットIFN-α1 mRNAの二次
構造予測
•  自由エネルギー(ΔG)の低い10の予測二次構造
中に最大の保存度が見られた構造（○）の選択。
RITSUMEIKAN
RITSUMEIKAN 18
モルモットセンスオリゴヌクレオチド (seODN)の決定 •  mRNA共通二次構造から一本鎖領域を選択
•  AS RNAの標的候補とし、その塩基配列を持つ
センスオリゴ(S2-S5)を作製
RITSUMEIKAN
RITSUMEIKAN 19
seODNによるモルモットIFN-‐α1 AS RNA発現抑制実験
IFN-α1 mRNA AAA
IFN-α1 AS
seODN
RNase HによるIFN-α1 AS発現の抑制
• S4はヒトと同じく、IFN-α1 AS RNA発現を最大
値に到達後、低下させた • S3は、IFN-α1 AS RNA、mRNAを共に経時的
に増加させた
RITSUMEIKAN 20
モルモットアンチセンスリボオリゴ (asORN)の作製
•  IFN-α1 AS RNAに対し異なる作用を示すseODNを得たので、
これに対応するasORNを作製し、mRNA発現への影響を検討
した。
RITSUMEIKAN 21
モルモットasORN過剰発現実験
• asORN4はAS RNAに影響することなく、gpIFN-α1 mRNA
の発現を増加させた
• asORN3はgpIFN-α1 AS RNAを増大させることにより、同
mRNAを増加させた
RITSUMEIKAN 22
DDSの開発
ホソカワミクロン株式会社開発DDSナノ粒子へのasORN3
封入至適条件の検討
•  ヒトA 型インフルエンザウイルスを感染させたモルモット胎
児線維芽細胞において、対照として用いた市販の遺伝子
導入試薬（MATra; IBA GmbH)を上回るIFN-α1 mRNAを
発現誘導する、asORN3量、PLGAナノ粒子作製条件、
asORNの封入条件を至適化した。
RITSUMEIKAN 24
POC実験：asORN効果の生体内
における検証
ヒトインフルエンザウイルス感染モルモット気道において
asORN3が示す抗ウイルス効果 •  ヒトA型インフルエンザウイルスを感染させたモルモットにおい
て、投与量に依存して、IFN-α1 mRNA発現量の増大とウイル
ス力価の低下を観察した。
RITSUMEIKAN 26
asORN3投与はモルモット直腸温度その他の副作用指標に
影響を示さない
•  ヒトIFN-αタンパク質投与に伴い観察される発熱、自己免疫疾患様
症候の出現の有無を検討したところ、asORN3の投与により、直腸温度、
体重、脾臓重量に変化は認めなかった。
RITSUMEIKAN 27
産学連携の経歴
•  2007~2011年 JST A-‐STEPフィージビリティスタディ、シーズ発掘事業に採択（３回） •  2013~2014年 JSTシーズ顕在化タイプ事業に採択課題名：制御性RNAに由来する核酸医薬シー
ズとDDSの一体開発による抗インフルエンザ予
防・治療薬の創出（ホソカワミクロン株式会社と
の共同研究） RITSUMEIKAN 28
企業への期待
•  POCを終了した本創薬シーズを前臨床試
験により検証するべく、JST A-STEP ス
テージII 産学共同促進ステージハイリスク
挑戦タイプに共同申請する企業を求めます。
•  自然免疫調節性核酸医薬の前臨床開発を行う
のみならず、任意の標的遺伝子の発現制御を
可能にする塩基配列の探索・提供が可能です。
RITSUMEIKAN29
前臨床試験
RITSUMEIKAN 30
本技術に関する知的財産権
•  発明の名称：呼吸器ウイルス感染症の予防・治療剤
•  出願番号：準備中
•  出願人：学校法人立命館、
ホソカワミクロン株式会社
•  発明者：
木村富紀、辻本広行、塚田雄亮
お問い合わせ先
立命館大学研究部リサーチオフィス (BKC)
産学官連携コーディネーター押柄和幸
ＴＥＬ: 077-561-2802 ＦＡＸ: 077-561-2811
e-mail:coor-024＠st.ritsumei.ac.jp
RITSUMEIKAN32

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