ミトコンドリア温度負荷による保存肝エネルギー生成能

●原著
口lIIlllIlIIlllIlI四llIllII悶lll帥1111整ll）11t1111111111111111bllllI巳lll帥111tlitt！llll帥胆日llI帥MllilllVINHIIIIIUI脚11bllIlIi帥1けll闘illtl乙111S闘1叶1時IIl囲OlllMll“f“iMMtlllMlt…tllStHIHIIIIilMlllMIUIIIIIllIIItltlll）t川11111111■1）lMtlll「tTltlMIMIIIHlItlllttttHlMIHM
ミトコンドリア温度負荷による保存肝エネルギー生成能の検討
博二
研
博條山
義南小
沼明孝
浅秀
勤藤野
安斎
藤進聡
川田
面柴
佐
Influence　of　Heat　Leading　on　the　Energy　Production　of　lsolated　Mitochondria
from　Preserved　Liver
Tsutomu　Sato，　Yoshihiro　Asanuma，
Susumu　Omokawa，　Hideaki　Andoh，　Hiroshi　Nanjo，
Satoshi　Shibata，　Takashi　Saito，　Kenji　Koyama
1）ゆ0ア勿￠ent　of　Surgery，ノlkita乙Xniv〃si砂School（ゾMediciηe
［Summary］
Functional　reserve　of　energy　production　of　the　liver　preserved　in．　cold　EC　solution　and　UW
solution　was　studied　by　heat　loading　of　isolated　mitochondria．　Mitochondrial　function　of
preserved　liver　significantly　decreased　after　24　hours　of　preservation　both　in　EC　solution　and
UW　solution．　Mitochondria　isolated　from　preserved　liver　were　incubated　in　water　bath　at　400C
for　8　minutes．　lt　was　apparent　that　mitochondria　of　the　liver　preserved　in　EC　solution　for　over
12　hours　were　more　fragile　than　those　of　the　liver　immediate　after　procurement，　while
mitochondria　of　the　liver　in　UW　solution　for　over　24　hours　were　more　fragile．　The　functional
reserve　of　hepatic　energy　production　can　be　detected　easily　by　heat　loading　of　isolated
mitochondria　and　the　viability　of　preserved　liver　can　be　evaluated　more　properly．
Key　words　：　Liver　preservation，
Heat　loading　of　mitochondria，
UW　solution，
Mitochondrial　function
（UW）液に低温浸漬保存した肝組織から分画したミト
Lはじめに
コンドリアに温度負荷1）を加え，負荷条件下でのミト
移植肝の血流を再開すると，肝には無三期に体液中
コンドリア機能の変化から保存肝エネルギー生成能を
に蓄積したアンモニア，エンドトキシンなどの毒性物
より詳細に検討した．
質をはじめ，アシドーシス，輸血，肝血流障害など様々
II．対象と方法
な負荷がかかる．移植肝の生着は，これらの負荷に肝
がいかに耐えうるかに依存していると考えられる．そ
1）実験動物．及び肝保存方法
こで，Euro－Collins（EC）液，　University　of　Wisconsin
実験動物は，体重250g前後のWistar系雄性ラット
秋田大　第1外科
（1991・11・25受領）
（1992・2・28受理）
30匹を用いた．ラットをエーテル麻酔下で開腹し，門
脈から18Gの血管内留置針を挿入し，流速20　ml／
min，灌流圧10　cmH20以下の条件で0℃の乳酸加リ
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334
移植（Vol．27　No．3）
ンゲル液20　mlを灌流しながら肝を摘出した．摘出し
III．成　績
た肝を0℃のEC液あるいはUW液30　mlで灌流し，
0℃の同保存液中に浸漬保存した．肝摘出直後，保存
1）EC液，　UW液保存肝ミトコンドリア機能
6，12，24，48時間後に肝を0℃のうクトリンゲル液20
低温浸漬保存肝組織から分画したミトコンドリア機
m1で灌流して保存液をwash　outした後，ミトコンド
能は，EC液保存では表1のごとく保存24時間から各
指標が低下し，ATP生成能でみると24時間，48時間
リア機能を測定した．
2）ミトコンドリア機能の測定法
には摘出時のそれぞれ76％，34％と有意に低下した．
上記の保存肝組織からHogeboomの方法2）に準じ
UW液保存では，　EC液と同様に24時間以降ミトコン
てミトコンドリアを分画し，実験に供した．ミトコン
ドリア機能が低下し，ATP生成能は24時間，48時間
ドリア機能の測定3）は，0．2Mコハク酸（pH　7．4）を基
には摘出直後のそれぞれ77％，67％と有意に低下し
質として，反応液に約2mgの蛋白に相当するミトコ
ンドリアを加えて，Clark型酸素溶媒濃度記録計（Gil－
た．EC液とUW液とを比較すると，保存24時間まで
は両者に差を認めないが，保存48時間でUW液が有
son，　Oxygraph，　mode15／6）を用いて行った．　Chance
意に高値であった．
の定義に従いState　1～5までを記録し，呼吸調節比
2）温度負荷による保存肝ミトコンドリア機能の変
（RC），　ADP／0比（P／0），　State　3酸素消費量（S3），
化
ATP生成能を算定した．反応終了時に反応槽内溶液
分画したミトコンドリア懸濁液を40℃，8分間
の蛋白量を色素結合法（Biorad，　protein　assay）4）で測
定し，ミトコンドリア蛋白量とした．
incubationすると，懸濁液中のpHは7．42から7．29
に低下し，懸濁液中の酸素分圧は，117mmHgから0．4
3）ミトコンドリアの温度負荷法
㎜Hgまで低下した．また，懸濁液中の蛋白量には変
分画したミトコンドリア懸濁液を，40℃の恒温槽に
化がなかった．
8分間incubationすることにより，分離ミトコンドリ
40℃，8分間の温度負荷により，ミトコンドリア機
アに温度負荷を加えた．温度負荷終了後，ミトコンド
能の各指標は低下したが，その低下率は，EC液保存肝
リア機能を測定し，各指標の負荷前に対する負荷後の
値を％で表した．また，incubation前後でミトコンド
では図1のごとく12時間からRC，　P／0及びATP生
成能が有意に増大した．温度負荷前に対するATP生
リア懸濁液内のpH，　PO2，　PCO2，蛋白量を測定した．
成能の保持率は，12時間保存で54％，24時間で53％，
48時間では温度負荷により呼吸能は消失した．
表1保存肝組織ミトコンドリア機能
Preservation
RC
S3
P／0
Time（hr）
@　Solution
0
6
12
24
48
ATP　Production
inAtoms／mg／min） inmoles／mg／min）
EC
3．73±0．2
1．62±0．1
162．7±19，8
265．2±32．4
UW
3．66±0ユ
1．56±0．1
144．2±8．5
231．7±17．3
EC
4．09±0．2
1．57±0．1
154．2±14．9
242．2±24．4
UW
3．79±0．1
1．58±0．1
143，4±3．9
227．4±7．4
EC
3．53±0．3
1．52±0．1
140．0±7．8
212．8±13．4
UW
3．73±0．1
1．56±0．1
149．2±13．1
232．3±23．3
EC
3．08±0．1＊
1．46±0．05＊
138．6±13．5
203．0±18．8＊
UW
2．75≠0，4＊
1．36±0．1＊
134．0±10．0
179．5±27．0＊
EC
翻：ll〕※
1：ll圭1：ll〕※
tW
98．5±5．4＊
雛11：ll〕
P14．4±15．2＊
＊　p〈O．05　compared　with　pres．　time　Ohr
Xp〈0．05　between　EC　and　UW　solution
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335
佐藤・ミトコンドリア温度負荷による保存肝エネルギー生成能の検討
（－
盾処
＊
60一
40一
20・
＊
o
6
0
servation
12　24　48　time
6
6
・　Preservat！on
24
12
S㌦） tirne
（hr）
（90）
（qo）
100 OloChanges　of　ATP　Synthesis
OloChanges　of　P／O
1
80
80
00
co
，　Preservation
time
20
o
6
＊
＊
＊
60
o
T
80・
＊
殉oo8060⑳20
o
％Changes of S3
％）
Olo　C　hang　es　of　R　C
40
20
＊
122448閣lt’on　O　6　122448鴨留。n
伽）　侮）
＊　p〈O．05
図1温度負荷によるミトコンドリア機能の変化（EC液保存）
％）
（％）
1@　％Changes　of　RC
oひ
笏
W0
〒
U0・
S0・
Q0
0
0　6　12　24　48
撃盾潤E
i％oo／　，　O／oChanges　of　ATP　Synthesis
80
S20
40・
20・
0
0
，
6
Preservation
24
12 ／／”．一”v”　v　o　6　12　24　48
48
＊
60
60・
＊
＊
＊
80
48
time
（hr）
tirne
伽）
％Changes ofP10
（％）
Preservation
Preservation
Preservation
（hr）　trme
（hr）
＊pく0．05
図2
温度負荷によるミトコンドリア機能の変化（UW液保存）
一方，UW液保存肝では，図2のごとく24時間以降
P／0ならびにATP生成能の低下率が有意に増大し
た．温度負荷前に対するATP生成能保持率は，12時
間65％，24時間53％，48時間49％であった．すなわ
ち，EC液保存肝では12時間以降，　UW液保存肝では
24時間以降に，温度負荷に対するミトコンドリアの抵
抗性が減弱していた．
IV．考　察
肝移植において，移植肝の生着は肝の保存状態のみ
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336
移植（VoL　27　No．3）
ならず，肝が血流再開後にかかる様々な負荷にいかに
ともに保存24時間以降低下した．
耐えうるかに依存している．また，低温浸漬保存に伴
2）温度負荷によるミトコンドリア機能の変化を検
う低酸素状態により肝エネルギー代謝の中心であるミ
討した結果，EC液保存では12時間から，　UW液保存
トコンドリアが不可逆的障害をうけると，血流再開後
では24時間から，負荷に対するミトコンドリアの抵抗
に肝は十分なエネルギー供給をできずに機能不全に陥
性が減弱していた．
る5・6）．そこで，ミトコンドリアに簡便でかつ再現性が
文　献
高い方法である温度負荷1）を加えて，その機能の変化
から，保存肝エネルギー生成能の予備力について検討
1）大内慎一郎：温度負荷後の肝ミトコンドリア機能
した．元来，ミトコンドリア機能の測定7）は，至適温度
からみた肝予備能の新しい評価法．秋田医学16＝
下で十分なエネルギー基質と酸素の存在下でのエネル
271・一・282，　1989
ギー生成能をみるものであり，その結果はミトコンド
2）　Hogeboom　GH，　Schneider　WC　：　lsolation　of
リアが至適環境下で働きうる潜在的能力を表現してい
intact　mitochondria　from　rat　liver．　J　Biol　Chem
る。その一方，ミトコンドリア機能は，ショック8｝，エ
172　：　619r－635，　1945
ンドトキシン9），アシドーシス10），低酸素11）などにより
3）　Koyama　K，　lto　K，　Ouchi　K，　Sato　T　：　Mitochon－
低下することが明らかにされており，分画したミトコ
drial　function　of　rat　liver　in　biliary　obstruction．
ンドリアをこのような負荷の加わる異常環境下におく
Tohoku　J　Exp　Med　131：59－v69，　1980
ことにより，ミトコンドリア自体の障害をより鋭敏に
4）　Bradford　MM　：　A　rapid　and　sensitive　method
反映させることが可能になると考えられる．
for　the　quantitation　of　microgram　quantities　of
保存肝組織から分画したミトコンドリアの機能は，
protein　utilizing　the　principle　of　protein－dye
EC液，　UW液ともに保存24時間以降に低下した．両
binding．　Anal　Biochem　72　：　248－v254，　1976
保存液の差は24時間までは認められず，48時間に至
5）　Lambotte　L　：　Liver　preservation．　ln　：　Basic
りUW液が良好な結果が得られた．これは保存24時
concepts　of　organ　procurement，　perfusion　and
間から48時間にかけてUW液では細胞内器官の障害
が比較的緩徐に進行するのに対し，EC液では細胞浮
preservation，　for　transplantation．　Toledo－Per－
腫による細胞内器官の破壊が進みミトコンドリア自体
：　pp．　225・N・257
の器質的障害も高度になるためと考えられる．一方，
eyra　LH　（ed）．　New　york　：　Academic　Press　1982
6）　Kono　Y，　Ozawa　K，　Tanaka　J，　Ukikusa　M，
負荷に対するミトコンドリア機能の抵抗性は，EC液
Takeda　H，　Tobe　T　：　Significance　of　mitochon－
保存では12時間から，UW液保存では24時間からそ
drial　enhancement　in　restoring　hepatic　energy
れぞれ減弱しており，保存12時間から24時間にかけ
charge　after　revascularization　of　isolated　is－
てのEC液，　UW液両者のエネルギー生成能における
chemic　liver．　Transplantation　33　：　150tv155，
相違が明らかになった．すなわち，EC液保存12時間
及び24時間では，至適条件下でのミトコンドリア機能
1982
の測定では明らかにならなかったミトコンドリア自体
polarography　to　mitochondrial　respiration．　Bio－
の器質的障害がUW液保存に比較して進行している
chin　Biophys　Acta　46　：　134－v142，　1961
ものと考えられる．また，この結果は，EC液保存12時
7）　Hagihara　B　：　Techniques　for　the　application　of
8）　Donohoe　MJ，　Rush　BF，　Machiedo　GW，　Barillo
間以降，UW液保存24時間以降では，移植肝に負荷が
DJ，　Murphy　TF　：　Biochemical　and　morphologic
かかるとエネルギー生成能が低下しやすく，移植肝と
changes　in　hepatocytes　from　the　shock　injured
しての適性を欠いていることを示唆している．ミトコ
liver．　Surg　Gynecol　Obstet　162　：　323－v332，　1986
ンドリア温度負荷により，負荷に対するエネルギー生
9）　Mela　L，　Bacalzo　LV，　Miller　LD　：　Defective
成能の予備力を容易に推定でき，移植肝としての適性
oxidative　metabolism　of　rat　liver　mitochondria
をより的確に判断しうると考えられた．
in　hemorrhagic　and　endotoxin　shock．　Am　J
Physiol　252　：　362・”一368，　1987
V．結　語
10）　Tobin　RB，　Mackerer　CR，　Mehlman　MA　：　PH
1）保存肝組織ミトコンドリア機能は，EC液UW液
effects　on　oxidative　phosphorylation　of　rat　liver
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佐藤・ミトコンドリア温度負荷による保存肝エネルギー生成能の検討　337
mitochondria．　Am　J　Physiol　233　：　83・一v88，　1972
short　term　anoxia．　Am　J　Physiol　252　：　349－v355，
11）　Aw　TY，　Anderson　BS，　Jones　DP　：　Suppression
1987
of　mitochondrial　respiratory　function　after
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