人間科学研究 Vo1．18，Supplement（2005） 博±論文要旨 トランスクリプトーム解析に基づくマウス体内時計出力機構の解明 Identification ofCircadian C1ock OutputMechanismBased on TranscriptomeAna1ysis inMouse 南陽一（Minami，Yoichi） 指導：柴田 重信教授 序論 線溶系活性の変化等がいわれる。実際ヒトの線溶系の活性 生命現象には様々な周期性が観察され、1日を基準とし には日内変動が知られている。発現解析及びプロモータ解 てそれより短い周期のものをウルトラディアンリズム、長 析から肋ノー！が時計制御下遺伝子だとする報告がされた い周期のものをインフラディアンリズム、1日周期のもの （Maemura θf∂五， 2000，Journa1of Biologica1 を日周リズムと呼ぶ。もっとも研究されているのは日周リ Chemistry）。肋〃が体内時計に転写レベルで制御される ズムで、外界からの時刻情報に依存しない内在一1生の日周リ ために体内時計が標的生理機構の振動を作り出していると ズムを概日リズム、概日リズムを駆動する機構を体内時計 いう考えである。このような体内時計の振動を特定の生理 という。体内時計の中枢は視交叉上核（SCN）と呼ばれる 機構に伝える役割を持つ遺伝子を、本稿では出力遺伝子 神経核に存在するが、分子レベルで体内時計を構成する時 （out−put gene）と定義した。 計遺伝子はSCNのみならず肝臓や心臓など末梢組織でも 本章では生体内で月∂ノー1が時計遺伝子の制御下に振動す 振動し、さらにRat−IやNIH／3T3といった株化細胞でも振 るか確認した。月∂ノー1が時計制御下遺伝子ならば時計遺伝 動する。時計遺伝子はE−box（CACGTG）を介した転写調 子の振動が失われた場合に肋〃の振動も消失すると考え、 節（促進性のBMALL CLOCK，抑制性のPERl−2，CRY1− 2，DECl−2）を中心に、REV−ERB／ROR応答領域（RRE； αoo火遺伝子の点突然変異により時言十遺伝子の発現リズ ムが平坦化するαoo火マウスにおける肋〃発現を検討し ［A／TlAlA／T1nT［A／G1GGTCA）を介した調節（促進性の た。また肋ノー1遺伝子の発現位相が時計遺伝子発現に依存 RORα，抑制一性のREV−ERBα）、DBP応答領域（D−box； して変位するか、末梢組織の時計遺伝子の発現位相を変位 TTA［C／TlGT＾）を介した調節（促進性のDBP，抑制性の させる制限給餌法（継続的に一日の一定時刻のみ餌を与え E4BP4）によって、転写制御に基づく動的で複雑なネット る）を行い、遺伝子発現パターンを検討した。 ワーク構造を成す。時計遺伝子でなぐとも時計遺伝子の結 （結果と考察）明暗条件下（明期、暗期とも12時間）で6 合領域をもつ遺伝子があり、これを蒔計制御下遺伝子 時間ごとに4点マウス心臓を採取してRT−PCR法による発 （c1ock contro11ed gene）と呼ぶ。本稿では、末梢組織に 現解析を試みた。野生型では、既韻どおり時計遺伝子発現、 おける時計制御下遺伝子の解明を試みた研究を展開する。 肋ノー！遺伝子発現に周期性が観察された。．αoo火マウスで 前半では、線溶系の概日リズムを扱い、体内時計が線溶系 は時計遺伝子の発現振動が減弱・消失し、肋〃遺伝子の を制御する機構に関して検討した。後半では、DNAチップ 発現振動も消失した。光の影響を除くため恒常暗条件下で を使ったトランスクリプトーム解析を行い、白色脂肪組織 も実験を行い、同様の結果を得た。次いで通常夜間に餌を での発現振動を示す遺伝子（振動遺伝子，CyCling gene） とるマウスに、日中の固定した4時間（ZeitgeberTime の包括的取得を試みた。また、振動遺伝子が時計によって 5−9；ZeitgeberTime12が光のオンセット）のみ餌を提示 直接制御されているか、ゲノムワイドな時計遺伝子結合領 するスケジュールを繰り返す制限給餌法を試みた。野生型 域の探索と検証を行った。 では給餌時刻に依存して時計遺伝子発現位相が変化し、 肋ノー！遺伝子発現も同様に位相変位した。以上から肋ノー1が 第一章 出カ遺伝子としての胎〃 時計制御下遺伝子である可能性が支持された。肋ノー！が時 （序）線溶系は血管を閉塞し血栓症へと導くフィブリンを 計制御下に線溶系の振動を生み出す（出力遺伝子として機 溶解する機構である。プラスミノゲンを活性化してフィブ 能する）ことに加え、制限給餌法により遺伝子発現位相を リンを溶解するプラスミンにするのが組織型プラスミノゲ 変えられたことは、食事時刻の変更という人為的な操作で ンアクチベータ（tPA）であり、プラスミノゲンアクチベー 標的生理機構を任意の「時刻」に調節できることを意味し、 タインヒビター1（PAI−1）はtPAを不活化することで活 適切な時刻に適切な施療を目指す時間薬理学的観点から重 性を抑制する。 要な知見だった。 循環器系疾患には発症しやすい時刻があり、原因として αoo火マウスでも制限給餌法を試みたところ、心臓の時 一g3一 人間科学研究 Vo1．18，Supp1ement（2005） 計遺伝子発現に給餌時刻に依存したリズムが形成された。 プの結果と類似していたのでDNAチップの結果が妥当だ これは制限給餌性リズム形成にαoo火遺伝子が関与しな と結論した。今回の時系列を追ったトランスクリプトーム いことを示した初の知見であった。CLOCKが機能しなく 解析は、白色脂肪組織が動的な組織であることを再提示と、 ても時計遺伝子の振動が生み出された理由としては NPAS2による代償作用が考えられた。NPAS2はSCN以外 従来の定点の遺伝子発現プロファイルを補完するデータを 供する意義があった。 の部位で発現振動し、制限給餌性リズムのようなSCN非依 得られた振動遺伝子に対する時計遺伝子結合領域の探索 存性リズム形成に関与する可能性がある（Minamiθ〆∂1， を行った。公開されているゲノム情報から、マウスの振動 FEBS Lett，2002）。 遺伝子の1Okb上流を含む遺伝子配列及びヒトでの相同遺 伝子の10kb上流を含む遺伝子配列を取得し、比較から進化 第二章 白色脂肪組織における出カ遺伝子の包括的探索 的保存領域を抽出した。得られた領域に対し時計遺伝子に （序）ヒトゲノム計画など種々の生物のゲノム解読計画が よる制御配列（E−box，D−box，RRE）の存在の有無を検 進展した結果、全遺伝子を対象とした包括的研究が可能に 索した。この結果、95遺伝子にE−box該当配列、27遺伝子 なった。この代表的研究手法に転写単位でおきる現象を全 にD−box該当配列、33遺伝子にRRE該当配列を見出した。 て捉えようというトランスクリプトーム解析がある。体内 この中には細胞外マトリクス（ECM）リモデリングに関与 時計は転写調節を基本としてある状態を繰り返す系であり、 する因子（ECMを構成するCo14a1（RRE）、ECM分解酵 トランスクリプトーム解析に好適である。すでにSCN、肝 素のMMPを抑制するTimp3（D−box））、細胞周期に関与 臓や心臓など様々な組織でトランスクリプトーム解析によ する因子（細胞周期の調節を担うρ2κ抄ノ（RRE）、〃6θ1 る振動遺伝子の抽出が試みられてきた。驚くべきことに時 （D−box））が含まれたので、これらが機能するか検証した。 計遺伝子など一部の遺伝子を除き振動遺伝子の多くが臓器 SV40basicpromoterで駆動される改変型ホタルルシ ごとで異なり、このことは末梢臓器の時計がそれぞれ特有 フェラーゼの上流に該当配列を3回タンデムにつないだコ の生理機構を制御していることを示唆している。 ンストラクトを作成し、NIH／3T3細胞を用いたtransient 本章では、白色脂肪組織における出力遺伝子の包括的取 transfectionアッセイ、また時計遺伝子が直接に結合する 得を目指した試みを行った。まず白色脂肪組織におけるト ことが合成タンパク質を用いたe1ectromobi1ity shift as− ランスクリプトーム解析を行い、振動遺伝子を同定した。 Say法によってこれらの該当配列が機能することが確認さ． 次いで公開されているマウスゲノム配列を利用して、DNA れた。さらに、SV40basic promoterによって駆動される チップで同定された振動遺伝子が機能する時計遺伝子結合 改変型ホタルルシフェラーゼの上流に該当配列を3回タン 領域をもつか検討した。 デムにつないだコンストラクトをRat−1細胞に導入して外 （結果と考察）マウス月θ〃プロモータを改変型ホタルル 日振動を惹起させ、生物発光をリアルタイムに長期問（4 シフェラーゼにつないだ遺伝子（ρθ〃一dLuc）を導入し 日間以上）観察する刀ガ伽o transcription dynamicsの ’た遺伝子導入ラットを用い、発光の経時的観察を行った。 アッセイによっても確認された。これら生理機構のキー 結果、白色脂肪組織で概日振動が観られたヒとから、白色 ファクターが時計遺伝子の直接の制御下にあることは、末 脂肪組織に時計機構が内在することを確認した。 梢組織の体内時計が、転写制御を介し特定の生理構構を調 次いでマウス（C57B1／6）を用い、明暗条件下及び恒常暗 節している例だと思われた。また、時計機構が概日振動を 条件下で4時間おき12点、白色脂肪組織を採取してtota1 惹起させる標的の生理機構に対し複数の介在点を持つこと RNAを精製し、DNAチップ解析を行った。次いでコサイ が示唆されたことは、標的の振動を確実なものとする系の ンフィルターにかけ、明暗条件、恒暗条件ともに有意に発 頑強さを保持するために重要なものと解釈された。 現振動する遺伝子を抽出した。この結果、202遺伝子（206 プローブ）が振動することを見出した（振動遺伝子数は用 いた統計処理法に依存する）。振動遺伝子の発現ピーク時間 は24時間にわたり分布していた。振動遺伝子には、白色脂 肪組織から分泌される生理活性物質として知られる肋〃 や、白色脂肪組織特異的に発現することが知られるホルモ ン感受性リパーゼなどが含まれていた。階層的クラスタリ ング解析から主要5クラスターを見出した。各クラスター から3遺伝子ずっを抽出して定量的PCR法による発現解 析を試みた結果、発現のピーク時間、振幅ともにDNAチッ 一94一
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