Duolink® In Situ – Probemaker - Sigma

User Guide
Duolink
In Situ – Probemaker
®
sigma.com/japan
SAJ1711
Instructions for Duolink In Situ Probemaker PLUS (Cat. No. DUO92009-1KT) and Duolink In Situ Probemaker
MINUS (Cat. No. DUO92010-1KT)
Duolink® In Situ
目次
はじめに............................................................................................................................................
2
アプリケーション ..........................................................................................................................
3
2.1 同一種由来抗体の利用
2.2 任意の生物種由来抗体の利用
抗体の条件 .......................................................................................................................................
4
3.1 濃度・容量
3.2 バッファー
試薬の準備・保存 ..........................................................................................................................
5
プロトコール ...................................................................................................................................
6
5.1 コンジュゲーションプロトコール .................................................................
6
5.2 PLAプローブプロトコール ..............................................................................
7
5.2.1 PLAプローブプロトコール
――カスタム溶液と標識一次抗体の場合 .................................
8
5.2.2 PLAプローブプロトコール
――カスタム溶液と標識二次抗体の場合 .................................
9
5.2.3 PLAプローブプロトコール
――Duolink In Situ溶液と標識一次抗体の場合.................. 10
5.2.4 PLAプローブプロトコール
――Duolink In Situ溶液と標識二次抗体の場合.................. 11
1
はじめに
Duolink® In Situ Probemakerは、一次抗体をダイレクトに標識するほか、マウス、ウサギ、ヤギ以外
の生物種やハプテンに対する二次抗体を標識する場合、PLA® oligonucletide armsを迅速かつ簡便に結
合させることができます。
Duolink In Situ試薬はin situ PLA（proximity ligation assay）テクノロジーにもとづいており、一
対のオリゴヌクレオチドで標識された抗体（PLAプローブ）のシグナルは、同一または2種類の一次抗体が
ごく近接した状態でサンプルに結合し、それぞれPLUS、MINUSの二つのPLAプローブが連結した場合の
み発生します。一対のPLAプローブから検出されたシグナルは、個々のスポットとして可視化されます。こ
れらのPLAシグナルは、顕微鏡画像にもとづいて定量化（カウント）できるとともに、その細胞内部位を帰
属することも可能です。
Probemaker試薬を使用して抗体をPLA oligonucletideで標識することにより、各自で目的のPLAプ
ローブを作り出すことができます。一連のDuolinkアッセイを実施する際は、Duolink In Situ
Probemaker PLUS、Duolink In Situ Probemaker MINUSを各1つと、検出試薬、洗浄バッファー、マ
ウント液をそれぞれ選択して揃えていただく必要があります。
全製品リストは
sigma.com/duolink
をご覧ください。
2
アプリケーション
2.1 同一種由来抗体の利用
タンパク質―タンパク質相互作用やタンパク質の修飾、あるいは単一タンパク質の研究に同一種由来の二
つの一次抗体を使用する場合、一方の抗体をPLUSオリゴ、もう一方をMINUSオリゴで標識します（図1）。
図1 同一種由来一次抗体を利用したタンパク質相互作用
の検出
2.2 任意の生物種由来抗体の利用
タンパク質―タンパク質相互作用、タンパク質の修飾や単一タンパク質の研究において、一方あるいは両
方の一次抗体がマウス、ウサギ、ヤギ以外に由来する場合は、それぞれの二次抗体のうち一方の二次抗体を
PLUSオリゴ、もう一方をMINUSオリゴで標識するか、一方の二次抗体のみ標識し、これとDuolink In
Situ PLAプローブ二次抗体のスタンダード製品を組み合わせて使用することができます（図2）。
図2 一方または両方がマウス、ウサギ、ヤギ以外に由来
する一次抗体を利用したタンパク質相互作用の検出
3
抗体の条件
3.1 濃度・容量
標識する抗体は、濃度を1mg/mLとしてください。1回のコンジュゲーションにつき必要な量は20µg
（＝20µL）となります。
注意：モノクローナル抗体の場合、プロテインAまたはプロテインG精製品を使用してください。
3.2 バッファー
抗体は、必ずアミンフリーのバッファーにしてください。理想的にはPBSです。キャリアや保存剤につい
ては、フリーではない場合でも、含有量は0.1% BSA、5% トレハロース、0.02% アジ化ナトリウムまでと
してください。
もし、各自で保存している抗体のバッファー組成に不安があれば、コンジュゲーションの前に、透析によ
るバッファー交換をぜひおこなってください。それぞれの抗体の供給元やメーカーによって、残留する1級
アミンの含有量には違いがあり、この多くは、抗体を抗原アフィニティー精製する際、酸溶出の段階で使用
されたグリシンによるものです。もし、製品表示がPBSとなっていても、1級アミンが残存している可能性
を完全に否定することはできません。
Olinkでは、標準的なバッファー交換の方法として、次のような手順が推奨されています。
注意：この操作は、高濃度のBSAや、その他高分子量物質を低減させるものではありません。
illustra MicroSpin G-50 Columnsスピンカラム（GE Healthcare, Art. no. 27-5330-01）を、
1xPBSを用いて最初に3000rpmで1分間スピンします。続いて400µLの1xPBSを添加して1分間の
再スピンを4回繰り返し、平衡化します。終了後、未使用の遠心チューブにカラムをセットします。
それぞれの抗体（12 50µL）をカラムに添加し、3000rpmで2分間スピンします。回収された抗体
の濃度は、ODで確認してください。この際、1mg/mLのOD 280nm値を1.4とみなしてください。
Duolink® In Situ Probemakerのコンジュゲーションの前に、希薄な抗体溶液を濃縮することは、その
抗体溶液を大量に所持していない限りおすすめできません。フィルター型の濃縮ツールを使用すると、非常
に大きなロスが生じるためです。
4
試薬の準備・保存
未使用のProbemakerは、-20°
Cで保存してください。使用期限は、ロットごとに記載されています。標
識した抗体は、4°
Cで保存してください。保存溶液には、バッファーと標識抗体の安定化、保存用の試薬が
入っています。抗体によっては、その他の成分が必要な場合がありますので注意してください。
1キットあたり、濃度1mg/mL、20µgの抗体標識分の試薬が用意されています。
Duolink® In SituオリゴヌクレオチドPLUSまたはMINUS ―― -20°
C保存
1バイアルで、濃度1mg/mL、20µgの抗体を1回標識分の活性化オリゴヌクレオチドが凍結乾燥さ
れています。
コンジュゲーションバッファー ―― -20°
C保存
コンジュゲーション反応用のバッファー試薬です。
使用前にボルテックスしてください。
溶液はそのまま使用します。
停止試薬 ―― -20°
C保存
コンジュゲーション反応の停止用試薬です。
使用前にボルテックスしてください。
溶液はそのまま使用します。
保存溶液 ―― -20°
C保存
標識抗体（PLA®プローブ）保存用のバッファーです。
使用前にボルテックスしてください。
溶液はそのまま使用します。
アッセイ試薬（20x）―― -20°
C保存
各自最適化した抗体希釈液に添加するための専用の試薬です。
使用前にボルテックスしてください。
標識抗体（PLAプローブ）を希釈する前に、各自最適化した抗体希釈液で1:20に希釈します。
注意：各抗体用のブロッキング溶液や抗体希釈液があらかじめ最適化されていない場合は、
Probemakerキットに用意されたブロッキング溶液とPLAプローブ希釈液をぜひ利用してください。
ブロッキング溶液 ―― -20°
C∼4°
C保存
Duolink In Situによる染色の前、各自サンプルのブロッキングに使用します。
使用前にボルテックスしてください。
溶液はそのまま使用します。1滴は約40µLです。
PLAプローブ希釈液 ―― -20°
C保存
標識抗体（PLAプローブ）を最終アッセイ濃度に希釈する際に使用します。
使用前にボルテックスしてください。
溶液はそのまま使用します。
5
プロトコール
このプロトコールは、以下、5.1項のコンジュゲーションプロトコールと、5.2項のPLA®プローブプロト
コールで構成されています。最初の5.1項コンジュゲーションプロトコールは、それぞれの抗体をPLUSま
たはMINUSオリゴヌクレオチドで標識し、PLAプローブを作製する方法を示しています。コンジュゲー
ションの手順に続き、5.2項に示したカスタム溶液と標識一次抗体（5.2.1）、カスタム溶液と標識二次抗体
（5.2.2）
、Duolink®
In Situ溶液と標識一次抗体（5.2.3）、Duolink In Situ溶液と標識二次抗体（5.2.4）
の4つのPLAプローブプロトコールのうち、いずれかに進みます。これは、各自で用意したカスタムのブ
ロッキング溶液や抗体希釈液を使用するか、またはDuolink
In Situ製品の溶液を使用するか、さらには一
次抗体と二次抗体のどちらの標識にProbemakerを使用するかによって決まります。また、一連の
Duolink In Situアッセイを実施してPLAシグナルを得るためには、検出試薬、洗浄バッファー、マウント
液を選ぶ必要があります。検出プロトコールは、sigma.com/duolinkサイトのDuolink In Situユーザー
マニュアルで紹介しています。
5.1 コンジュゲーションプロトコール
使用する抗体の濃度が1mg/mLであることを確認してください。1回のコンジュゲーションにつき20µg
（=20µL）の抗体が必要となります。抗体バッファーは、キャリアや保存剤がフリーのものが望ましく、そ
うでない場合でも、含有量は0.1% BSA、5% トレハロース、0.02% アジ化ナトリウムまでとしてください。
抗体とPLAオリゴヌクレオチドのコンジュゲーション
1）
抗体20µLにコンジュゲーションバッファー2µLを添加します。抗体濃度は1mg/mLです
2）
ピペットで穏やかに混合します。
3）
抗体溶液を、凍結乾燥されたオリゴヌクレオチド（PLUSまたはMINUS）のバイアル1本に移します。
注意：バイアルを開けたらすぐに抗体溶液を添加してください。
4）
ピペットで穏やかに混合します。
5）
室温で一晩、インキュベートします。
6）
反応液に2µLの停止試薬を添加します。
7）
室温で30分間インキュベートします。
8） 24µLの保存溶液と、抗体によっては安定化用のその他試薬を添加します。
9）
コンジュゲーションは完了です。各PLAプローブは、保存溶液中、+4°
Cで安定です。
ブロッキング溶液、抗体希釈液の選択や、一次抗体と二次抗体のどちらを標識したかによって、次の5.2
項に示した4つのPLAプローブプロトコールのうち、いずれかに進みます。
6
5.2 PLA®プローブプロトコール
標識抗体（PLAプローブ）のブロッキングと希釈の際は、各自、あらかじめ最適化したブロッキング溶液
と抗体希釈液を用いるか、それぞれの抗体メーカーから推奨されるものを使用してください。また、標識抗
体を希釈する前に、各自の抗体希釈液にアッセイ試薬（20x）を添加する必要がありますので、この点、注
意してください。各自で準備したブロッキング溶液と抗体希釈液を使用する場合で、標識した抗体が一次抗
体の場合は5.2.1項、二次抗体の場合は5.2.2項のPLAプローブプロトコールにしたがってください。
標識抗体用のブロッキング溶液や抗体希釈液があらかじめ最適化されていない場合は、Probemakerキッ
トに用意されたブロッキング溶液とPLAプローブ希釈液を使用してください。これらの試薬は、ブロッキン
グ剤にBSAを使用しています。こちらを利用する場合で、標識した抗体が一次抗体の場合は5.2.3項、二次
抗体の場合は5.2.4項のPLAプローブプロトコールにしたがってください。
スタート前に、それぞれのサンプルをスライドガラス上に適切に配置し、固定化、抗原回復や透過処理な
どの前処理をすませてください。
反応領域は、疎水性バリアを形成するペンなどで区切り、反応液の使用量は、それぞれ囲った反応面積に
応じて決定してください（sigma.com/duolinkサイトのReaction Volume Guideページ参照）。カバー
スリップなしで液滴がオープンな状態で使用し、インキュベーションはすべて、加湿チャンバーでおこなっ
てください。
7
5.2.1 PLA®プローブプロトコール
――カスタム溶液と標識一次抗体の場合
一次抗体の標識にProbemakerを利用し、各自で準備したブロッキング溶液、抗体希釈液を使用する場合、
次のプロトコールにしたがってください。
1.
ブロッキング
各自、あらかじめ最適化したブロッキング溶液を使用します。もし、Duolink
In Situ検出試薬
Brightfieldを使用する場合には、ブロッキングの前に、ペルオキシダーゼクエンチングのステップ
を実施するようにしてください。
a）
各サンプルにそれぞれのブロッキング溶液を添加します。
b）
スライドをインキュベートします。
2. PLAプローブ
標識抗体（PLAプローブ）の希釈には、各自、あらかじめ最適化した抗体希釈液を使用してください。
a）
アッセイ試薬（20x）をそれぞれの抗体希釈液で1:20に希釈します。
b） PLUSとMINUSで標識した各抗体（PLAプローブ）を、1xアッセイ試薬を含む各自の抗体希釈液で、
目的の濃度に希釈します。この混合液を、室温で20分間置きます。
注意：PLAプローブは、適切な濃度に設定する必要があります。その一次抗体を通常のIFやIHCで使
用する場合よりも、高い濃度で開始することをおすすめします。
c）
スライドのブロッキング溶液を除去します。各スライドで残存量が同等になるよう試みてください。
再現性に影響する可能性が考えられます。
また、PLAプローブの添加前に、サンプルが乾燥しないようにしてください。バックグラウンドの
原因となります。
d）
各サンプルに、希釈したPLAプローブを添加します。
e）
加湿チャンバー内でインキュベートします。それぞれの抗体に最適な温度と時間でおこなってくだ
3.
検出プロトコール
さい。
sigma.com/duolinkサイトのDuolink In Situユーザーマニュアル7.3項に進んでください。
8
5.2.2 PLA®プローブプロトコール
――カスタム溶液と標識二次抗体の場合
二次抗体の標識にProbemakerを利用し、ブロッキング溶液とPLAプローブ希釈液もProbemakerキッ
トに用意された試薬を使用する場合には、次のプロトコールにしたがってください。
1.
ブロッキング
各自、あらかじめ最適化したブロッキング溶液を使用します。もし、Duolink
In Situ検出試薬
Brightfieldを使用する場合には、ブロッキングの前に、ペルオキシダーゼクエンチングのステップ
を実施するようにしてください。
a）
各サンプルにそれぞれのブロッキング溶液を添加します。
b）
スライドをインキュベートします。
2.
一次抗体
一次抗体の希釈には、各自、あらかじめ最適化した抗体希釈液を使用してください。
a）
各自の一次抗体を、それぞれ用意した抗体希釈液で目的の濃度に希釈します。
b）
スライドのブロッキング溶液を除去します。各スライドで残存量が同等になるよう試みてください。
再現性に影響する可能性が考えられます。
また、一次抗体の添加前に、サンプルが乾燥しないようにしてください。バックグラウンドの原因
となります。
c）
各サンプルに一次抗体を添加します。
d）
加湿チャンバー内でインキュベートします。それぞれの一次抗体に最適な温度と時間でおこなって
ください。
3. PLAプローブ
標識抗体（PLAプローブ）の希釈には、各自、あらかじめ最適化した抗体希釈液を使用してください。
a）
アッセイ試薬（20x）をそれぞれの抗体希釈液で1:20に希釈します。
b） PLUSとMINUSで標識した各抗体（PLAプローブ）を、1xアッセイ試薬を含む各自の抗体希釈液で、
目的の濃度に希釈します。この混合液を、室温で20分間置きます。
注意：PLAプローブは、適切な濃度に設定する必要があります。その二次抗体を通常のIFやIHCで使
用する場合と同じ濃度で開始することをおすすめします。
c）
スライドの一次抗体溶液を除去します。
d）
それぞれの一次抗体用の洗浄バッファーで、スライドを洗浄します。
洗浄は、染色ジャーに最低でも70mLを入れ、シェーカー（クレードル）上で、穏やかな速度で実
施してください。洗浄バッファーは、使用前に室温に戻してください。
e）
各サンプルに、希釈したPLAプローブ溶液を添加します。
f）
スライドを、予熱した加湿チャンバーで37°
C、1時間インキュベートします。
4.
検出プロトコール
sigma.com/duolinkサイトのDuolink In Situユーザーマニュアル7.3項に進んでください。
9
5.2.3 PLA®プローブプロトコール
――Duolink In Situ溶液と標識一次抗体の場合
一次抗体の標識にProbemakerを利用し、ブロッキング溶液とPLAプローブ希釈液もProbemakerキッ
トに用意された試薬を使用する場合には、次のプロトコールにしたがってください。
1.
ブロッキング
Duolink In Situ検出試薬Brightfieldを使用する場合には、ブロッキングの前に、ペルオキシダー
ゼクエンチングのステップを実施するようにしてください。
a）
ブロッキング溶液を1cm2あたり1滴の割合で添加します。1滴は約40µLです。
b）
スライドを、予熱した加湿チャンバーで37°
C、30分間インキュベートします。
2. PLAプローブ
a） PLUSとMINUSで標識した各抗体（PLAプローブ）を、PLAプローブ希釈液で目的の濃度に希釈し
ます。
注意：PLAプローブは、適切な濃度に設定する必要があります。その一次抗体を通常のIFやIHCで使
用する場合よりも、高い濃度で開始することをおすすめします。
b）
スライドのブロッキング溶液を除去します。各スライドで残存量が同等になるよう試みてください。
再現性に影響する可能性が考えられます。
また、PLAプローブの添加前に、サンプルが乾燥しないようにしてください。バックグラウンドの
原因となります。
c）
各サンプルに、希釈したPLAプローブを添加します。
d）
加湿チャンバー内でインキュベートします。それぞれの一次抗体に最適な温度と時間でおこなって
3.
検出プロトコール
ください。
sigma.com/duolinkサイトのDuolink In Situユーザーマニュアル7.3項に進んでください。
10
5.2.4 PLA®プローブプロトコール
――Duolink® In Situ溶液と標識二次抗体の場合
二次抗体の標識にProbemakerを利用し、ブロッキング溶液とPLAプローブ希釈液もProbemakerキッ
トに用意された試薬を使用する場合には、次のプロトコールにしたがってください。
1.
ブロッキング
Duolink In Situ検出試薬Brightfieldを使用する場合には、ブロッキングの前に、ペルオキシダー
ゼクエンチングのステップを実施するようにしてください。
a）
ブロッキング溶液を1cm2あたり1滴の割合で添加します。1滴は約40µLです。
b）
スライドを、予熱した加湿チャンバーで37°
C、30分間インキュベートします。
2.
一次抗体
a）
各自の一次抗体を、ブロッキング溶液で目的の濃度に希釈します。
b）
スライドのブロッキング溶液を除去します。各スライドで残存量が同等になるよう試みてください。
再現性に影響する可能性が考えられます。
また、一次抗体の添加前に、サンプルが乾燥しないようにしてください。バックグラウンドの原因
となります。
c）
各サンプルに一次抗体を添加します。
d）
加湿チャンバー内でインキュベートします。それぞれの一次抗体に最適な温度と時間でおこなって
ください。
3. PLAプローブ
a） PLUSとMINUSで標識した各抗体（PLAプローブ）を、PLAプローブ希釈液で目的の濃度に希釈し
ます。
注意：PLAプローブは、適切な濃度に設定する必要があります。その二次抗体を通常のIFやIHCで使
用する場合と同じ濃度で開始することをおすすめします。
b）
c）
スライドの一次抗体溶液を除去します。
スライドを、1x洗浄バッファーAまたはそれぞれの一次抗体用の洗浄バッファーで、できれば5分間
×2回洗浄してください。
洗浄は、染色ジャーに最低でも70mLを入れ、シェーカー（クレードル）上で、穏やかな速度で実
施してください。洗浄バッファーは、使用前に室温に戻してください。
d）
各サンプルに、希釈したPLAプローブ溶液を添加します。
e）
スライドを、予熱した加湿チャンバーで37°
C、1時間インキュベートします。
4.
検出プロトコール
sigma.com/duolinkサイトのDuolink In Situユーザーマニュアル7.3項に進んでください。
11
【 memo 】
12
【 memo 】
13
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