1 特 長 P1レベルで高効率に遺伝子導入できるウイルスベクター 組換えアデノ随伴ウイルス（AAV） ベクター作製 NEW ● 力価向上効果のあるmiRNAを搭載したプラスミドベクターを使用 ● タカラバイオ独自のAAVベクター抽出法により高純度ウイルス液を作製 ● 1010 vg/ml以上の高力価ウイルスをご提供 概 要 アデノ随伴ウイルスベクター作製キットAAVproTM Helper Free System（AAV2）(製品コード 6230)を用いて、 目的遺 伝子を搭載した血清型2の組換えアデノ随伴ウイルス （AAV2）ベクターを、ヘルパーウイルスを使用せずに安全に作製いた します。 本受託サービスでは、AAV2ベクター作製系で力価向上効果のあるmiRNAの発現カセットを含むpRC2-mi342プラスミド ベクターと、 タカラバイオ独自のウイルスベクター抽出法により、高力価、高純度の組換えアデノ随伴ウイルスベクターを作 製いたします。 アデノ随伴ウイルスベクターを用いた遺伝子導入法は、 以下の利点を持ち、 多くの遺伝子導入実験に利用されています。 1. 2. 3. 4. 遺伝子組換え実験P1レベルの施設でも取扱いが可能 増殖／非増殖のいずれの細胞にも遺伝子導入が可能 免疫原性が低く、動物個体への遺伝子導入に最適 非分裂細胞にて長期間の発現が可能 Ⅶ 細胞関連受託 図. AAV2ベクター作製の流れ 26 Ⅶ 細胞関連受託 サービス内容 ステップ毎にご注文いただけます。 A. プラスミドベクターの構築 ・目的遺伝子を挿入した発現プラスミド （pAAV-GOI vector） を作製＊ ・挿入遺伝子のサイズ、 挿入接続部位の塩基配列を確認 ＊ pAAV-CMVプラスミドベクターを使用 ※挿入可能な遺伝子長は2.5 kbまで B. 組換えアデノ随伴ウイルス （AAV2）ベクターの作製 ・pAAV-GOIプラスミドベクター、pRC2-mi342プラスミドベクターおよびpHelperプラスミドベクターをHEK293細 胞またはHEK293T細胞へトランスフェクション ・タカラバイオ独自の抽出法により、凍結融解法や超音波破砕法と比較して高純度かつ高効率にAAV2 ベクターを抽出 ・培養細胞への感染実験 （in vitro 実験） を行うために十分な1010∼1011 vg/mlのウイルスベクター液を調製 ※AAV2以外のセロタイプをご希望の場合は、 キャプシド発現プラスミドDNAをご提供ください。 【オプションサービス】 ● 精製組換えアデノ随伴ウイルス （AAV2）ベクターの調製 ・AAVproTM Purification Kit （AAV2） （製品コード 6232） を使用しウイルスベクター液を精製、濃縮 ・動物個体への投与実験 （in vivo 実験） を行うのに十分な1011∼1012 vg/mlのウイルスベクター液を調製 ● 組換えアデノ随伴ウイルス （AAV2）ベクターの力価測定 TM ・AAVpro Titration Kit（for Real Time PCR） （製品コード 6233） を使用し、 アデノ随伴ウイルスベクターゲノム の両末端に存在する ITR（Inverted Terminal Repeat） をターゲット配列としてAAVゲノムを定量 納 品 物 Ⅶ ● ● 細胞関連受託 ● 組換えアデノ随伴ウイルスベクター液 精製組換えアデノ随伴ウイルスベクター作製の場合 作業報告書 受入サンプル ● ● ● プラスミドベクターの構築からの場合 組換えアデノ随伴ウイルスベクターの作製からの場合 ウイルスの力価測定からの場合 1010∼1011 vg/ml、約0.5 ml 1011∼1012 vg/ml、約0.4 ml 送付先 （巻末の「受託サービスの流れ」をご覧ください。） プラスミドDNA プラスミドDNA 組換えウイルスベクター液 10μg以上 150μg以上（約10 ml調製時） 50μl ご留意事項 ・本作業で作製した組換えアデノ随伴ウイルスベクターを商業目的で使用される際は、個別にライセンス契約の締結が必要 となる場合があります。 ・本製品ご利用の際は省令および組織内の組換えDNA実験安全委員会の指示に従い、安全には十分ご注意ください。 ・組換えアデノ随伴ウイルスベクターの取り扱いは、 挿入されている遺伝子の全塩基配列が既知で、 かつ、 その遺伝子が毒性 あるいは病原性等を示さず安全であると判断できる場合に限りP1レベルで扱うことができます。本サービスでは、 P1レベ ルで扱うことのできる場合のみ、 ご依頼をお受けしています。 27 2 特 長 高効率かつ安定な遺伝子導入システム 組換えレンチウイルスベクター作製 ● レンチウイルスベクターでは神経細胞等の非分裂細胞にも遺伝子導入可能！ ● タカラバイオ製pLVSINベクターを利用いただけます ● 安定発現細胞作製も承ります 概 要 SIN（Self inactivating）型の高発現用CMVプロモーターを搭載したpLVSIN-CMVおよびサイレンシング耐性のある EF-1αプロモーターを搭載したpLVSIN-EF1αを販売しています。 レンチウイルスベクター作製受託サービスでは、 これらのプラスミドベクターと、 タカラバイオオリジナルの一過性ウイルスベ クター産生システムおよびLenti-XTM 293T Cell Lineを用いて、 目的遺伝子を挿入した高力価の組換えレンチウイルスベ クターを作製いたします。 サービス内容 ステップ毎にご注文いただけます。サービス内容詳細はウェブサイトをご覧ください。 ● ● 組換えレンチウイルスベクターの作製 A. プラスミドベクターの構築 B. 組換えレンチウイルスベクターの作製と力価測定 レンチウイルスベクター感染による遺伝子安定発現細胞株の取得 Ⅶ 細胞関連受託 【オプションサービス】 ● 組換えレンチウイルスベクターの力価測定 ・リアルタイムPCR法 ・G418耐性コロニー検出法 ● 組換えレンチウイルスベクターの作製 （ご希望のスケール） ● ウイルスベクターの簡易濃縮 （約100倍まで） または超遠心分離による精製（VSV-Gシュードタイプウイルス） ● 安定発現細胞株シングルクローンの単離 納 品 物 ● ● ● 組換えレンチウイルスベクター液 約10 ml 作業報告書 目的遺伝子安定発現細胞株（薬剤耐性プール細胞）の凍結細胞（レンチウイルスベクター感染による遺伝子安定発現細胞 株作製の場合） 受入サンプル ● ● ● プラスミドベクターの構築からの場合 組換えレンチウイルスベクターの作製からの場合 ウイルスベクターの力価測定（リアルタイムPCR）からの場合 送付先 （巻末の「受託サービスの流れ」をご覧ください。） プラスミドDNA プラスミドDNA 組換えウイルスベクター液 10μg以上 50μg以上 200μl 28 Ⅶ 細胞関連受託 高効率遺伝子導入の決定版 3 組換えアデノウイルスベクター作製 ● 高力価・高純度！動物投与に必要な10 10 pfuオーダー以上の高純度クローン化組換えウイルスベク 特 長 ターを提供 ● 正確！クローン単離により正確な組換えウイルスベクターを作製 ● 高発現！強力なCAGプロモーターを搭載 ● EF1αプロモーターも選択できます。 概 要 東京大学医科学研究所の齋藤泉博士らにより開発された高効率なアデノウイルス作製法 （完全長DNA導入法） を利用した組 換えアデノウイルス作製キットAdenovirus Dual Expression Kit （製品コード 6170）、Adenovirus Dual Expression Kit（EF1α） （製品コード 6174）あるいは、Cre/loxP発現制御システムを利用したAdenovirus Cre/loxP Kit（Dual Version） （製品コード 6173） を用いて、 目的遺伝子を導入した組換えアデノウイルスベクターを作製いたします。 Cre/loxP発現制御システムを用いることで、細胞毒性を有する遺伝子の導入も可能です。蛍光マーカー遺伝子を搭載した 組換えアデノウイルスベクター作製も承ります。動物投与実験を行うのに必要な高力価・高純度のアデノウイルスベクター を大量に同一ロットでご提供できます。 Ⅶ サービス内容 細胞関連受託 ステップ毎にご注文いただけます。サービス内容詳細はウェブサイトをご覧ください。 ● 組換えアデノウイルスベクターの作製 A. コスミドの構築 B. 組換えアデノウイルスベクターの確認 C. クローン化組換えアデノウイルスベクターの作製 ● 精製組換えアデノウイルスベクターの調製 ● コントロールウイルス （組換えアデノウイルスセットA2 各200μl/vial 製品コード 6176） Axcw2 109 pfu/ml 程度 プロモーターおよび外来遺伝子を含まないコントロールウイルス AxCAwt2 109 pfu/ml 程度 CAGプロモーターを含み、 外来遺伝子を含まないコントロールウイルス AxCAiLacZ 9 10 pfu/ml 程度 大腸菌由来のβ-ガラクトシダーゼをレポーター遺伝子として発現 納 品 物 ● ● ● ● コスミドの構築の場合 クローン化組換えアデノウイルスベクターの作製の場合 精製組換えアデノウイルスベクターの調製の場合 作業報告書 受入サンプル 組換えコスミド 組換えウイルスベクター液 精製組換えウイルスベクター液 40μg以上 108∼109 pfu/ml、約10 ml 1010∼1011 pfu/ml、∼4 ml 送付先 （巻末の「受託サービスの流れ」をご覧ください。） コスミドの構築からの場合 プラスミドDNA 10μg以上 ご依頼の配列にもとづき人工合成遺伝子を作製し、 プラスミドDNAを構築する作業も別途オプションで承ります。 ● 組換えアデノウイルスベクターの確認からの場合 コスミドDNA 10μg以上 ● 精製組換えアデノウイルスベクターの調製からの場合 組換えウイルス液 109 pfu/ml以上、300μl（非増殖型のみ） ● 29 4 特 長 レトロウイルスでゲノムに遺伝子を挿入 組換えレトロウイルスベクター作製 ● iPS細胞作製にもご利用いただけます ● 高効率遺伝子発現用ベクターまたは高発現遺伝子導入用ベクターを使用 ● 安定発現細胞作製も承ります 概 要 高効率遺伝子導入用レトロウイルスプラスミドベクターpDON-AI-2 DNA、高発現遺伝子導入用レトロウイルスプラスミドベ クターpMEI-5 DNA、高効率かつ高発現遺伝子導入用レトロウイルスプラスミドベクターpDON-5 DNAおよび一過性ウイ ルス産生システムRetrovirus Packaging Kitを販売しています。 レトロウイルスベクター作製受託サービスでは、 これらのプラスミドベクターおよびシステムを用いて、目的遺伝子を挿入し た組換えレトロウイルスベクターを作製いたします。 サービス内容 ステップ毎にご注文いただけます。サービス内容の詳細はウェブサイトをご覧ください。 組換えレトロウイルスベクター作製 A. プラスミドベクターの構築 B. 組換えレトロウイルスベクターの作製と力価測定 ・組換えレトロウイルスベクター作製とリアルタイムPCRによる力価測定 ・組換えレトロウイルスベクター作製とG418耐性コロニー検出法による力価測定 ● レトロウイルスベクター感染による遺伝子安定発現細胞の取得 ・組換えレトロウイルスベクターの作製 ・標的細胞のセットアップ、 レトロウイルスベクターの感染 ・薬剤耐性となった目的遺伝子導入プール細胞の調製 ● Ⅶ 細胞関連受託 【オプションサービス】 ● 組換えレトロウイルスベクターの作製 （ご希望のスケール） ● ウイルスベクターの簡易濃縮 （20∼40倍濃縮） ● ウイルスベクターの恒常産生細胞の作製 （プロデューサー細胞の作製） ● 安定発現細胞シングルクローンの単離 納 品 物 ● ● ● 組換えレトロウイルスベクター液 約10 ml 作業報告書 目的遺伝子安定発現細胞株（薬剤耐性プール細胞）の凍結細胞（レトロウイルスベクター感染による遺伝子安定発現細胞 株の場合） 受入サンプル ● ● プラスミドベクターの構築からの場合 組換えレトロウイルスベクターの作製からの場合 送付先 （巻末の「受託サービスの流れ」をご覧ください。） プラスミドDNA プラスミドDNA 10μg以上 50μg以上 30 Ⅶ 細胞関連受託 5 組換えレトロウイルスベクターやエピソーマルベクターを使ったヒトiPS細胞作製・クローン化サービス iPS細胞作製 ● エピソーマルベクターを使用したiPS細胞作製にも対応 特 長 ● お客様の細胞からiPS細胞を作製 ● iPS細胞関連のオプションサービスも充実 ● iPSアカデミアジャパン社よりライセンスをうけてiPS細胞作製受託サービスをご提供 概 要 長年培ってきたiPS細胞に関する研究成果や遺伝子工学技術を用いて、iPS細胞作製を研究者の皆様にかわり実施いたしま す。 ご提供いただく細胞へのiPS細胞誘導因子（エピソーマルベクターの場合はOCT3/4, SOX2, KLF4, LIN28, L-MYC, p54shRNAの6因子、 レトロウイルスベクターの場合はOCT3/4, SOX2, KLF4, LIN28, NANOGの5因子）の遺伝子 導入、iPS細胞誘導およびクローン化まで、 お客様の研究目的に沿ったご希望の内容で作業を行います。 タカラバイオの熟練した技術担当者による日本国内での代行作業により、 精度の高い信頼できるサービスをお届けいたします。 サービス内容 ⣽⬊䛾ཷධ䜜 Ⅶ 㼕㻼㻿⣽⬊ㄏᑟᅉᏊ䛾㑇ఏᏊᑟධ 細胞関連受託 㼕㻼㻿⣽⬊ㄏᑟ 㼕㻼㻿⣽⬊䛾䜽䝻䞊䞁 ⣡ရ 【オプションサービス】 ● リアルタイムPCR解析 導入遺伝子（iPS細胞誘導因子） のサイレンシング確認、 未分化マーカー遺伝子等の発現定量などが可能です。 ● テラトーマ形成能試験 残存ウイルス確認試験 ● 未分化マーカーの免疫染色 ● トランスジーンの挿入位置同定 ● CGH/CNV Array解析 ● ※サービス内容詳細はウェブサイトをご覧ください。 納 品 物 作業報告書 凍結細胞 ※納品にはドライシッパーを用います。恐れ入りますが、細胞をお受け取り頂いた後は、 ドライシッパーをご返送ください。 ● ● 受入サンプル 送付先 （巻末の「受託サービスの流れ」をご覧ください。） ● 標的細胞 （ヒト皮膚線維芽細胞など） ・生存率90％以上、 1週間の増殖率5倍以上 ・細胞数1×105以上 ・HIV、 HCV、 HBV陰性 ご留意事項 iPS cell（ライセンス） This product is the subject of the pending U.S. patent application and its foreign counterparts. ・ 本製品は、 iPSアカデミアジャパン株式会社のライセンスを受けて、タカラバイオ株式会社が製造・販売しております。 ・ 本製品の使用はすべて研究用に限定されています。臨床目的で使用することはできません。 ・ 本製品を研究目的以外に使用される場合は、事前に弊社にお問い合わせください。商業目的に使用される場合は、iPSアカデミ アジャパン株式会社と個別にライセンス契約が必要です。 ・ ヒト生体試料の解析にあたり、個人情報に関わるサンプルは、お客様ご所属施設の倫理委員会等で遺伝子解析研究に用いられ ることの承認が得られており、かつお客様の元で匿名化されたものに限らせていただきます。 詳しくは、 「ヒトゲノム・遺伝子解析受託サービスについて」 （96ページ参照）をお読みください。 31 ノックアウト／ノックイン細胞の取得に 6 特 長 ゲノム編集による細胞株作製 NEW ● CRISPR/Casシステムを利用したノックアウト／ノックイン細胞作製 ● sgRNA、Cas9発現ベクター （dRGEN）の構築からも承ります ● iPS細胞のゲノム編集も承ります 概 要 RGEN（RNA guided endonuclease） はバクテリアの獲得免疫システムであるCRISPR/Casシステム由来のRNA誘導 型人工ヌクレアーゼで、従来型の人工ヌクレアーゼとは異なり、 ガイドRNA（gRNA：guide RNA） とCas9エンドヌクレアー ゼ （タンパク質）の二つの異なる分子が、標的DNA配列の認識とDNA二本鎖切断の働きをそれぞれ別々に担います。こうし た特徴から、従来型人工ヌクレアーゼに対しRGENの設計が比較的容易である一方、本法は、従来技術と同等のゲノム編集 効果が得られること、 ならびに、複数箇所の同時ゲノム編集が容易に行えることなどから、新たなゲノム編集法として注目を集 めています。本サービスは、 ゲノムへの変異導入を目的にCRISPR/Casシステムにて設計したCas9及びsgRNA発現ベク ターを用いて、供与いただいた細胞の遺伝子ノックアウト／ノックイン細胞の作製受託サービスを承ります。 サービス内容 ● CRISPR/Cas9システムを利用したノックアウト細胞の作製 お客様から提供いただく任意の哺乳動物細胞に、sgRNAおよびCas9タンパク質発現ベクターをトランスフェクションし ます。 トランスフェクション後のプール細胞について、T7 Endonuclease I を用いたアッセイによりターゲット特異的に DNAの切断、変異導入が生じたことを確認します。そのプール細胞からシングルクローン化した細胞 最大94クローンに ついて、 ダイレクトシーケンスを行い、 シーケンス結果と共に納品します。 Ⅶ 細胞関連受託 ● CRISPR/Cas9システムを利用したノックイン細胞の作製 お客様から提供いただく任意の哺乳動物細胞に、sgRNA、Cas9タンパク質発現ベクター、および目的遺伝子挿入用 ドナーベクターまたはssOligoDNAをトランスフェクションします。 トランスフェクション後のプール細胞について、T7 Endonuclease I を用いたアッセイによりターゲット特異的にDNAの切断、変異導入が生じたことを確認します。その プール細胞から限界希釈法、 もしくは薬剤選択によりシングルクローン化します。また、取得したクローンについてPCR解 析による変異導入の有無確認を行います。オプションとして、 ウェスタンブロット解析やクローニングによるシーケンス解析 なども承ります。 sgRNA(single-guide RNA)発現プラスミドベクター(U6プロモーター)、 Cas9タンパク質発現プラスミドベクター(CMVプ ロモーターまたはEF1αプロモーター)、 目的遺伝子挿入用ドナーベクター、 およびssOligoDNAの設計・合成も承ります。 【オプションサービス】 ● ウェスタンブロッ ト解析 ● クローニングによるシーケンス解析 納 品 物 ● 作業報告書 ● ノックアウト／ノックイン細胞クローンの凍結ストック ● 解析データ （塩基配列データ等） 受入サンプル ● 細胞 ● 送付先 （巻末の「受託サービスの流れ」をご覧ください。） sgRNA発現プラスミドベクター／Cas9発現プラスミドベクター ● 遺伝子情報／ターゲットサイト情報 32 Ⅶ 細胞関連受託 7 特 長 セルベースアッセイなどの基本ツールの構築に! 安定発現細胞株作製・哺乳動物細胞実験 ● お客様の細胞に目的遺伝子を恒常的に発現 ● 任意のプロモーターを挿入可能！発現ユニットのマルチ挿入による高発現株作製に ● RNAi効果の比較検討、哺乳動物細胞を用いた各種アッセイについてもサポート 概 要 お客様から提供いただく任意の哺乳動物細胞（CHO、HEK293など） にDNAトランスフェクション法により目的遺伝子を導 入し、薬剤選択により遺伝子安定発現細胞株（stable clone） を取得します。目的遺伝子について、 タグやシグナルの付加、 レ ポータータンパク質との共発現など、実験に適したプラスミドの構築からご相談させていただきます。 その他、 レトロウイルスベクター、 レンチウイルスベクターによる遺伝子導入を用いた安定発現細胞株作製も承ります。また、 哺乳動物細胞を用いた各種実験、安定発現細胞株を用いた目的タンパク質の産生など、お客様の研究目的に応じてご要望を 承ります。 サービス内容 作業は、相談のうえ、 ご希望に沿った形で提案させていただきます。 DNAトランスフェクション法による遺伝子安定発現細胞株（stable clone）の作製 標準作業は以下のとおりです。 ● 細胞関連受託 Ⅶ ・遺伝子の一過性発現を確認してから安定発現細胞株作製に進むことができます。 ・ウェスタンブロット解析やFCM解析での発現確認をご希望の場合には、一次抗体およびポジティブコントロールタンパク質 をご提供いただきます。 ・レトロウイルスベクター、 レンチウイルスベクター感染による遺伝子導入も別途承ります。 33 遺伝子増幅発現系（dhfr）での安定発現細胞株作製 CHO/dhfr（-）細胞において作製します。遺伝子増幅を行わない系に比べて、1オーダー以上高いタンパク質発現量が期 待できます。タンパク質取得を目的とされる場合に、 ご検討ください。 ● ● shRNA安定発現細胞株の作製 （80ページ参照） ● 不死化細胞株の作製 ● 抗体遺伝子発現細胞株の作製 ● 哺乳動物細胞実験 例1：RNAi効果の比較検討 293細胞 または提供いただく任意の細胞において、siRNAまたはshRNA発現プラスミド （pBAsiシリーズ） を導入しま す。細胞よりRNAを抽出して、 目的遺伝子の発現抑制をリアルタイムPCRにて測定します。 siRNAの設計・合成、shRNA発現プラスミドの構築、提供細胞の目的遺伝子の内在性発現の確認、目的遺伝子発現プラ スミドの構築なども承ります。 例2：薬剤添加細胞のAgilent Expression Array解析 提供いただく任意の細胞において、指定の薬剤を添加します。一定時間経過後の細胞よりtotal RNAを抽出し、 アジレント 社DNAマイクロアレイにより遺伝子発現解析を行います。 ● 哺乳動物細胞を用いた各種アッセイなど ・細胞の薬剤処理による目的遺伝子の発現検討 ・各種レポーターアッセイ ・アポトーシスの検出 ・細胞増殖アッセイ プロトコールの定まった細胞アッセイ代行も承ります。お気軽にご相談ください。 Ⅶ 細胞関連受託 【オプションサービス】 ● 人工合成遺伝子作製 （11ページ参照） ● プラスミド構築 （クローニング） （9ページ参照） ● RNA抽出・品質検定 ● ウェスタンブロッ ト解析 ● 安定発現細胞株の大量培養 ● DNAトランスフェクションによる一過性タンパク質発現培養 納 品 物 ● ● 作業報告書 安定発現細胞株作製受託の場合は、標準として安定発現細胞株10クローン以上の凍結細胞 受入サンプル ● 送付先 （巻末の「受託サービスの流れ」をご覧ください。） 薬剤耐性遺伝子搭載の目的遺伝子発現プラスミド溶液 など 34
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