様式 C-19 科学研究費補助金研究成果報告書 平成 23 年 5 月 31 日現在 機関番号：33602 研究種目：基盤研究(C) 研究期間：2008～2010 課題番号：20592440 研究課題名（和文） 血清アミロイド A を介した歯周病による動脈硬化発症予測の検討 研究課題名（英文）Prediction study of atherosclerosis by periodontal disease through serum amyloid A. 研究代表者 吉成 伸夫（YOSHINARI NOBUO） 松本歯科大学・歯学部・教授 研究者番号：20231699 研究成果の概要（和文） ：歯周病と動脈硬化症の関連に関する血清アミロイド A (Serum Amyloid A: SAA)の関与を検索するのが本研究の目的である．このために動脈硬化易形成性 ApoE ノックアウトマ ウスに IL-6 を投与し，肝臓での SAA 遺伝子発現，血中 SAA 濃度，大動脈での動脈硬化程度を観察， 計測した．その結果，SAA の mRNA 量，血中タンパク量ともに発現が上昇し，血管内壁の脂肪沈着量 は増大した．以上より，歯周病により産生される IL-6 刺激で，肝臓での SAA 産生が上昇し，動脈硬化 発症を誘導することが確認された． 研究成果の概要（英文） ：The purpose of the present study concerning the relation between periodontitis and arteriosclerosis is to examine whether Serum Amyloid A: SAA could be a marker of atherosclerogenesis in homozygous ApoE deficient mice. In mice, periodontopathic IL-6 was inserted to intraperitoneal injection. SAA m-RNA level in liver, serum SAA level, and the atherosclerosis level were measured. In IL-6 injected group, serum SAA m-RNA level, SAA level in IL-6 were higher than PBS injected group, and the area rate of an atherosclerosis were increased. Therefore, we suggest that SAA increased by IL-6 stimulation made due to periodontitis could cause the onset to an atherosclerosis. 交付決定額 2008 年度 2009 年度 2010 年度 2011 年度 2012 年度 総 計 直接経費 1,400,000 1,500,000 500,000 間接経費 420,000 450,000 150,000 （金額単位：円） 合 計 1,820,000 1,950,000 650,000 3,400,000 1, 020,000 4,420,000 研究分野：医歯薬学 科研費の分科・細目：歯学・歯周治療系歯学 キーワード：歯周炎，心臓血管疾患，疾患モデル，血清アミロイド A，サイトカイン １．研究開始当初の背景 状 動 脈 疾 患 ，脳 血 管 性 疾 患 ，末 梢 血 管 心 臓 血 管 疾 患 (cardiovascular diseas 疾 患 ，心 不 全 ，リューマチ性 心 疾 患 ，先 e: CVD)とは，心 臓 血 管 系 に影 響 を与 え 天 性 心 疾 患 および心 筋 症 等 が含 まれる． る多 くの疾 患 の総 称 であり，高 血 圧 症 ，冠 すなわち，心 臓 血 管 疾 患 は，日 本 人 の死 1 因 順 位 第 ２位 の心 臓 病 と第 ３位 の脳 血 管 に関 わる結 果 に結 びつく．現 在 ，動 脈 硬 疾 患 を合 わせた疾 患 群 であり，両 者 を合 化 症 は慢 性 炎 症 性 疾 患 とも考 えられてお 計 すると，第 １位 の悪 性 新 生 物 に匹 敵 す り(Ross R., 1999)，血 管 の内 腔 を被 覆 し る 死 亡 数 とな る． ている血 管 内 皮 細 胞 の傷 害 と，それに続 また，CVDによる死 亡 者 の80％以 上 が， く血 管 壁 中 の脂 質 沈 着 ，線 維 性 結 合 組 65歳 以 上 の人 々である．日 本 では，1965 織 の増 生 ，内 膜 の肥 厚 などをきたして，血 (昭 和 40)年 以 降 の急 速 な中 高 年 死 亡 率 管 内 腔 の狭 窄 や閉 塞 をきたす． の改 善 により，世 界 一 の長 寿 国 が達 成 さ 1 9 9 0 年 代 よ り ， 歯 周 病 と C V D との 疫 学 的 れ，超 高 齢 社 会 を迎 えつつある．そんな中 関 連 性 が横 断 的 研 究 やケースコントロー で，この疾 患 は急 死 する ことがあり，また急 ル研 究 により提 示 され，その後 の縦 断 的 死 が避 けられても生 活 の制 限 を要 する場 研 究 で ， 従 来 のリ スク フ ァ ク ター が 補 正 ， 再 合 が多 く，Quality of Lifeは低 下 する． 分 析 されている．しかし，口 腔 の健 康 や歯 65歳 未 満 と65歳 以 上 のそれぞれ上 位 5傷 周 病 の存 在 が心 臓 血 管 疾 患 のリスク因 子 病 の構 成 割 合 をみると，65歳 未 満 では になるとする報 告 (Beck JD, et al., 199 「呼 吸 器 系 の疾 患 」，「循 環 器 系 の疾 患 」， 6)と，両 疾 患 の関 連 性 を支 持 しない報 告 「新 生 物 」の3傷 病 で35.3％であるのに対 (Khader YS, et al., 2004) が存 在 し， し ，6 5 歳 以 上 で は 「 循 環 器 系 の 疾 患 」 の み 見 解 の一 致 をみていない． で32.2％を占 めている．循 環 器 系 の疾 患 歯 周 病 は，主 に嫌 気 性 あるいは通 性 嫌 が ，そ の ま ま 心 臓 血 管 疾 患 に は 当 て は ま ら 気 性 のグラム陰 性 桿 菌 ，スピロヘータなど ないが，多 くの割 合 を占 めていると推 察 さ の口 腔 内 の常 在 細 菌 による日 和 見 感 染 ， れる． あるいは，特 異 性 細 菌 による感 染 症 である． さらに，「循 環 器 系 の疾 患 」の治 療 や療 さらに最 近 では，バイオフィルム感 染 症 とし 養 に 要 す る 医 療 費 は 高 額 と なり ， 患 者 ， 国 ても 認 識 され るよ う に なっ た ．こ の 細 菌 感 染 家 財 政 にも大 きな支 出 となっている．すな に対 して宿 主 側 は，歯 肉 の物 理 的 防 御 わち，平 成 17年 度 の一 般 診 療 医 療 費 は3 機 構 ，好 中 球 による異 物 の貪 食 ，殺 菌 作 3兆 1,289億 円 であり，一 般 診 療 医 療 費 を 用 にて対 応 するが，さらに免 疫 担 当 細 胞 主 傷 病 による傷 病 分 類 別 にみると，「循 環 （マクロファージ，リンパ球 ）が産 生 するサイ 器 系 の疾 患 」5兆 3,792億 円 (21.6％)が最 トカイン（主 にIL-1, IL-6, TNF-α）やプ も多 く，２位 の「新 生 物 」3兆 535億 円 (12. ロスタグランジンなどの炎 症 性 メディエータ 2％)を大 きく引 き離 している．よって CVD ーにより，免 疫 防 御 機 構 を働 かせる．しか の予 防 ，治 療 は，今 後 の日 本 の医 療 にお し，細 菌 性 プラークの除 去 ができないと歯 いて大 きな課 題 である． 周 ポケット内 に存 在 する細 菌 を完 全 に排 前 述 の通 り，CVDには様 々な疾 患 が含 除 するには至 らず，細 菌 刺 激 が慢 性 的 ， ま れ る ．し か し ， 大 部 分 の 心 臓 血 管 疾 患 の かつ持 続 的 に存 在 し続 けることになる．こ 原 因 は，動 脈 壁 が肥 厚 し，弾 性 が低 下 し れにより，炎 症 ，免 疫 応 答 の遷 延 化 が起 て硬 化 する動 脈 硬 化 症 を起 こすことにある． こり ， 歯 周 組 織 は 破 壊 さ れる ．さ らに ， 歯 周 この病 態 は血 栓 症 を引 き起 こし，さらには 組 織 に多 量 に存 在 する細 菌 や過 剰 に産 遠 隔 部 位 の脈 管 の梗 塞 原 因 となり，生 命 生 されたサイトカインが血 中 に流 入 し全 身 2 を循 環 することになる． ⑵実験的歯周炎モデルの作成：生後８週齢の雄 これらの歯 周 組 織 由 来 の細 菌 やサイトカ 性Ap o E ノッ ク ア ウ ト マ ウ ス 60匹を実験に供した． インは，血 液 を介 して動 脈 硬 化 部 に到 達 動物を30匹ずつPBS注入群，I L - 6 注入群の２ し ，さら なる サイ ト カイ ン や 炎 症 性 メ デ ィ エー 群に分け，PBS注入群には0.1% bovine serum ターを産 生 することにより，血 管 内 皮 細 胞 albumin(BSA)含有PBSを，I L - 6 注入群には，こ や活 性 化 マクロファージを刺 激 し，動 脈 硬 の溶液で希釈したrecombinant mouse 500ngIL 化 病 変 を悪 化 させる結 果 が動 物 実 験 で -6（406-ML，R&D Systems，Minnneapolis，MN）， 証 明 されている(Li L, et al., 2002)．す 50µlを腹腔内に注入した．すべての注入，投与 なわち，口 腔 という局 所 性 炎 症 疾 患 である は連続して３日間行った．なお，普通食と飲料水 歯 周 病 が，全 身 性 の動 脈 硬 化 症 に影 響 に関しては両群とも自由摂取させた． を与 える機 序 が明 らかになりつつある． ⑶試 料 の 保 存 (図1)：各群のマウスは投与終了 ２．研究の目的 後，１日，１，４，８，12週で眼窩静脈叢から血液 我 々は，現 在 まで動 脈 硬 化 症 易 形 成 を採取し，その後，各群６匹ずつを安楽死させ， 性 であるApoEノックアウトマウスにPorphyr そのうち２匹は肝臓の外側左葉部を摘出，約30 o mo n a s g i n gi v a l i s を 感 染 さ せ た モ デ ル 動 mgの小片に分け，液体窒素にて瞬間凍結後，- 物 を 作 製 し ， 肝 臓 で の 血清アミロイドA (Seru 80℃フリーザーにて保存，m R N A 検 索 用 試 料 m Amyloid A: SAA)の m R N A 発 現 上 昇 を マ と し ， 残り4匹は心臓から鼠径部までの大動脈を イクロアレイにて検 出 した．さらに，マウスの 摘出，組 織 染 色 用 試 料 と し た ． ま た ， 採取し 歯 周 組 織 にIL-6を注 入 した場 合 ，肝 臓 で た血液は，４℃で一晩放置した後，血清を４℃， のSAAのmRNA発 現 ，血 中 SAAの上 昇 を 20分，2,000Gで遠心分離機により分離，−80℃ 確 認 した(尾 藤 , 2006)．これらの結 果 は， で保存した． 歯 周 組 織 中 の細 菌 ，細 菌 産 生 物 ，あるい は歯 周 組 織 で産 生 されたサイトカインが血 中 に移 行 して肝 臓 に到 達 し，肝 細 胞 を刺 激 してSAAの産 生 上 昇 をきたしたことを示 し て い る ． しかし，現在，SAAの産生上昇による 動脈硬化症の発症，悪化は確認されていない． そこで今回，SAAが，心臓血管疾患の原因とな る動脈硬化症の発症，増大に関与しているか否 ⑷r ea l- t i me PC R 法 ：採取した肝臓の重量を かを検討し，歯周病と動脈硬化症の関連に関す 測定し，約 30mg に調整した後，NucreoSpint® るSAAの関与を検索するのが本研究の目的であ RNAII（740.955.05, タカラバイオ株式会社，東 る． 京） にて total RNA を抽 出 ,そ のうち 1ug を ３．研究の方法 Primescript® RT-PCT Kit（RR014A タカラバイオ ⑴実験動物：A p o E ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス は ， T h e 株式会社，東京）にて逆転写，cDNA を合成した． Jac k so n L a b o ra to r y よ り ，オ リ エ ン タ ル 酵 この cDNA を鋳型とし SAAmRNA の検出，定量 母 工 業 株 式 会 社 バイオ事 業 本 部 を通 じ 化を r eal- ti m e P CR 法 に て 行 っ た ．なお て 雄 雌 の ペ ア を 購 入 し ， 当施設で繁殖させ， PCR はサイバーグリーン法を選択し ,POWER 実験に供し た ． SYBR® GREEN PCR MASTER MIX(436759, 3 Applied Biosystem, USA) を使用し た。検 出は 後の1週，4週，8経過時にはほとんど発現は見ら Applied Biosystem 7500(Applied Biosystem, れなかった．PBS投与群では全期間を通して発 USA)にて行った． 現は認められなかった． ⑸動 脈 硬 化 症 の 発 症 ， 進 行 程 度 の 検 ⑵血中SAA濃度(図３): IL-6投与群では1日経 索 ： 取り出した大動脈を４％パラホルムアルデ 過後にSAAタンパク量が著明に上昇し，その後， ヒド（和光純薬，大阪）にて灌流固定および、後 1週、4週、8週，12週経過時にはほとんど見られ 固定した後、大動脈の内面を開いた。PBS にて なかった．PBS投与群では全期間を通してSAAタ 洗 浄 後 ， Sudan IV 染 色 ンパク量の上昇は認められなかった． 液 (0.5%SudanIV(sigma),35%エタノール,50%ア セトン)にて６分間染色したのち,80％エタノール に５分間脱染色を行った.Sudan IV にて染色さ れ た 大 動 脈 は ， 実 体 顕 微鏡 (LEICAS8APO, Leica Microsystems,Germany)にて撮影し， Image J （ National Institutes of Health, Bethesda, Maryland）を使用して形態計測画 像処理が行った．動脈内壁の脂質沈着（プラー ク）程度は，血管内腔表面積全体に対するプラ ークの割合（プラーク面積／大動脈内腔面積） にて求めた． ⑹血 中 S A A 蛋 白 量 の 測 定 ： E L I S A 法 に て採 取 した血 清 中 のSAA量 を測 定 した．P lateはMouse SAA Immunoassay Kit(K MA0011, Invitrogen, USA)を使 用 し,測 定 はPowerscanHT(DSファーマ,大 阪 )にて 行 った． ⑶病理組織所見: 大動脈弓から鼠径部までの ⑺結果の判定：S A A が 肝 臓 由 来 の も の で あ 大動脈縦断内膜にSudanⅣ染色したところ，IL-6 ることをreal-time PCR法 の結 果 で判 定 し， 投与群では，経時的に脂肪沈着部位が増加し ELISA法により血中SAA量を測定する．病理組 ていた（図４，５）．画像上にて脂肪沈着面積率 織結果からは動 脈 硬 化 病 変 の 悪 化 を 確 認 し ， 動 脈 硬 化 症 の 進 行 度合が血中SAA量に 依存していることを組織所見とELISA所見から判 定，S A A の 産 生 上 昇 に よ る 動 脈 硬 化 症 の 発 症 ， 悪 化 に つ い て 検討した．統計学的検 定は，一元配置分散分析(ANOVA)のBonferroni 法にて有意差検定を行い，危険率5%未満をもっ て有意差ありと判定した． ４．研究成果 ⑴肝臓でのSAAmRNAの発現(図２): IL-6投与 群では1日後にSAAmRNAが著明に上昇し，その 4 を算出すると，図６に示すように，IL-6投与群で 本顎口腔機能学会雑誌， 査読有，17 巻，2011， はPBS投与群と比較して，４週経過以後で脂肪 125-134 沈着率が有意に増加し，動脈硬化病変部が増 ③内田啓一，三木学，吉成伸夫，田口明，角 大していることが認められた． 化 嚢 胞 性 歯 原 性 腫 瘍 の 1 例 の Magnetic resonance (MR)画像-MR imaging (MRI)の信 号強度について-，松本歯学，査読有，36 巻， 2010，214-219 ④西窪結香, 中島靖子，窪川恵太，吉成伸夫， ライフワークとしての歯科衛生士像を考え る―セルフケアが困難でありながら Supportive Periodontal Therapy (SPT)によ り歯周組織の改善が得られた症例を通して ―，日本顎咬合学会誌，査読無，30 巻，2010， 以上の結果より，IL-6を投与することで，ApoE 236-244 ノックアウトマウスのSAAは，mRNA，タンパク量と ⑤Hishikawa T, Izumi M, Naitoh M, Furukawa もに1日後に著明に増加した，さらに血管内膜へ M, Yoshinari N, Kawase H, Matsuoka M, の脂肪沈着量も増加した．すなわち，局所の炎 Noguchi 症性疾患である歯周炎部位で産生されるIL-6は， T, Ariji E, The effect of horizontal X-ray beam angulation on the 肝臓を刺激して，SAAが産生され動脈硬化症を detection 誘導していることが確認された．今後，大動脈お of furcation mandibular first よび心臓の組織にてSAAおよびSAAレセプター molars defects of in intraoral radiography, Dentomaxillofac. Radiol. ， を免疫染色することにより，動脈硬化症に対する 査読有，39 巻，2010，85-90 作用機序を解明していく予定である． ⑥Yoshiko Ariji, Akira Taguchi, Shigemitsu ５．主な発表論文等 Sakuma, （研究代表者、研究分担者及び連携研究者に Manabu Miki, Takayuki Asawa, Keiichi Uchida, Nobuo Yoshinari, Yuichiro は下線） Hiraiwa, Yoshitaka Kise, Masahiro Izumi, 〔雑誌論文〕（計10件） ①A Taguchi, N Sugino, M Miki, Y Kozai, N Munetaka Mochizuki, H Osanai, S Yamada, H Kuroiwa, Eiichiro Ariji, T Fujiki, K Uchida, N Yoshinari, and I Oral Pathol．Oral Radiol． Endod.，査読有， Kasai, Detecting young Japanese adults 109巻，2010，908-916 with undetected low skeletal bone density ⑦西田英作，横井隆政，窪川恵太，阪中孝一 using radiographs, 郎，匹田雅久，吉成伸夫，歯科用レーザーが Dentomaxillofacial Radiology，査読有，109 植え込み型除細動器へ与える電磁障害につい 巻，2011，154-159 て，日本レーザー歯学会誌，査読有，20巻， ②山口正人,足立忠文,大石めぐみ, 中塚久 2009，54-61 美子,横井磯子,吉成伸夫,黒岩昭弘,増田裕 ⑧三木学, 内田啓一，浅輪貴行，上原大輔， 次，健常高齢者における多方位口唇閉鎖力 深澤常克，吉成伸夫，田口明，MR sialography その特性と体格・握力・残存歯との関連，日 の有用性，松本歯学，査読有，35 巻，2009， panoramic 5 Naitoh, Akitoshi Katsumata, Oral Surg． Oral Med． 33-34 術大会, 2010 年 5 月 11 日, (岡山) ⑨ Catherine Champagne, Nobuo Yoshinari, ⑤吉成伸夫，前島信也，歯周治療と全身疾患 Joyce Oetjen, Estelle Riché, James Beck, との関わりについて. 平成 21 年度長野県歯 Steven Offenbacher, Gender Differences in 科医師会第 2 回学術大会(東海信越地区歯科 Systemic 医学大会分科会併催), 2010 年 1 月 31 日, (塩 Inflammation Formation gingivalis and Following Infection Apolipoprotein Atheroma Porphyromonas in E-Deficient 尻) 〔図書〕（計 2 件） Heterozygous ①横井磯子，吉成伸夫，Dd デンタルダイヤモ Mice ， J. ンド社(東京)，こんな事故が起こったらポケ Periodont. Res.，査読有，44巻，2009，569-577 ットブックトラブル vs リカバリー，2010， ⑩吉成伸夫，横井隆政, 歯周病と動脈硬化性 106-107，108-109，110-111 疾患との関連性，松本歯学，査読無，34巻， ②稲垣幸司，三谷章雄，山本弦太，伊藤正満， 2008，255-277 菊池毅，石原裕一，野口俊英，石原磯子，上 〔学会発表〕（計5件） 條博之，坂本浩，河谷和彦，吉成伸夫，株式 ①Akira Taguchi, Manabu Miki, Keisuke 会社第一歯科出版(東京)，最新の歯周外科手 Migita, Yukihito Higashi, Nobuo Yoshinari, 術をマスターしよう－基本から高度症例の応 Association of tooth loss with silent 用まで－，株式会社第一歯科出版(東京)，2010， lacunar infarction. IADR/AADR/CADR 89th 72-85，96-97，124-130 General Session & Exhibition, 2011年3月18 ６．研究組織 (1)研究代表者 吉成 伸夫（YOSHINARI NOBUO） 松本歯科大学・歯学部・教授 研究者番号：20231699 日, (San Diego, USA) ② Manabu Miki, Akira Taguchi, Yukihito Higashi, Nobuo Yoshinari, Comparison of content of water in the muscles of (2)研究分担者 土田 祥央（TSUCHIDA SACHIO） 松本歯科大学・歯学部・助教 研究者番号：90410422 mastication. IADR/AADR/CADR 89th General Session & Exhibition, 2011年3月18日, (San Diego, USA) ③Keita Kubokawa, Eisaku Nishida, Hiroyuki 横井 隆政（YOKOI TAKAMASA） 松本歯科大学・歯学部・講師 研究者番号：40469010 Kamijyou, Akira Taguchi, Nobuo Yoshinari, Effect of atherosclerogenesis by SAA in ApoE efficient mice. The 96th Annual Meeting (3)連携研究者 研究者番号： of the American Academy of Periodontology held in collaboration with the Japanese Society of Periodontology, 2010年10月31 日, (Honolulu, USA) ④三木学，佐藤徳志，窪川恵太，西田英作， 横井隆政，吉成伸夫，内田啓一，田口明，松 本歯科大学病院受診患者における実態調査歯周病科受診患者のデンタルエックス線写 真による検討-第 52 回春季日本歯周病学会学 6
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