Protein Expression コーナー 脂質系試薬によるマウス繊維芽細胞 NIH 3T3 のトランスフェクショ ン-その比較検討 イントロダクション 脂質系トランスフェクション試薬が入手可能と 細胞のトランスフェクション なる前は、マウス繊維芽細胞 NIH 3T3 は本質的に 細胞はそれぞれの使用説明書と推奨の至適化パ トランスフェクションできず、レトロウイルスに ラメータに従い、以下のトランスフェクション試 よる遺伝子導入などの方法が、この問題を克服す 薬で行いました：FuGENE 6、FuGENE HD、LT-1、 るために採用されてきました。レトロウイルスは LX、LX + PLUS の各トランスフェクション試薬で 100%の細胞でのトランスジーンの発現に使用で す。 きますが、その発現は弱いものでした。それに加 え、NIH 3T3 細胞は伝統的に細胞の形質転換研究 トランスフェクション効率と細胞毒性 に使用され、癌遺伝子を作るレトロウイルスは安 トランスフェクションされた細胞のパーセンテ 全性の問題からも有用ではありません。最近は、 ージは蛍光顕微鏡の各視野内の GFP 発現細胞の数 レンチウイルスが細胞での高遺伝子発現(100%ま を数え、トータルの細胞数で割り、測定しました。 で)の目的で使用されています。しかしながら、、こ これはウェル毎に 5 回行い、平均を取りました。 の方法はやはり安全性の問題が大きく、安全性レ 次に細胞を 4%パラフォルムアルデヒドで固定し、 ベル 2+の培養施設の新設が要求され、コスト的に スライド上で Leica SP2 顕微鏡を用いて、可視化 高く時間もかかります。それゆえ、施設の新設や および定量化しました。細胞毒性は未トランスフ 癌遺伝子を持つウイルスを使用することなく細胞 ェクション細胞と比較して、トランスフェクショ の形質転換研究が行える、NIH 3T3 細胞をトラン ンの 48 時間後に生細胞数を数えることで評価しま スフェクションできる最良の脂質系試薬を決定す した。 ることには大きな興味があります。NIH 3T3 細胞 で良好に作動すると主張する、3 つのメーカーより の 5 種類の脂質系試薬を細胞毒性、トランスフェ クション効率、至適化の負担の点について比較し ました。 材料と方法 細胞培養 結果 至適化 すべての試薬で至適化は容易で、1 ラウンドの実 験のみしか必要ではありませんでした。トランス フェクション試薬 LT-1 はテストしたすべてのパラ メータで最小の差異で、至適化では効率や細胞毒 性に変化は見られませんでした。他の試薬はすべ NIH 3T3 細胞（ATCC CRL-1658）と HA-RAS てのテスト条件間で変動が見られました。トラン 形質転換 NIH 3T3 細胞を 24 ウェルディッシュの スフェクション効率のパーセンテージは表 1 に要 1 ウェル中の 4 枚からなるカバースライド当り 約してあります。とりわけ、トランスフェクショ 25,000 個の密度で播種しました。24 時間後に、細 ン試薬 LX は脂質：DNA コンプレックスのインキ 胞を 0.5μg の EGFP プラスミドでトランスフェク ュベーションの後に培地交換を必要とし、細胞毒 ションし、その 48 時間後に GFP 発現細胞数を数 性も他の試薬と異なり 50%以上でした（データ未 えることでトランスフェクション効率を測定しま 掲載）。また、他のトランスフェクション試薬では した。 トランスジーンの発現を測定するまで更なる操作 ステップは必要としませんでした。 Protein Expression コーナー 細胞毒性 他の試薬のトランスフェクション効率は無視でき るものでした。 トランスフェクション試薬 LX 単独、あるいは LX + PLUS で細胞毒性が観察されましたが、他の 討論 試薬は脂質：DNA コンプレックスとのインキュベ ーションを延長しても細胞を殺さず、最小限の細 トランスフェクション試薬 LX は、in vivo スタ 胞毒性でした。 ディでは同等のレベルでトランスフェクションで きました；しかしながら、細胞毒性があり、健康 トランスフェクション効率 な NIH 3T3 細胞が必要とされる研究では採用でき ないでしょう。この試薬はまた、トランスフェク すべての試薬は、トランスフェクション効率の 指標である EGFP を発現した細胞のパーセンテー ションとその至適化に多大な時間を必要とします。 ジを見るため、至適な条件化で比較されました。 LT-1 は 至 適 化 パ ラ メ ー タ に わ た り 均 質 で 、 FuGENE HD と FuGENE 6 は形質転換 NIH 3T3 FuGENE 6 は未形質転換細胞に置いて僅かに高い 細胞において最も良いトランスフェクション効率 トランスフェクション効率を示しましたが、 を示し、特に FuGENE HD は未転換細胞において FuGENE 6 と LT-1 はすべてのテストされたパラ すべての試薬を凌駕していました（表 1、図 1 と 2）。 メータでほぼ同等の性能を示しました。FuGENE トランスフェクション試薬 LX + PLUS では大量 HD は形質転換および未転換 NIH 3T3 細胞の両方 の細胞死を引き起こしましたが、トランスフェク において最良のトランスフェクション効率を示し、 ション試薬 LX を除くすべての試薬が形質転換細 細胞毒性もありませんでした。また、他の試薬に 胞において、60%の細胞をトランスフェクション 比べて至適化も簡単でした。これら事実を総合す できました（表 1)。未形質転換細胞においては、 ると、NIH 3T3 の脂質系でのトランスフェクショ FuGENE 6 と FuGENE HD は他の試薬を凌駕し、 ンにおいて、FuGENE HD は最良の試薬でした。 表 1：この研究に使用した脂質系試薬の至適化のサマリー トランスフェクションされた HRAS NIH 3T3 細胞（％） 試薬：DNA 比 3：２ 2：1 5：2 3：1 7：2 4：1 6：1 8：1 細胞毒性 （%細胞死） FuGENE HD 10 FuGENE 6 50 40 55 65 75 75 60 LT-1 0 55 60 60 60 0 45 0 LX 10 35 45 30-40 LX + PLUS（0.5μl） 10 30 60 30-40 LX + PLUS（1.0μl） 10 30 60 30-40 トランスフェクションされた NIH 3T3 細胞(％) 試薬：DNA 比 3：２ 2：1 5：2 3：1 7：2 4：1 6：1 8：1 細胞毒性 （%細胞死） FuGENE HD 5 FuGENE 6 15 LT-1 15 25 28 28 35 30 20 0 25 10 10 0 20 0 LX 0 10 15 40-80 LX + PLUS（0.5μl） 10 10 15 40-60 LX + PLUS（1.0μl） 5 15 30 50 Protein Expression コーナー 図 1：NIH 3T3 細胞の GFP トランスフェクション効率。 (a) トランスフェクション試薬 LT-1、(b) FuGENE 6、(c) FuGENE HD。 図 2：Ras-NIH 3T3 細胞の GFP トランスフェクション効率。 (a) トランスフェクション試薬 LT-1、(b) FuGENE 6、(c) FuGENE HD。
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