昭和62年12月20日 1401 イ ン フル エ ンザ様 患 者 か らの ウイル ス分離 法 につ い ての検 討 ―MDCK凍 結 保 存細 胞 を用 い た イ ン フル エ ンザ ウイル ス の分離 ― 長野県衛生公害研究所 中 村 和 幸 西 沢 修 一 松岡医院 松 岡 伊 津 夫 (昭和62年5月7日 受付) (昭和62年7月14日 受理) Key word: Influenza virus, Virus isolation, MDCK cell 要 旨 イ ンフルエ ンザ ウイルス分 離 の省力 化 と即時対 応 を容 易 にす るため,凍 結 保存 細胞 へ直 接検 体 を接種 す る方 法 を検討 し,以 下 の成 績 を得た. 1) MDCK細 胞 は,低 温保 護剤 としてDMSOを 使 用 した場 合,-80℃ 保存 で6ヵ 月後 も95%以 上 の生 存 率 を示 した. 2) MDCK凍 結保 存細 胞 は イ ンフルエ ンザ ウイルス標 準株 に対 して高 い感 受 性 を示 した. 3) 患者 検体 か らの ウイル ス分離 にお い てMDCK凍 結 保存 細 胞 は単 層培 養 細胞 に劣 らない成 績 を示 した. 4) 凍結 保存 細胞 を ウ イル ス分 離 に用 い るこ とに よ り,即 時対応 が可 能 とな る と同時 に,細 胞 培養 の設 備 や経 験 の ない検査 室 で も容易 に イン フルエ ンザ ウイル スの分離 を行 うことが で き る. 1. は じめ に この よ うな条 件 を 満 た す 方 法 と して,著 者 らは イ ン フル エ ン ザ の 流 行 は,短 期 間 に爆 発 的 に拡 これ まで にMDCKお よ びESK細 大 す るた め,早 急 な 病 原 決 定 を せ ま られ る場 合 が 来 株 化 細 胞,ATCC, CCL 多 い. 胞(豚 胎 児 腎 由 184)の 浮遊 培養細胞 を 用 い た ウ イ ル ス 分 離 法 を 検 討 し報 告 し て き イ ン フル エ ン ザ の ウ イ ル ス検 査 にMDCK細 胞 た4)5).こ の 方 法 は た だ ち に 使 用 可 能 な 状 態 の細 胞 等1)∼3)の 細 胞 が 用 い られ る よ うに な って 以 来,分 を常 時 十 分 量 用 意 で き る た め,イ 離 率 も高 くな り,検 査 に要 す る 日数 も短 縮 され た 突 発 的 発 生 や 連 続 的 発 生 に も無 理 な く対 応 す る こ が,ま だ 十 分 とは 言 え な い.単 とが で きた. に早 期 実 験 室 診 断 ン フル エ ン ザ の の み を 目的 とす るな らば,患 者 塗 沫 標 本 につ い て しか し,こ の 方 法 は あ る程 度 の設 備 と細 胞 培 養 の蛍 光 抗 体 法 で迅 速 な病 原 決 定 を 行 うこ と も可 能 の経 験 が 必 要 で あ り,浮 遊 培 養 細 胞 の 維 持 管 理 も で あ る.し か し,分 離 ウイ ル ス の抗 原 分 析 や 分 離 や や煩 雑 で あ る.そ の た め,イ 株 を 抗 原 と して 抗 体 検 査 を 行 うな ど,引 続 き ウィ ル ス 分 離 の省 力 化 を は か り,細 胞 培 養 の 設 備 や 経 ル ス学 的 な検 査 を 進 め て 行 くた め に は,適 験 の な い 検 査 室 で も ウ イ ル ス分 離 を 行 え る方 法 と 当 な増 ン フル エ ン ザ ウ イ 殖 系 を 使 っ て 十 分 な量 と力価 の ウイ ル スを 得 る 必 して,凍 結 保 存 細 胞 へ 直 接 検 体 を接 種 す る方 法 を 要 が あ る. 検 討 した の で報 告 す る. 別刷 請 求 先:(〒380)長 2. 方 野 市 安茂 里 米 村1978 長 野 県 衛 生公 害 研 究所 中村 和幸 1) 細 胞 の 凍 結 保 存 法 法 1402 感 染 症 学雑 誌 MDCKお よ びESK細 リ プ シ ン-EDTAで 10%新 胞 の 単 層培 養 細 胞 を ト 分 散 し た 後,10%DMSO, 生 仔 牛 血 清 添 加 のEagle's cells/mlの ガ ー ゼ に 包 み,発 時 間 吸 着 後,Table MEMで6×106 細 胞 浮 遊 液 を 調 製,1mlつ チ ュ ー ブ に 分 注 し た.こ を 分 注 し,34℃ つ テ フ ロン の テ フ ロ ンチ ューブ を 泡 ス チ ロ ール の 箱 に 入 れ た ま ま-80℃ の フ リ ー ザ ー で 凍 結 し た.そ 月 に1本 づ つ 取 り 出 し ニ グ ロ シ ン 染 色6)を 行 い, 細 胞 の 生 存 率 を 調 べ た.生 に し て 行 っ た.凍 で10倍 の 後,1カ 存 率 の算 定 は 次 の よ う 結 保 存 細 胞 を 微 温 湯 で 融 解 後, Hanks'BSSで2回 洗 い,0.05%ニ に 希 釈 し,室 温30分 グ ロ シ ン溶 液 染 色 後,Tatai式 血 算盤 を 用 い て 全 細 胞 数 と死 細 胞 数 を か ぞ え,そ の差を 1に 示 した 細 胞 維 持 液0.7ml のCO2培 始 後5日 間HA価 凍 結 保 存 細 胞 の イ ン フル エ ン ザ ウ イ ル ス 感 養 器 で 培 養 した.培 養 開 を 測 定 した. 3) 患 者 検 体 か らの ウ イ ル ス 分 離 1983年1月 か ら3月 に か け て 採 取 し た200名 の イ ン フル エ ンザ 様 患 者 の 咽 頭 ぬ ぐい 液 をMDCK 凍 結 保 存 細 胞 へ 接 種 し,ウ イ ル ス 分 離 を 行 った. また,同 じ検 体 をMDCK単 層 培 養 細 胞 へ も接 種 し成 績 の 比 較 を行 った. 検 体 採 取 は次 の よ うに して 行 った.す Eagles MEMに 患 者 咽 頭 ぬ ぐい 液 中 の平 均 ウ イ ル ス量 で あ っ た 4.6×103PFU/ml5)に イ ル スA/熊 調 製 し た,イ 牛 血 清 ア ル ブ ミン を1%,ペ リン1,000U/ml,ス リシ トレ プ トマ イ シ ン1000μg/ml, 加 し た 検 体 保 存 液2ml を 分 注 した 容 器 を 事 前 に 医 院 へ 配 布 して お き,イ ね い に ぬ ぐい,容 器 内 で よ く絞 りだ し密 栓 して 凍 ン フル エ ン ザ ウ 本/37/79(HINI),A/新 潟/102/81 (H3N2),B/Singapore/222/79をESK浮 Table 1 Composition maintenance after of medium inoculation 遊培 養 細 胞 で の 至 適 細 胞 濃 度 で あ っ た6×106cells/m15) のMDCK凍 結 保 存 細 胞 に 接 種 し,HA産 生 を調 べ た. 接 種 の 方 法 は,凍 結 保 存 細 胞 を 微 温 湯 で 融 解 し, 血 清 ア ル ブ ミ ン 添 加 のEagle's 回 洗 っ た 後,同 mlづ なわ ち, ン フル エ ン ザ様 患 者 の咽 喉 頭 部 を滅 菌 綿 棒 で て い 受 性. 1%牛 第12号 ウイ ル ス 液 を接 種 し,1 フ ァ ン ギ ゾ ン2.5μg/ml添 生 存 細 胞 数 と し て 百 分 率 で 表 し た. 2) の細 胞 浮 遊 液 に0.2mlの 第61巻 つ12ウ じ液 で6×106cells/mlに MEMで2 戻 し,0.1 エ ル の マ ル チ デ ィ シ ュ に 分 注 し た.こ Fig. 1 Method of inoculation of a specimen Adjust PH value with 7.5% NaHCO3 to cells of stored in a frozen state. for cell 昭和62年12月20日 1403 Fig. 2 Rate of survival MDCK of cells for six months cells Fig. 3 結 状 態 の ま ま 輸 送 し た. 凍 結 保 存 細 胞 へ の 接 種 は2,2)と after freezing. ESK cells HA production influenza 同 様,Fig.1 in a frozen に 示 し た 方 法 で 行 っ た. of the standard virus inoculated into MDCK strains of cells stored state. 単 層 培 養 細 胞 へ の 接 種 は 定 法 に 従 って 行 っ た7). 検 体 接 種 後 毎 日観 察 し,CPEの ∼5日 後 にHA価 を測定 し ,ニ 進 展 に 応 じ て3 ワ ト リ免 疫 血 清 を 用 い て 同 定 し た. 3. 1) MDCKお Fig.2に は1カ 成 績 よ びESK凍 結保 存細胞 の生存率 示 し た よ う に,MDCK細 月 後95.2%,2ヵ 95.8%,4ヵ は-80℃ ESK細 月 後97.9%,3ヵ 月 後96.3%,5ヵ 月 後96.0%で あ っ た.こ 保 存 で95%以 も80%近 し,低 月 後96.4%,6カ 胞 上 の 高 い 生 存 率 を 示 し た. 月 後73.6%,2ヵ 月 後76.9%,4ヵ 月 後79.8%,6ヵ 月 後 の よ う にMDCK細 胞 の 生 存 率 は1ヵ 77:7%,3ヵ 胞 の生存 率 月後 月 後76.6%,5カ 月 後77.5%で あ っ た.ESK細 い 生 存 率 を 示 し た が,MDCK細 胞 胞 に比 較 2) い 生 存 率 で あ っ た. 凍 結 保 存 細 胞 の イ ン フル エ ン ザ ウ イ ル ス 感 受性 ウ イ ル ス 接 種 後5日 こ ろ,Fig.3に (HINI)は2日 き,4日 間HA産 後8倍,3日 目 以 降 は256倍 後64倍 のHA価 潟/102/81(H3N2)は2日 倍 とA/熊 生 を 観 察 した と 示 し た と お り,A/熊 本/37/79(HINI)に 本/37/79 と上 昇 し て 行 を 示 し た.A/新 後 に4倍,3日 後 に32 比 較 しや や 低 い HA産 生 を 示 し た が,4日 目 以 降 は256倍 価 を 示 し た.B/Singapore/222/79は,2日 倍 のHA価 を 示 し,3日 目 に は256倍 のHA 目 に16 の ピ ー ク値 に 達 し た. 3) 患 者 検 体 か らの ウイ ル ス 分 離 成 績 200名 の イ ン フ ル エ ン ザ 様 患 者 か らMDCK凍 1404 感 染 症 学 雑誌 Table 2 Comparison of results of isolation of influenza virus 第61巻 第12号 from patients seemingly affected with influenza among two methods with MDCK cells of monolayer culture and MDCK cells stored in a frozen state 結 保 存 細 胞 お よ びMDCK単 層培養 細胞 を用 いて ウ イ ル ス 分 離 を 行 っ た と こ ろ,Table とお り,凍 結 保 存 細 胞 で136株(分 2に 示 した HA産 生 を 観 察 した と こ ろ,い づ れ の株 も3∼4 日後 に は256倍 のHA価 を 示 し,患 者 検 体 か ら の ウイ ル ス分 離 に応 用 す る に十 分 な 感 受 性 を 持 っ て 離 率68.0%), 単 層 培 養 細 胞 で137株(分 離 率68.5%)の インフル エ ンザ ウ イ ル ス が 分 離 され た.分 離 され た ウ イ ル い た. ス は す べ てAH3N2型 エ ンザ 様 患 者200名 の 検 体 に つ い て,MDCK凍 の イ ン フル エ ンザ ウ イ ル ス で あ っ た. 1983年1月 か ら3月 に か け て 採 取 した イ ン フル 結 保 存 細 胞 お よ び単 層 培 養 細 胞 を用 い て ウイ ル ス分 4. 考 MDCK細 察 離 を行 った と ころ,143検 体 か らAH3N2型 胞 は 飛 田 ら1)2)によ って,患 者 検 体 か フ ル エ ン ザ ウ イ ル ス が 分 離 さ れ た.分 らの ウ イル ス 分 離 に お い て,発 育 鶏 卵 に 劣 ら な い Table 成 績 が 得 られ る こ とが 明 らか に さ れ て 以 来,イ 層 培 養 細 胞68.5%で ン の イン 離率は 2に 示 した とお り,凍 結 保 存 細 胞68.0%,単 ほ ぼ 同 等 の感 受 性 を 示 した. フ ル エ ンザ ウ イ ル ス の 分 離 に広 く用 い ら れ て い 凍 結 保 存 細 胞 へ の検 体 接 種 は原 則 と し て検 体 搬 入 る.一 方,ESK細 当 日に 行 った た め,3∼5日 胞 に つ い て は,村 上 ら8),山岸 ら9) に よ り トリイ ン フル エ ン ザ ウイ ル ス お よび ヒ トイ 後 に は イ ン フル エ ン ザ ウイ ル ス の 同定 型 別 を 行 うこ とが で きた. ン フル エ ン ザ ウ イル ス に対 して 高 い感 受 性 を 持 つ イ ン フル エ ンザ の 流 行 シ ーズ ン前 に 十 分 量 の 細 こ とが 明 らか に され て い るが,患 者 検 体 か らの ウ 胞 を 凍 結 保 存 して お く こ とに よ り,突 発 的 イ ン フ イ ル ス分 離 に は,ま だ ほ とん ど使 用 さ れ て い な い. ル エ ン ザ の 発 生 に も 容 易 に 対 処 す る こ とが で き しか し,著 者 ら は,こ の 細 胞 の浮 遊 培 養 法 を検 討 る.ま た,連 し,浮 遊 培 養 細 胞 を 用 い て イ ン フル エ ンザ ウ イル 日に何 回 も検 体 が 持 ち 込 ま れ た よ うな場 合 に も支 ス の 分 離 を 行 い,良 障 な く対 応 す る こ とが で き る. そ の た め,こ い成 績 を得 て い る5). の 実 験 に お い て も ウイ ル ス分 離 に 使 用 す る細 胞 と して,MDCK細 日の よ うに検 体 が 搬 入 さ れ た り,1 ウ イル ス分 離 に 使 用 す る凍 結 保 存 細 胞 は,凍 結 時 に細 胞 数 を 算 定 し,6×106Cells/mlに 胞 お よ びESK細 調整 し 胞 を 選 び,低 温 に お け る細 胞 の保 存 状 態 を 観 察 し て お け ば,検 体 接 種 の た び に細 胞 数 を か ぞ え る必 た.そ の結 果,MDCK細 要 は な い: 胞 は6ヵ 月 間95%以 高 い細 胞 生 存 率 を示 した の に対 し,ESK細 存 率 は80%以 MDCK凍 MDCK凍 下 で あ った.そ 上の 胞 の生 こで,以 後 の 実 験 は 結 保 存 細 胞 の イ ン フ ル エ ンザ ウ イ ル ン 株 で あ ったA/熊 102/81(H3N2), 本/37/79(HINI),A/新 B/Singapore/222/79を 培 養 器 で 培 養 を行 った が,試 験 管 を用 い て 普 通 の ふ 卵 器 で 培 養 して も良 い. 結 保 存 細 胞 を 用 い て行 った. ス に対 す る感 受 性 を調 べ るた め,1982年 また,本 実 験 で は マ ル チ デ ィシ ュを 用 い て,CO2 事 前 に細 胞 を 入 手 し,凍 結 保 存 して お く こ と さ の ワ クチ え で きれ ば,細 胞 培 養 の 設 備 や 経 験 を 持 た な い 検 潟/ 査 室 で も容 易 に イ ン フル エ ン ザ ウ イル ス の 分 離 を 接 種 し, 行 う こ とが で き る もの と考 え る. 昭和62年12月20日 1405 終 りに,御 校 閲 を戴 き,ま た ウ イル ス株 の分与 を願 った 4) 中 村 和 幸, 西 沢 修 一: の 分 離. に深 く感 謝 の意 を表 します. 1) Tobita, 5) 文 献 Permanent K.: canine 感 染 症 学 雑 誌, 中 村 和 幸, 西 沢 修 一: 胞 の浮 遊培 養 お よ 54: 306-312, ESK浮 1980 . 遊培養細胞によるイ ン フ ル エ ン ザ ウ イ ル ス の 分 離 .感 染 症 学 雑 誌, 60: kidney 1284-1293, (MDCK) cells for isolation and plaque assay of influenza B viruses. Med. Microbiol. Immunol., 162: 23-27, 1975. 2) Tobita, K., et al.: Plaque assay and primary isolation of influenza A virus in an established line of canine kidney cells (MDCK) in the presence of tripsin. Med. Microbiol. Immunol., 162: 9-14, 1975. 3) Frank, A.L., et al.: Comparison of different tissue cultures for isolation and quantitation of influenza and parainflueza viruses. J. Clin. Microbiol., 10: 32-36, 1979. 6) 北 村 1986. 敬: ウ イ ル ス 検 査 の た め の 組 織 培 養 技 術. 近 代 出 版, 1976, 7) 根 路 銘 国 昭: p.100-101. MDCK細 胞 に お け る イ ン フル エ ン ザ ウイ ル スの 分 離 臨 床 病 理, 特 集 第35号, 112 -115 , 1978. 8) 村上 洋 介 ほ か: 各 種 培 養細 胞 の トリイ ン フル エ ン ザ ウイル ス に対 す る感受 性. 第86回 日本獣 医学 会 講演 要 旨集, 1-62, 1978. 9) 山岸 郭 郎 ほ か: ブ タ腎株 化 由来 細胞 の イ ン フル エ ンザ ウ イル ス に対 す る感 受 性 . 第53回 日本 感染 症 学 会 学 術 講演 抄 録15, Studies on Isolation of Virus from Patients ―I solation of Influenza Virus by MDCK Kazuyuki MDCK細 び浮 遊 培 養細 胞 を用 い た イ ン フル エ ンザ ウイ ル ス 千 葉 県血 清研 究 所(前 国 立 予防 衛 生 研究 所)武 内安 恵 博士 NAKAMURA 1979. Seemingly Affected with Influenza Cells Stored in a Frozen Stat e― & Shuichi NISHIZAWA Nagano Research Institute for Health and Pollution Itsuo MATSUOKA Matsuoka Hospital To save influenza been stored 1. they labor virus, MDCK virus. 3. used state It was for influenza experienced the for even workers. on The in the to take at virus. a 95% state of virus were with after which as for a high obtained was time into of isolation cells of which had use lacking a low-temperature susceptibility from these in to from agent, the stored could equipment standard MDCK culture cells cells the patients, monolayer when of protecting 6 months. collected countermeasure the the directly obtained. presented samples at a sample DMSO storage from immediate countermeasure inoculate to those Furthermore, laboratory to results inferior an immediate at -80•Ž than a frozen not an a method following isolation of take stored of more results possible isolation virus stored gave to made were rate cells When 4. used state. cells a survival 2. it easy were MDCK showed a frozen make in a frozen When influenza in and studies strain cells stored cells. in a frozen make for of it cell easy culture state to were isolate and in
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