石井分子遺伝学研究室 Molecular Genetics Laboratory 主任研究員石井俊輔 ISHII, Shunsuke 生き物の固有の特徴となっているさまざまな形質が,どのように発現し制御されているのかという問題は,生物学における大きな命題となっている。近年の遺伝子操作技術の発達は,遺伝子の発現制御機構に分子レベルで迫る手だてを与えた。特に細胞増殖に関する研究は飛躍的に進み,細胞への増殖・分化のシグナルは膜受容体,シグナル伝達物質により引きつがれ最終的には核内に伝達されると考えられるようになった。しかし,どの遺伝子産物がどの遺伝子をいかなるメカニズムで活性化するのか,それがいかにして細胞シグナル伝達機構と関わっているのか,さらには,それがいかに細胞の分化・がん化につながるのかといった問題に関しては明らかにされるべき点が多い。当研究室では遺伝子発現制御機構を分子レベルで解析することによって,これらの問題を解明することを目指している 1. 遺伝子発現制御因子として機能する核内がん遺伝子産物の研究（石井（知），野村，森田＊3，倉橋＊3，山内＊2，田畑＊3，石井（俊））私達は昨年度、WntシグナルがTAK1、HIPK2、NLKを経て、c-Mybに伝達され、c-Mybのリン酸化を誘導し、c-Mybのプロテアソーム依存的な分解を誘導することを明らかにした。動物のMybファミリーにはc-Mybの他に、A-MybとB-Mybが存在する。これらのMybファミリータンパク質がWntシグナルによって制御されるメカニズムを解析した。WntシグナルはA-Mybの転写活性化能を低下させるが、それはA-Mybタンパク質の分解によるものではなかった。HIPK2とNLKはA-Mybタンパク質にヒストンメチル化酵素をリクルートし、A-Myb標的因子の転写制御領域のヒストンH3-K9のメチル化を誘導することによって、転写を抑制することが明らかにされた。一方、B-Mybの転写活性化能もWntシグナルによって阻害されるが、この場合にはB-Mybタンパク質の分解誘導とヒストンH3-K9のメチル化誘導の２つのメカニズムが同時に関与していた。このように、すべてのMybファミリー転写因子の活性は、Wntシグナルによって阻害されるが、そのメカニズムはメンバーや細胞によって異なることが示唆された。 WntシグナルはMybファミリー転写因子の活性を阻害することによって、造血細胞の分化などの種々の生命現象をコントロールしていると推定されるので、この分子メカニズムの多様性は興味深い。一方、c-Mybに結合する新規因子としてTRAF7を、酵母Two-Hybridスクリーニング方法によって同定した。TRAF7は核膜外に局在し、c-Mybを細胞質に留めることによって、c-Myb活性を負に制御することが明らかにされた。そのメカニズムを解析した結果、TRAF7はc-Mybの特異的部位にSumoを結合させるE3リガーゼとして機能することが示された。このように、TRAF7はc-Myb のSumo化を誘導し、c-Mybの核内への移行を阻害する制御因子であることが明らかにされた。TRAF7はTNF-αなどによって制御されることがすでに示されている。従って、本研究の成果は、TNF-αがTRAF7を介してc-Myb活性を制御する可能性を示唆しており、この制御系がどのような生命現象において用いられているか、大変興味深い。 2. 細胞外刺激による遺伝子発現誘導の研究（Jin＊1，高木，金刺＊1，前川，Kim＊1，石田尾＊1，牧野＊2，広瀬＊3，島田＊4，品川，石井（俊）） Schnurri（Shn）ファミリー転写因子は、私達を含む複数のグループによって同定された転写因子であり、２セットのメタルフィンガー構造を含む約300 kDaの大きなタンパク質である。動物のShnファミリーは１〜３の３つのメンバーを含むが、これらの因子の生理機能は、不明な点が多い。Shn-2の生理機能を明らかにするため、変異マウスを作製し、解析した。Shn-2変異マウスには白色脂肪組織の形成不全が観察された。また、MEFs（Mouse Embryonic Fibrobalsts）を試験管内で脂肪細胞に分化させる系においても、Shn-2変異細胞は脂肪細胞への分化効率が低いことが認められた。特にBMP依存的な脂肪細胞分化が低下していた。Shn-2変異細胞から調製したRNAを用いてアレイ解析を行い、Shn-2の標的遺伝子の同定を試みた結果、Shn-2変異細胞では PPARγ2遺伝子の発現が顕著に低下していた。PPARγ2は脂肪細胞分化を制御する鍵として有名な転写因子であり、Shn-2変異細胞において、この因子を強制発現させると、脂肪細胞への分化能は回復した。Shn-2がPPARγ2遺伝子発現を制御するメカニズムを解析した結果、Shn-2はBMP刺激によって、細胞質から核内へ移行し、PPARγ2遺伝子プロモーター上で、Smad1/4やC/EBPα などの他の転写因子と複合体を形成し、これらの転写因子による協調的な転写活性化に関与することが明らかにされた。このように、Shn-2はBMP依存的な脂肪細胞分化を制御する転写因子であることが示された。 3. ショウジョウバエを用いた転写制御因子の遺伝学的解析（岡村＊3，志水＊1，長尾＊1，Seong＊4，石井（俊）） ATF-2は私達が同定した転写因子であり、p38/JNKなどのストレス応答性キナーゼによってリン酸化され活性化される。ATF-2 の生理機能を遺伝学的に解析することを目的として、ショウジョウバエATF-2（dATF-2）の同定を試みた。動物ATF-2とのホモロジーを基に、dATF-2を同定した。動物ATF-2とdATF-2との間には、B-ZIP構造を含むDNA結合ドメインと、p38リン酸化部位において、高いホモロジーが存在した。浸透圧ストレス、紫外線照射、熱ストレスなどによって、 dATF-2はp38によってリン酸化され、活性化された。またdATF-2は発生の初期段階から種々の組織で発現しており、種々の発生プロセスの制御に関与することが示唆された。dATF-2が同定されたことによって、今後ショウジョウバエ遺伝学を用いたATF-2の生理機能の解明が大きく進展することが期待される。＊1 協力研究員，＊2 ジュニア・リサーチ・アソシエイト，＊3研修生，＊4 基礎科学特別研究員 The transcriptional control is a key step for development, stress response, and various diseases of human being. Recent progress in the study of the mechanism of cellular proliferation has shown that signals for proliferation or differentiation are transferred into nuclei through receptors and other mediators. However, the mechanism of signal transduction remains elusive. Especially, it is unknown how transcription is regulated via change of nuclear architecture and chromatin structure. Through the use of molecular biology and biochemistry techniques and, in some cases, employing whole animal systems, we are investigating the mechanism of transcriptional control. 1. Nuclear oncogene products and supressor oncogene product as a transcriptinal regulator SUMOs are proteins that are posttranslationally conjugated to diverse proteins. c-Myb regulates proliferation and differentiation of hematopoietic cells. PIASy is the only known SUMO E3 ligase for c-Myb. We demonstrated that TRAF7 binds to c-Myb and stimulates its sumoylation. TRAF7 bound to the DNA-binding domain of c-Myb via its WD40 repeats, and also stimulated the sumoylation of c-Myb at Lys-523 and Lys-499, which are the same sites as those used for PIASy-induced sumoylation. TRAF7 inhibited trans-activation induced by wild-type c-Myb, but not by the sumoylation site mutant of c-Myb. Endogenous TRAF7 localized to both the cytoplasm and nucleus of M1 cells. Consistent with this, significant amounts of sumoylated c-Myb were found in the cytoplasm of M1 cells, whereas nonsumoylated c-Myb was found predominantly in the nucleus. Overexpressed TRAF7 was localized in the cytoplasm of CV-1 cells, and sequestered c-Myb and SUMO1 in the cytosol, whereas PIASy was localized in the nucleus. Thus, TRAF7 negatively regulates c-Myb activity by sequestering c-Myb to the cytosol via sumoylation. 2. Induction of gene expression by extracellular stimuli Adipocyte differentiation is an important component of obesity, but how hormonal cues mediate adipocyte differentiation remains elusive. BMP stimulates in vitro adipocyte differentiation, but the role of BMP in adipogenesis in vivo is unknown. Drosophila Schnurri (Shn) is required for the signaling of Decapentaplegic, a Drosophila BMP homolog, via interaction with the Mad/Medea transcription factors. Vertebrates have three Shn orthologs, Shn-1, -2, and -3. We demonstrated that Shn-2 KO mice have reduced white adipose tissue and that Shn-2 KO mouse embryonic fibroblasts cannot efficiently differentiate into adipocytes in vitro. Shn-2 enters the nucleus upon BMP-2 stimulation and, in cooperation with Smad1/4 and C/EBPα, induces the expression of PPARγ2, a key transcription factor for adipocyte differentiation. Shn-2 directly interacts with both Smad1/4 and C/EBPα on the PPARγ2 promoter. These results indicate that Shn-2-mediated BMP signaling has a critical role in adipogenesis. 3. Genetic analysis of transcriptional regulators by using Drosophila ATF-2 is a member of the ATF/CREB family of transcription factors, and its trans-activating capacity is enhanced by stress-activated protein kinases such as JNK and p38. However, little is known about the in vivo roles played by ATF-2. We identified the Drosophila homologue of ATF-2 (dATF-2) consisting of 381 amino acids. In response to UV irradiation and osmotic stress, Drosophila p38 (dp38), but not JNK, phosphorylates dATF-2 and enhances dATF-2-dependent transcription. Consistent with this, injection of dATF-2 double-stranded RNA into embryos did not induce the dorsal closure defects that are commonly observed in the Drosophila JNK mutant. Furthermore, expression of the dominant-negative dp38 enhanced the aberrant wing phenotype caused by expression of a dominant-negative dATF-2. Similar genetic interactions between dATF-2 and the dMEKK1-dp38 signaling pathway also were observed in the osmotic stress-induced lethality of embryos. Loss of dATF-2 in Drosophila S2 cells by using dsRNA abrogated the induction of 40% of the osmotic stress-induced genes, including multiple immune response-related genes. This indicates that dATF-2 is a major transcriptional factor in stress-induced transcription. Thus, dATF-2 is critical for the p38-mediated stress response. Staff Head Dr. Shunsuke ISHII Members Dr. Toshio MAEKAWA Dr. Teruaki NOMURA Dr. Tsuyoshi TAKAGI Dr. Toshie SHINAGAWA Dr. Chie KANEI-ISHII＊1 Dr. Wanzhu JIN＊1 Dr. Tomoko NAGAO＊1 Dr. Hideyuki SHIMIZU＊1 Dr. Takefumi ISHIDAO＊1 Dr. Seungjoon KIM＊1 Dr. Shin-nosuke KANESASHI＊1 Dr. Nobukazu SHIMADA＊2 Dr. Ki-hyeon SEONG＊2 __________________________________________________ ＊1 Contract Researcher ＊2 Special Postdoctoral Researcher Trainees Mr. Yutaka MORITA (Grad. Sch. Compr. Hum. Sci., Univ. Tsukuba) Ms. Toshihiro KURAHASHI (Grad. Sch. Compr. Hum. Sci., Univ. Tsukuba) Ms. CHIEKO MAKINO (Grad. Sch. Compr. Hum. Sci., Univ. Tsukuba) Ms. Tomoo OKAMURA (Grad. Sch. Compr. Hum. Sci., Univ. Tsukuba) Mr. Tomohiro YAMAUCHI (Grad. Sch. Compr. Hum. Sci., Univ. Tsukuba) Mr. Noriyuki HIROSE (Grad. Sch. Compr. Hum. Sci., Univ. Tsukuba) Ms. Takanori TABATA (Grad. Sch. Compr. Hum. Sci., Univ. Tsukuba) ✂✁☎✄✝✆✟✞✡✠☞☛✍✌✡✎☞✏✡✑✓✒✟✔ ✕ ✖ ✗ ✘ ✙✛✚✢✜✤✣✦✥★✧✪✩✬✫✭✥✯✮✱✰✳✲ ✴ ✵ ✕✷✶ ✸✺✹✼✻✼✽✓✾❀✿ ❁❃❂✟❄❆❅✼❇✼❈✼❉❋❊✼●✟❍❆✽✟✾❏■ ❑▼▲❖◆✛❘◗❚❙❱❯❏❲✭❳❨❲❖❩❭❬❫❪✪❴❵❪❭❛✪❙❝❜❞❙❫❬❡❲❖❩❢❳❞❙❢◆❣❙❢❴❵❤✬▲❥✐❚❙❱❯✡❲❖❩✪❬❦❙❢❴❵❧❝♠❭❙✭❜♥❙❫♦✛❲❖❩ ♣q❜♥❙❢◆❡✬◗❚❙sr❫❲❖❩✬t✍❙✉✐❚❙✉◗❚❙❢▲✈❬❡❲❥❩①✇✳❙❢②③▲❥♠✪③④❚❤✬▲⑤❯✡❲❖❩✬✇✝❙❢❛❢❙❢♠✪▲✈✇❱❲❖❩❘♣⑥❴⑦❤✬▲❖▲ ⑧ ❲❥❩⑨❙❢②③⑩✂❶❦❙❢❛❢❙❸❷❹❙❢◆❣❙✷✇❱❲❥❺✍❻❽❼❾❧❝♠✪③❿❖❙✉✐⑦▲❖❪✪②✓❪❢➀➁✇➂❤✬❧❝❿❖➃✱❧➄◗❡✐❽❷➅➃①❧✂➆ ④❝❧❝❿❥❿➇⑩❘▲➉➈✈❧➄◗⑦❧❝②➅✐⑦▲➊❙✉✐❵▲❖❪✪②❃➋➅❷➌◆s❘◗⑦▲❖②✬❧ ⑧ ④✺❤③②❹✬◗❵◗⑦▲➉➍➎➆✉➏✬❩❘➐③❲❘➑✝➒❘➃➇❲➓❯✷❧❸⑩✈❲ ➔③→⑤➣ ❩❘❶❫❪③❲⑨↔❘❩③➃✬➃➇❲③↔✪↕❭➙❸➛❹➜❭➝✪➞✷➟➠➆❢➝❭➝❭➡✪➢❚❲ ❁ ⑧ ❙❢②✬❪❨❳❨❲❖❩③♦❫❛❹▲❖◆❣❙✉◗⑦❆❬❡❲❖❩✈➤❫❛❢❙❢◆❨❘◗❚❙➌✇❱❲❥❩③❶❦❙❢♠❭❙✪❪❣✇❦❲❖❩✱➤❫❛✪❙❭⑩✬❙➌❯✡❲❖❩ ❙❢②③⑩☎♣⑥❴⑦❤✬▲❥▲ ⑧ ❲❖❺➁❻➎➥❦◗⑦❪✪❴❵❪✪➃✬❤③▲❥❿➊❙❫❙❢④➄✐⑦▲❥➦✪❙✉✐⑦▲❖②✬♠❞✐❵◗❚❙❢②③❴❵④➄◗⑦▲❖➃❘✐⑦▲❥❪✪②✛➀★❙❢④➄✐⑦❪❢◗❵➍ ➆♥▲❖❴✤▲❖②❘➦✪❪✪❿❖➦✪❧❸⑩▼▲❖②❨❴❽✐❵◗⑦❧❝❴❵❴✤◗⑦❧❝❴❵➃✱❪✪②✬❴❵❧❞➦➅▲❖❙❱❙❢④➄✐❵▲❖➦✪❙✉✐⑦▲❖❪✪②▼➋➅❷✛➃③↔✪➞❘❩✪➋✬❘✐ ②✬❪❢✐❦④➄➍⑥➐✪③②➧❶❫❬❨➟q➆✪➢q➍➠✐⑦❧➄◗⑦◆➌▲❥②①❙❢❿✤❛➅▲❥②①❙❢❴❵❧❝➏✬❩✳❯❆❪✪❿➠❲✛➨➩▲❖❪✪❿➠❲❨r➩❧❝❿❖❿ ➣❘➫ ❩ ➆❢↕✪↔❢➜✉➛❘➆❢↕❢➜❭➭✂➟q➆❢➝✪➝❭➡✪➢✺❲ ❁ ❑▼❘◗❚❙❢❤①❙❢❴❵❤✬▲⑨✇❦❲❖❩✢❶❫❪✪◆❨✬◗❚❙☎✇❱❲❖❩⑤♣➎❴❵❤✬▲❖▲❞r❫❲❖❩ ⑧ ❤✬▲❖②✬❛✪❙❢▲✳❳❨❲❖❩✳❙❢②③⑩✂♣➎❴❵❤✬▲❖▲ ⑧ ❲❥❺❏❻❽✇♥❤✬❧➌t➯②➅✐❵➍➠❶❱➲➇❑➳❴❵▲❖♠✪②③❙❢❿❖▲❥②③♠➵➃③❙✉✐⑦❤❹❜♥❙❸❷✡▲❥②③❤✬▲❥➋③▲➉✐⑦❴s♦❾➍➎❯✂❷❘➋ ❙❢④➄✐❵▲❖➦➅▲➉✐➎❷✓➋➅❷✟▲❖②✬❤✬▲❖➋✬▲➉✐⑦▲❖②✬♠❏✐⑦❤✬❧➧❙❢❴❵❴❵❪➅④❝▲❖❙✉✐⑦▲❖❪✪②☞❜➁▲➉✐⑦❤❋④❝❪❭❙❢④➄✐⑦▲❥➦✪❙✉✐⑦❪❢◗ r❞➨❞➸➺❙❢②①⑩❆◆➌❧➄✐⑦❤❹❷➅❿➊❙✉✐⑦▲❥②③♠➌❤✬▲❖❴❽✐⑦❪✪②✬❧✛❬❱↔❢➏✬❩✱❯❆❪✪❿➠❲❾➨➩▲❖❪✪❿★❲❾r❞❧❝❿❖❿ ➣❘➫ ❩ ➜❹➙❢➝❭➡❸➛❹➜❹➙➅➻❸↔✂➟q➆❢➝✪➝❭➡✪➢✺❲ ❁ ❯✷❪❢◗⑦▲❥✐⑦❙❏❳❨❲❥❩❫♣⑥❴⑦❤✬▲❥▲▼r❦❲❖❩➁❶❫❪✪◆❨❘◗❚❙✼✇❱❲❖❩❫❙❢②③⑩✂♣⑥❴❵❤✬▲❖▲ ⑧ ❲❖❺➼❻❽✇❞❼❫♦❫➽⑨➙ ❴❵❧❸➾❹✬❧❝❴❽✐⑦❧➄◗⑦❴✂④➄➍⑥❯❆❷➅➋❋✐⑦❪✍✐⑦❤✬❧✡④➄❷➅✐❵❪❭➃✬❿❖❙❢❴⑦◆➚➋➅❷☞❴❽✐⑦▲❖◆❨✬❿➊❙✉✐⑦▲❥②③♠✍▲❥✐❵❴ ❴❵✬◆➌❪✭❷➅❿➊❙✉✐⑦▲❥❪✪②③➏✬❩③❯✷❪✪❿★❲➓➨➩▲❖❪✪❿★❲➩r➩❧❝❿❖❿ ➣❘➫ ❩③➡✉➜❹↔✪↔✭➛❘➡✉➜✪➜✪➜✷➟q➆❢➝✪➝❭➡✪➢✺❲ ❁ ➪ ➶ ✗ ✘ ➹❨➘✉✩①✣❞✙▼➘✉➴➅✲❝➴❘✰✈✫❸✩✬✫❸✥✦✮✱✰✳✲ ➟❽➷✓➬✷➮✼➱❏➢ ✃➧❐❏❒✍❮ ❩✱❰❏Ï❏Ð✡Ñ✓❺➌❻❽♦➓✇❾➽✢➍➎➆✛Ò✟Ó✓Ô✂Õ✍Ö✟×ÙØ✂Ú✟Û✼Ü✍Ý ❍❆Þ ß❏à✼á❋âäã✂å✼æ✼ç✼èêé✱ë ❙✪⑩✬⑩❘➜❹➡✉ì➯íî❯✷❙✪❴❵➃✬▲❖② âïà✼ð✼❈✼ñ ➏✬❩ ò ➆❢➞❡ó➯ô▼õ➧ö✡÷❏øïù❏ú➵➮✡û➧➮✟❩➅ü✟ý✡❩✈➻✭➆❦þÿ➟➠➆✪➝✪➝❭➡✪➢✺❲ ✂✁☎✄ ✝❩ ✆✟✞✂✠✓❩ ☛✡☛☞✍✌☎✎ ✝❩ ✏✟✑✍✒✔✓➧✖❩ ✕✟✗✂✘✟✙✓❩✈❰❏Ï➧Ð✡Ñ✓❺ ❻ ⑧ ④❚❤③②❹✬◗❵◗⑦▲➉➍➎➆❣r❞❪✪②➅✐❵◗⑦❪✪❿❖❴❫➨❾❯✷➸✝➍⑥⑩❘❧❝➃✈❧❝②③⑩❘❧❝②❹✐❱♦❫⑩❘▲❖➃✱❪✪♠✪❧❝②✬❧❝❴❵▲❖❴❦➦➅▲❖❙ ♣⑥②❹✐❵❧➄◗✺❙❢④➄✐❵▲❖❪✪②➵❜❾▲❥✐⑦❤ ⑧ ◆❣❙✪⑩➵➃❘◗⑦❪❢✐⑦❧❝▲❥②✬❴⑦➏✬❩ ò ➆❢➞sóäô❣õ✓ö✓÷☞ø✍ù ú➵➮➧û✡➮✓❩✬ü✓ý➧❩➇➻✭➆❦þ ➟q➆❢➝✪➝❭➡✪➢✺❲ ✚ ✏✟✛✟✜✡÷✓❩✬❰❏ÏïÐ✡Ñ✓❺❡❻ ⑧ ▲❥②⑤➻▼✍Û ✢ ✤❍ ✣✍✥✔✦ ÷ ♦➓✇❾➽✢➍➎➆ ★â ✧✪✩ ❈➧ñ ➏✬❩ ò ➆❢➞❡ó❋ô✛õ➧öï÷✍ø➵ù✡úï➮➧û✡➮✓❩➅ü✓ý✡❩✈➻✭➆❱þ ➟q➆❢➝✪➝❭➡✪➢✺❲ ✫✭✬ ✙✓❩➇❰✍✍Ï ✮✟✯✟✖❩ ✏✪✑✰✒✔✓➧❩⑤❰❏Ï✍Ð✡Ñ✓❺❆❻❽✇❞❼❫♦❫➽⑨➙ ❄ ④➄➍⑥❯❆❷❘➋ ❍ ✷ íï✭ â ✣✰✥☛✧☛✩ ✱✼✻ ❈ ✶ ✱ ✳⑧ ✲ ❯ï✵ ➤ ✴✭✶ ✂ Û ✢✹✸✓④➄➍⑥❯❆❷❘➋ ✺ ❍ ➏✬❩ ò ➆❢➞✛ó➯ô▼õ✡ö➧÷✍ø➵ù❏úï➮➧û✡➮✓❩✬ü✓ý➧❩➇➻✭➆❦þ ➟q➆❢➝✪➝❭➡✪➢✺❲ ✽ý ✑✂✾✟✿✓✖❩ ❀✟❁✂✾➧÷✓✖❩ ❂ ✬☎❃ ❩✱❰❏Ï❏Ð✡Ñ✓❺☎❅❻ ❄✍❆✔❇✂❈✰❉✭❊ â ø ❋➧❈❏ñ Û❏Ü✡Ý ✍❍ ●■❍ ✺Ø ❏ ❍ ▲Ø ❑✔▼ ⑩③♦✝✇❾➽✢➍➎➆ ★â ◆✪❖ ➏✬❩ ò ➆❢➞ ó❋ô▼õ✡ö➧÷✍ø➵ù❏úï➮ïû➧➮✟❩❘ü✓ý✡❩⑤➻✭➆❦þ ➟q➆❢➝✪➝❭➡✪➢✺❲