6-hydroxydopamineにより誘導される細胞死シグナル - 北海道大学

6-hydroxydopamineにより誘導される
細胞死シグナルにおけるp66shcの関与
○山盛徹1、溝端彩乃2、斎藤芳郎2、浦野泰臣2、野口範子2
1北海道大学大学院獣医学研究科放射線学教室
2同志社大学生命医科学部医生命システム学科
6-hydroxydopamine (6-OHDA)
内在性のカテコールアミン作動性神経毒
パーキンソン病の動物モデル作成に広く利用される
6-OHDA
p-quinone
6-OHDAにより惹起される細胞内シグナルに
ついては不明な点が多い
p66shc : mediator of oxidative stress
• shc : src homology 2 domain containing
⇒ 増殖因子シグナルに関わる
アダプタータンパク質
＜shcA各アイソフォームのドメイン構造＞
 p66shcは酸化ストレス感受性に関与する
p66shcを欠損したマウスにおいて、約
30％の寿命延長が観察された。
糖尿病や動脈硬化の動物モデルにおいて、
p66shc欠損により酸化ストレスレベル
が減弱した。
紫外線や過酸化水素などの酸化ストレス
によりp66shcのSer36がリン酸化さ
れた。
p66shc Ser36のリン酸化は、酸化ス
トレス誘発細胞死に重要である。
CH2 : collagen homology 2
PTB : phosphotyrosine binding
CH1 : collagen homology 1
SH2 : src homology 2
Migliaccio E, et al. Nature (1999),
Francia P, et al. Circulation (2004),
Nemoto S, et al. Science (2003),
Menini S, et al. Diabetes (2006)
Objective
6-OHDAにより誘導される細胞死にp66shcおよび
そのリン酸化が関与しているかどうかを明らかにする。
① 6-OHDAによりp66shc Ser36リン酸化が引き起こされるか？
② 6-OHDA誘導細胞死に対して、p66shc遺伝子導入がどのように
影響するか？
Materials & Methods
 細胞：ヒト神経芽細胞腫由来SH-SY5Y細胞
野生型マウス胚線維芽細胞 (WT MEF)
p66shc ノックアウトマウス胚線維芽細胞 (p66-/- MEF)
 阻害剤： SP600125（JNK阻害剤）、PD98059（MEK阻害剤）、
SB203580（p38 MAPK阻害剤）、Hispidin（PKCβ阻害剤）
 細胞毒性： MTT assayまたはtrypan blue色素排除能試験
 p66shcリン酸化：抗リン酸化p66shc (Ser36)抗体およびshc抗体を用いた
イムノブロット
 遺伝子導入： p66shc（正常型／S36A変異体）をレトロウイルスベクターにて
p66-/- MEFに導入後、puromycinにより安定発現細胞を薬剤選択
6-OHDAはSH-SY5Y細胞において細胞毒性を示す
MTT assay in SH-SY5Y cells
** : p < 0.01
6-OHDAはp66shc Ser36のリン酸化を引き起こす
Immunoblot in SH-SY5Y cells
• Dose response
Time : 15 min
• Time course
Dose : 100 µM
6-OHDA誘導p66shcリン酸化は
PKCβにより調節される
Immunoblot in SH-SY5Y cells
• 6-OHDA : 100 µM, 15 min
SP: 5 µM SP600125 (JNK inhibitor)
PD: 50 µM PD98059 (MEK inhibitor)
SB: 20 µM SB203580 (p38MAPK inhibitor)
Hispidin (20 µM; PKCβ inhibitor)
6-OHDAの細胞毒性は過酸化水素に依存する
6-OHDA
p-quinone
MTT assay in SH-SY5Y cells
catalase : 50 U/ml
** : p < 0.01
6-OHDA誘導p66shcリン酸化は
過酸化水素により引き起こされる
Immunoblot in SH-SY5Y cells
• 6-OHDA : 100 µM, 15 min / H2O2 : 50 µM, 15 min
catalase : 50 U/ml
p66shcは6-OHDAの細胞毒性発現に重要である
Immunoblot in MEFs
Trypan blue dye exclusion test in MEFs
• 6-OHDA : 100 µM
** : p < 0.01
* : p < 0.05
p66shc Ser36リン酸化は
6-OHDA細胞毒性発現に必須である
Immunoblot in p66-/- MEFs
Trypan blue dye exclusion test in p66-/- MEFs
• 6-OHDA : 100 µM
** : p < 0.01
Conclusion
 SH-SY5Y細胞において、6-OHDAは細胞死とPKCβ依存性の
p66shc Ser36リン酸化を引き起こした。
 6-OHDAに由来する過酸化水素が細胞死とp66shcリン酸化を
引き起こした。
 p66shc-/- MEFは6-OHDAによる細胞死に対して抵抗性を示
した。
 p66shc-/- MEFに正常型またはS36A変異型p66Shcを導入
すると、正常型p66shcを発現した細胞のみが6-OHDAに対す
る感受性を獲得した。
6-OHDAにより誘導される細胞死のシグナル伝達に、
p66shc Ser36のリン酸化が重要な役割を担うことが
示唆された。

Download Report