Leuko64 - Trillium Diagnostics

Leuko64™
Test per il Rilevamento di Risposte Infiammatorie Sistemiche Acute
TRILLIUM DIAGNOSTICS
i Informazioni sul Prodotto
h LK-064-75 (75 test) ; LK-064-250 (250 test)
V Per Uso Diagnostico in Vitro
SOMMARIO E PRINCIPIO D'IMPIEGO
L'espressione del CD64 sui neutrofili aumenta rapidamente nelle applicazioni sia
in vitro, sia in vivo in poche ore, a opera di mediatori di infiammazione come
l'interferone gamma e il G-CSF (1-3). Lo stesso cambiamento si osserva in
risposta a infezione o lesione di tessuto documentata, indicando la relazione tra la
misurazione dell'espressione del CD64 sui neutrofili e la presenza di tali
condizioni negli esseri umani (4-14). Il kit di analisi Leuko64TM utilizza una miscela
di tre anticorpi monoclonali con specificità su CD64 (cloni 22 e 32.2) e CD163
(clone Mac2-158). L'uso di due anticorpi per differenti epitopi del CD64 potenzia il
rapporto segnale/rumore del test e fornisce un meccanismo per ridurre al minimo
la variazione da lotto a lotto nel segnale di fluorescenza del reagente. L'aggiunta
dell'anticorpo monoclonale al CD163, un antigene specifico del monocita,
aumenta la specificità di identificazione della sottopopolazione di leucociti,
semplificando così l'algoritmo di ricerca dei cluster del software Leuko64
QuantiCALC™ e consentendo l'identificazione delle popolazioni interne “di
controllo positivo e negativo”. L'uso del software automatizzato elimina la
variazione inerente all'analisi standard soggettiva in list-mode del flusso
citometrico. Per la standardizzazione della quantificazione del CD64 cellulare
viene utilizzata una sospensione di sfere fluorescenti, che permette la tracciabilità
in conformità al materiale di riferimento standard NIST SRM 1932 (RM 8640) e
consente di ridurre al minimo le differenze tra lotto e lotto nei kit di analisi
Leuko64. I risultati del Test Leuko64 sono riportati come Indice PMN CD64
(parametro diagnostico) e come indici di CD64 e CD163 dei monociti.
APPLICAZIONE
Le versioni LK-064-75 e LK-064-250 del kit di Test Leuko64 TM sono state
progettate specificamente per l'uso con i seguenti citometri di flusso: Beckman
Coulter XL, Beckman Coulter FC-500, Beckman Coulter Navios, BD Biosciences
FACScan, BD Biosciences FACSCalibur e BD Biosciences Cantos.
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Test per il Rilevamento di Infiammazioni e Lesioni Tissutali
DESTINAZIONE D'USO
Il kit di analisi Trillium Diagnostics Leuko64TM deve essere utilizzato per la misurazione dei
livelli di espressione del CD64 sui leucociti neutrofili insieme ad altre analisi di laboratorio e
valutazioni cliniche come ausilio per la diagnosi in vitro di infiammazioni sistemiche acute e
lesioni tissutali, ad esempio causate da danni tissutali, infezioni o sepsi. Trillium Leuko64TM
è destinato ad uso diagnostico in vitro solo da parte di personale qualificato.
COMPONENTI DEL KIT
TRILLIUM
DIAGNOSTICS
Reagente A
Reagente B
Reagente C
Leuko64TM
Software
Miscela di anticorpi monoclonali murini (contiene soluzione salina
tamponata con 0,5% albumina sierica bovina purificata (BSA) e 0,01%
di azoturo di sodio).
Soluzione Lisante Trillium con concentrazione 10X (contiene cloruro di
ammonio)
Sospensione di sfere in polistirene da 5-6 µm marcate con rosso
StarFire TM e isotiocianato di fluoresceina (FITC), (contiene <0,1% di
azoturo di sodio e 0,01% di Tween 20).
Utilizzato per analizzare i file list-mode della citometria a flusso e
calcolare gli Indici di CD64 sui leucociti. Il CD allegato contiene anche
tutorial per la formazione degli utenti e l'uso ottimale del kit di analisi
Leuko64TM.
REAGENTI E MATERIALI NECESSARI MA NON INCLUSI
Acqua Distillata
Citometro di Flusso
Agitatore Vortex
Provette in polistirene monouso 12x75
Micropipette per dosare 5uL, 50uL e 1mL
Computer per analisi dei file list-mode
CAMPIONI
Il Test Leuko64TM richiede solo 50µL di sangue intero anticoagulato; EDTA, eparina, citrato
di sodio, o ACD sono anticoagulanti compatibili con questo sistema di test. I campioni di
sangue rimangono accettabili per un massimo di 8 ore se conservati a temperatura
ambiente (18-22C) o per 48 ore se refrigerati (2-8C).
PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
1. Diluire la soluzione lisante Trillium con concentrazione 10X (Reagente B) in proporzione
1:10, miscelando 1 parte di Reagente B concentrato con 9 parti di acqua distillata filtrata.
Il pH finale della soluzione ottenuta deve essere pari a 7,40 + 0,05. Miscelare un volume
sufficiente per il numero previsto di prove (ogni campione richiede 1,0 mL). La soluzione
lisante Trillium 1X o diluita è stabile per una settimana a temperatura ambiente (20-26
°C) o 30 giorni in frigorifero (2-8 °C).
2. La soluzione lisante Trillium diluita deve essere usata ad una temperatura compresa tra
20 °C e 37 °C. Una soluzione fredda può causare una riduzione della lisi e condizioni di
test non ottimali.
3. Etichettare una provetta di polistirene da 12 x 75 mm per ogni campione da analizzare.
4. Dispensare 50µLdi Reagente A Leuko64TM in ogni provetta.
5. Pipettare 50µL di campione di sangue anticoagulato ben miscelato con conta dei leucociti
<25 x 10 9 cellule/L (diluire se necessario) alla provetta corrispondente contenente il
Reagente A; miscelare o vortexare delicatamente; poi incubare per 10 minuti al buio a
temperatura ambiente (18-22  C).
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6. Aggiungere 1 ml di soluzione lisante Trillium 1X (Reagente B diluito) in ogni provetta e
vortexare abbondantemente. Incubare per 15 minuti al buio a temperatura ambiente.
Eseguire il vortex in modo intermittente facilita il processo di lisi.
7. Aggiungere 5 ml di sfere Leuko64 TM (Reagente C) in ogni provetta, vortexare ed
analizzare con il citometro di flusso seguendo il protocollo di preparazione dello
strumento e di analisi descritto di seguito. I campioni preparati e non analizzati
immediatamente devono essere tenuti a 2-8 °C e al riparo dalla luce fino al momento
dell'analisi. L'analisi mediante citometria di flusso deve essere eseguita entro 4 ore dalla
marcatura.
TRILLIUM
DIAGNOSTICS
PREPARAZIONE DEL CITOMETRO DI FLUSSO
Prima di analizzare il primo campione, un protocollo di acquisizione dovrà essere
impostato sul citometro di flusso. Le sfere Leuko64 TM (Reagente C) saranno utilizzate per
la calibrazione dei guadagni dello strumento e per impostare le tensioni di esercizio.
Affinché il software automatizzato possa funzionare correttamente, è imperativo seguire i
passaggi elencati di seguito nell'ordine specificato. Per ulteriori informazioni,
consultare le esercitazioni sul CD del software Leuko64 QuantiCALC.
1. Preparare una provetta in polistirene da 12 x 75 mm contenente 5 µL di sfere Leuko64
TM
(Reagente C) in 0,5 ml di soluzione lisante Trillium 1X (Reagente B diluito in rapporto
1:10 con acqua distillata filtrata, pH 7,40 + 0,05). Questa sospensione di sfere sarà
utilizzata per impostare la dispersione della luce e la tensione di fotomoltiplicazione
ottimale del citometro di flusso.
2. Nella modalità di acquisizione del citometro di flusso (Utenti Beckman Coulter XL,
FC500 o Navios - cfr. di seguito), impostare 5 istogrammi a due parametri:
 FS (lin) vs SS (log)
 FL3 (beads) vs SS (log)
 CD64 FITC vs SS (log)
 CD163 PE vs CD64 FITC
 CD163 PE vs SS (log)
E 3 istogrammi a un parametro:
 FL1 - CD64 FITC
 FL2 - CD163 PE
 FL3 (o PMT con filtri configurati per rilevare la luce a 685 nm)
Gli strumenti Beckman Coulter XL, FC500 e Navios devonoavere i parametri di
acquisizione selezionati nel seguente ordine:

P1 = FALS
 P4=log PE

P2 = log side scatter
 P5=log PMT per segnale 685
nM (di norma FL4)

P3 = log FITC
NOTA:
3. Disattivare tutte le impostazioni di compensazione e di soglia.
4. Impostazioni di Tensione per Tutti gli Strumenti, tranne BDB FACSCanto II.
(Utenti FACSCanto II: consultare le istruzioni riportate di seguito)

Nota: Impostare tutti i parametri logaritmici per la visualizzazione a 4 decadi
nel software di raccolta dati del citometro di flusso prima dell'acquisizione

Eseguire la sospensione delle sfere e apportare le seguenti correzioni sugli
istogrammi a un parametro (vedi schema)

Il centro del picco sull'asse FL1 (FITC) deve essere centrato sul canale 100
(all'inizio della terza decade dell'intensità di fluorescenza).
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Il centro del picco sull'asse FL2 (PE) deve essere centrato a ~ 20 (la prima
tacca nella seconda decade dell'intensità di fluorescenza).
Il centro del picco sull'asse FL3 deve essere centrato sul canale 100, o all'inizio
della terza decade dell'intensità di fluorescenza.
Sull'istogramma FS vs log SS, la popolazione delle sfere deve essere
posizionata alla fine della terza decade del segnale log side scatter e vicino al
canale 200 per il segnale forward o low-angle scatter (su scala 256, usare i
canali da 25 a 50).



DIAGNOSTICS
Per gli Utenti di Tutti i Modelli Beckman Coulter, FACSCalibur e FACScan™:
CD64‐FITC
CD163‐PE
StarfireRed
SSCLog
**Impostazione della Tensione Per i Soli Utenti di BDB FACSCanto II™: I citometri di
flusso BD FACSCanto II richiedono istruzioni di installazione alternative a causa delle
differenze nella visualizzazione della scala logaritmica di fluorescenza, una caratteristica
unica del software di raccolta dati FACSDiva utilizzato sul Canto II.
Nota: Impostare tutti i parametri logaritmici per la visualizzazione a 4 decadi
nel software di raccolta dati del citometro di flusso prima dell'acquisizione.
Eseguire la sospensione delle sfere e apportare le seguenti correzioni sugli
istogrammi a un parametro (vedi schema):

Il centro del picco sull'asse FL1 (FITC) deve essere centrato sul canale
3000 (la seconda tacca della terza decade dell'intensità di fluorescenza).

Il centro del picco sull'asse FL2 (PE) deve essere centrato in prossimità
della fine della seconda decade dell'intensità di fluorescenza.

Il centro del picco sull'asse FL3 deve essere centrato sul canale 3000 (la
seconda tacca della terza decade dell'intensità di fluorescenza).

Sull'istogramma FS vs log SS, la popolazione delle sfere deve essere
posizionata alla fine della terza decade del segnale log side scatter e sul
canale 25-50 per il segnale forward o low-angle scatter.

TRILLIUM

Solo per gli Utenti BD FACSCanto II:
CD64‐FITC
CD163‐PE
StarfireRed
SSCLog
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5. La soglia per escludere piastrine e detriti di globuli rossi sarà impostata sul log SS
utilizzando i linfociti. Il discriminatore sul log SS dovrebbe essere impostato all'immediata
sinistra della popolazione linfocitaria. Non utilizzare un set discriminatorio con il forward
scatter, poiché le sfere vengono escluse dall'acquisizione.
6. Le impostazioni di acquisizione e di immagazzinamento devono essere regolate per
consentire la raccolta di 50.000 eventi ungated. Impostare la risoluzione a 1024 è
generalmente consigliato, ma è obbligatorio quando si utilizzano i citometri Beckman
Coulter Cytomics™ FC500 o BD Biosciences FACSCanto™.
7. Salvare le impostazioni e il modello di acquisizione. Ripetere i passaggi 4-7 con qualsiasi
nuovo lotto di Leuko64TM o dopo la manutenzione dello strumento.
TRILLIUM
DIAGNOSTICS
ANALISI FILE IN MODALITÀ DI ELENCAZIONE (LIST-MODE)
Installare il software in dotazione Leuko64™ QuantiCALC sul Macintosh o PC che sarà
utilizzato per l'analisi dei dati. Seguire le istruzioni per l'analisi dei dati in modalità
elencazione contenuti nella Guida del software. NOTA: Il software è specifico per ogni
lotto e i protocolli in uso variano in base al modello. Sarà richiesto di effettuare la
selezione appropriata.
STRATEGIA DI CONTROLLO QUALITÀ PER IL TEST LEUKO64 TM
L'analisi utilizza popolazioni di cellule autologhe nel campione del paziente per i controlli
positivi e negativi, ottimizzando la valutazione delle variabili pre-analitiche. La popolazione
linfocitaria, che non presenta l'espressione del CD64 e del CD163, serve come una
popolazione di controllo negativo e assicura l'aggiunta dei reagenti appropriati, rilevando
inoltre l'eventuale presenza di sostanze fluorescenti all'interno del campione diagnostico.
La popolazione monocitaria, che presenta l'espressione costitutiva di CD64 e CD163,
serve come controllo positivo per la marcatura adeguata dei campioni con il Reagente A.
Consultare le brevi istruzioni per l'analisi dei dati in modalità list-mode nel file della Guida
del software Leuko64TM per ulteriori dettagli riguardanti i controlli negativi e positivi del
test. NOTA: Il software è dotato di flag e direttive di regolazione
tl H Y C
MANIPOLAZIONE E CONSERVAZIONE
Conservare le fiale in posizione verticale, ben chiuse e a una temperatura compresa tra 2 e
8C quando non utilizzate. Le fiale non aperte sono stabili fino alla data di scadenza
indicata su ciascuna di esse e nel foglio illustrativo. Evitare cicli di riscaldamento e
raffreddamento non necessari, dato che il test resta valido per un numero di cicli termici
pari o inferiore a trenta (30). Proteggere il prodotto dal congelamento, da temperature
superiori ai 30C e da periodi prolungati di esposizione a temperatura ambiente (18-26C)
o alla luce.
AVVERTENZA
Tutti i componenti del presente kit contengono azoturo di sodio (<0,1% p/V). L'azoturo di
sodio forma dei composti pericolosi e tossici se combinato con acidi o metalli. Manipolare
con cautela. Smaltire le soluzioni contenenti azoturo di sodio in conformità alle norme in
materia.
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CONTROLLO DELLA QUALITÀ DEL PRODOTTO
Le prestazioni e la specificità dei reagenti contenuti in questo kit sono valutate mediante i
metodi di controllo qualità interni di Trillium. Il processo di produzione adotta sistemi di
qualità e direttive di produzione conformi alle norme FDA QSR e ISO 13485:2003.
LIMITAZIONI
TRILLIUM
DIAGNOSTICS


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


L'uso terapeutico di interferone gamma, G-CSF o agenti che modulano la risposta
immunitaria innata, influisce sull'aumento dell'espressione dei CD64 sui leucociti e, di
conseguenza, sull'interpretazione dell'analisi. I risultati del test Leuko64TM non devono
essere utilizzati come unica misura per la valutazione delle infiammazioni nei pazienti,
ma possono essere utilizzati per monitorare l'effetto dei trattamenti.
Per ottenere prestazioni ottimali ed evitare risultati imprecisi o inattendibili, è necessario
conservare e utilizzare il prodotto e i campioni da testare in modo appropriato.
La miscelazione incompleta della fiala con il reagente C prima dell'uso compromette sia
la quantità prelevata, sia il materiale restante contenuto nella fiala.
La scelta del protocollo dello strumento o del numero di lotto del kit errato al momento
dell'avvio del software può compromettere la precisione dell'analisi dei dati in modalità di
elencazione. Il software è specifico per ogni lotto e i protocolli in uso variano in base al
modello. Accertarsi di selezionare gli elementi appropriati, quando richiesto.
Un file di un campione ematico di un paziente affetto da leucopenia o neutropenia grave
con meno di 200 eventi WBC rilevati dal software Leuko64TM in una delle 3 categorie
(PMN, Linfocita o Monocita) non può essere analizzato con il kit Leuko64TM senza una
notevole riduzione di precisione e accuratezza dell'indice PMN CD64.
Un file con un conteggio sfere inferiore a 1000 deve essere analizzato per determinare
la causa di tale valore, che potrebbe derivare da impostazioni errate dello strumento o
da un campione di sangue non diluito con WBC >25 x 109 cellule/L.
Alcuni strumenti per la citometria di flusso sono dotati di filtri che presentano una
configurazione atipica, in cui FL1 non è riferito al segnale CD64 FITC e FL2 non è riferito
al segnale CD163 PE; ciò può compromettere le prestazioni del software Leuko64TM.
Per informazioni sulla risoluzione di questo problema o di qualsiasi problema relativo al
software, contattare il rivenditore dello strumento e l'assistenza tecnica Trillium
Diagnostics.
CARATTERISTICHE DELLE PRESTAZIONI
Ogni laboratorio dovrebbe stabilire un range di riferimento accettabile per ogni lotto di
Leuko64TM. Si prevede che l'intervallo di riferimento del laboratorio per l'Indice PMN CD64
relativo a campioni di sangue sano sia ≤1,00. Generalmente, più acuta è la risposta
infiammatoria sistemica, più alto risulta il valore dell'indice PMN (e Monocita) CD64. Gli
intervalli di riferimento anticipati per gli indici CD163 e CD64 Monocita non sono stati
stabiliti.
RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI
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MARCHI
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
Il software Leuko64™ QuantiCALC è protetto da diritti d'autore ed è stato sviluppato
in collaborazione tra VERITY SOFTWARE HOUSE • Topsham, Maine, USA •
www.vsh.com e TRILLIUM DIAGNOSTICS, LLC • Brewer, Maine, USA •
www.trilliumdx.com
FACSCanto™ e FACScan™ sono marchi registrati di BD Biosciences • San Jose,
CA, USA • www.bdbiosciences.com
Navios™, Gallios™Cytomics FC500™ e XL™ sono marchi registrati di Beckman
Coulter, Inc • Brea, CA, USA • www.beckman.com
Leuko64 ™ è un test brevettato, coperto da brevetto USA N. 8.116.984, brevetto
giapponese N. 5.047.803 e richiesta di brevetto EPO N. 05.851.842.4.
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