Corso di Laurea in Farmacia Insegnamento di BIOCHIMICA Angela Chambery Schema generale del metabolismo ossidativo dei carburanti metabolici Gli elettroni sono incanalati verso accettori universali di elettroni. Schema generale del metabolismo ossidativo dei carburanti metabolici La maggior parte di questi elettroni è il frutto dell’azione di deidrogenasi che li raccolgono dai processi catabolici per poi incanalarli verso accettori universali di elettoni: i nucleotidi piridinici (NAD+ o NADP+) o flavinici (FMN o FAD). La fosforilazione ossidativa dipende dal trasferimento degli elettroni Nella fosforilazione ossidativa il potenziale di trasferimento degli elettroni del NADH e del FADH2 viene convertito nel potenziale di trasferimento del gruppo fosforico dell’ATP. In tale processo, gli elettroni sono utilizzati per ridurre l’ossigeno molecolare ad acqua in un processo a più tappe fortemente esoergonico. La fosforilazione ossidativa dipende dal trasferimento degli elettroni Come avviene il trasferimento di elettroni da un componente all’altro nella catena di trasporto degli elettroni? • Per determinare la forza motrice di tali processi occorre prendere in considerazione i potenziali di ossido‐ riduzione per ognuno dei trasportatori. • Una molecola con un potenziale di ossido‐riduzione elevato tenderà ad essere ridotta (acquista elettroni) se accoppiata con una molecola con potenziale di ossido‐riduzione più basso (perde elettroni). La componente che acquista elettroni si riduce. La componente che perde elettroni si ossida. I potenziali di ossidoriduzione nella catena di trasporto degli elettroni Quando due coppie redox coniugate sono presenti nella stessa soluzione, il trasferimento di elettroni dal donatore di elettroni di una coppia all’accettore di elettroni dell’altra coppia dipende dalle affinità relative dell’accettore di elettroni di ciascuna coppia. Il potenziale di riduzione standard (E0) è una misura (in volt) di questa affinità. La fosforilazione ossidativa dipende dal trasferimento degli elettroni Gli elettrochimici hanno scelto come standard di riferimento la reazione: H+ + e‐→1/2 H2 L’elettrodo su cui ha luogo questa semireazione (detto semicella) viene arbitrariamente considerato con un potenziale di riduzione pari a 0,00 V. Quando l’elettrodo ad idrogeno viene collegato a un’altra semicella in cui le specie ossidata e ridotta sono presenti in condizioni standard (1 M o 1 atm), gli elettroni tenderanno a fluire verso la semicella con il potenziale redox più elevato. Per convenzione la semicella con la tendenza più forte ad acquistare gli elettroni viene indicata con un valore (in volt) di E0 positivo. I potenziali di ossidoriduzione nella catena di trasporto degli elettroni In questo esempio gli elettroni fluiscono dalla cella del campione verso la cella di riferimento. Lo ione H viene ridotto a H2 e l’etanolo viene ossidato ad acetaldeide. La coppia idrogeno/H+ ha un potenziale di ossido‐riduzione più elevato della coppia etanolo/ acetaldeide. I potenziali di ossidoriduzione nella catena di trasporto degli elettroni In questo esempio gli elettroni fluiscono dalla cella di riferimento verso la cella del campione. Il fumarato viene ridotto a succinato (acquista elettroni) e il gas H2 è ossidato ad H+. La fosforilazione ossidativa dipende dal trasferimento degli elettroni Tutte le reazioni sono mostrate come riduzioni. Il valore misurato è il voltaggio biologico standard (Eo’), calcolato ad una concentrazione 1M dei composti nelle celle, a pH 7 ad una T di 25oC. Se le due reazioni sono accoppiate in una reazione redox il NADH cederà i suoi elettroni (si ossida) e l’ossigeno si riduce ad acqua con un voltaggio pari alla somma dei due voltaggi (+0,320+0,816=1,136). I potenziali di ossidoriduzione nella catena di trasporto degli elettroni La variazione di energia libera standard è correlata alla variazione nel potenziale di riduzione dalla relazione: ΔG’0= ‐nFΔE’0 n = numero di elettroni trasferiti; F = Costante di Faraday (variazione di energia libera generata da 1 mole di elettroni e da un cambio di potenziale di 1 volt). Per la reazione di trasferimento di elettroni dal NADH all’ossigeno si ha una variazione di energia libera pari a: ΔG’0= ‐nFΔE’0= ‐52,6 kcal/mole Un ΔE’0 positivo, come un ΔG’0 negativo, identificano una reazione esoergonica in condizioni standard. In realtà il NADH non riduce direttamente l’ossigeno ma passa i suoi elettroni lungo una catena di trasporto che alla fine li porta all’ossigeno. Il mitocondrio Concetti chiave: • Una membrana interna altamente ripiegata e molto ricca in proteine separa la matrice mitocondriale dalla membrana esterna. • Le proteine di trasporto sono necessarie per importare nei mitocondri equivalenti riducenti, ADP e Pi. Il mitocondrio I mitocondri hanno una membrana esterna ed una membrana interna molto estesa e ripiegata a formare invaginazioni dette creste. Lo spazio intermembrana è il compartimento tra membrana esterna e membrana interna. La matrice è delimitata dalla membrana interna. La membrana interna è ricca di proteine Il mitocondrio I mitocondri ossidano i combustibili carboniosi per produrre energia. Questa trasformazione richiede il trasferimento degli elettroni attraverso grandi complessi proteici, alcuni dei quali pompano protoni, generando un gradiente protonico che favorisce la sintesi di ATP. Il trasporto degli elettroni Concetti chiave: • L’energia libera del trasporto degli elettroni dal NADH all’O2 può alimentare la sintesi di circa 2.5 molecole di ATP. • I trasportatori di elettroni sono disposti nella membrana mitocondriale in modo che gli elettroni passino dai complessi I e II, attraverso il coenzima Q, al complesso III e da qui, attraverso il citocromo c, al complesso IV. • Il complesso I a forma di L trasferisce elettroni dal NADH al CoQ attraverso una serie di centri ferro‐zolfo e trasloca quattro protoni nello spazio intermembrana. Il trasporto degli elettroni Concetti chiave: • Il complesso II trasferisce gli elettroni dal succinato al CoQ ma non contribuisce al gradiente protonico transmembrana. • Gli elettroni sono trasferiti dal complesso III al citocromo c e attraverso il ciclo Q vengono traslocati due protoni. • Il complesso IV accetta gli elettroni dal citocromo c riducendo l’O2 a H2O e trasloca due protoni per ogni coppia di elettroni trasferiti. Componenti della catena di trasporto degli elettroni Componenti della catena di trasporto degli elettroni Componenti della catena di trasporto degli elettroni Gruppi prostetici dei componenti della catena di trasporto degli elettroni La flavin mononucleotide (FMN) differisce dal FAD per la mancanza del nucleotide adenilico Gruppi prostetici dei componenti della catena di trasporto degli elettroni I citocromi sono proteine contenenti ferro. Il gruppo prostetico dei citocromi è il gruppo eme. Gruppi prostetici dei componenti della catena di trasporto degli elettroni I citocromi sono proteine con un caratteristico elevato assorbimento della luce nel campo visibile dovuto al gruppo prostetico eme, contenente ferro. Spettri di assorbimento del citocromo c nella forma ossidata (in rosso) e nella forma ridotta (in blu). Gruppi prostetici dei componenti della catena di trasporto degli elettroni Nelle proteine ferro‐zolfo il ferro è associato ad atomi di zolfo inorganico e/o ad atomi di zolfo di residui di cisteina della proteina (centri Fe‐S). Il potenziale di riduzione standard del ferro nei centri Fe‐S dipende dal tipo di centro e dalle specifiche interazioni che ha con la proteina in cui è inserito. In un centro Fe‐S semplice (A) un solo ione Fe è circondato da 4 residui di cisteina. Centro Fe‐S semplice Centro 2Fe‐2S Centro 4Fe‐4S Gruppi prostetici dei componenti della catena di trasporto degli elettroni L’ubichinone, anche detto coenzima Q è un benzochinone con una catena laterale isoprenoidemolto lunga. L’ubichinone è idrofobico e quindi liberamente diffusibile nel doppio strato lipidico della membrana mitocondriale interna. In questo modo può agire da ponte fra trasportatori di elettroni meno mobili nella membrana. Catena di trasporto degli elettroni La fosforilazione ossidativa ha inizio con l’ingresso degli elettroni provenienti dagli accettori universali di elettroni nella catena respiratoria. Metodo per la determinazione della sequenza dei trasportatori di elettroni In presenza di un donatore di elettroni e di O2 è stato valutato l’effetto di inibitori del trasferimento degli elettroni sullo stato di ossidazione di ogni trasportatore. • In blu: composti ridotti • In rosso: composti ossidati Separazione dei componenti funzionali della catena respiratoria I componenti della catena di trasporto degli elettroni possono essere isolati dal mitocondrio in seguito a trattamento con digitonina e rottura osmotica e separati mediante cromatografia a scambio ionico. NADH:ubichinone ossidoreduttasi ‐ Complesso I Il complesso I (anche detto NADH deidrogenasi) trasferisce gli elettroni dal NADH al Coenzima Q (CoQ). E’ parte integrale della membrana mitocondriale interna ed include vari centri Fe‐S e la flavoproteina che ossida in NADH. NADH + Q + 5H+matrice→NAD+ + QH2 + 4H+citosol NADH:ubichinone ossidoreduttasi ‐ Complesso I Il recettore finale degli elettroni del complesso I, il CoQ, è mobile cioè è libero di muoversi nella membrana e di cedere gli elettroni che ha acquistato al Complesso III. Succinato deidrogenasi‐ Complesso II Il complesso II è la succinato deidrogenasi (o succinato‐CoQ osidoreduttasi), il solo enzima del ciclo dell’acido citrico ad essere legato alla membrana mitocondriale interna. Il complesso II contiene due tipi di gruppi prostetici e almeno 4 proteine diverse. Si pensa che gli elettroni passino dal succinato al FAD e poi attraverso i centri Fe‐S all’ubichinone. Citocromo c ossidoreduttasi– Complesso III Il complesso III (o complesso di citocromi bc1), catalizza l’ossidazione del coenzima Q ridotto (CoQH2). Il complesso è un dimero formato da monomeri identici, ciascuno con 11 differenti subunità. Citocromo c ossidoreduttasi– Complesso III Struttura di un monomero Il centro funzionale ha tre subunità: • il citocromo b (fucsia) con due gruppi eme (bH e bL), •la proteina ferro‐zolfo di Rieske (grigio) con un centro ferro‐zolfo; •il citocromo c1 (blu) con un gruppo eme • Il complesso III accoppia il trasferimento degli elettroni dall’ubichinolo (QH2) al citocromo c con il trasporto protonico dalla matrice allo spazio intermembrana. QH2 + 2 Cyt c oss + 2 H+matrice→Q + 2 Cyt c rid + 4H+citosol Citocromo c ossidoreduttasi– Complesso III Il citocromo c1 e la proteina di Rieske sporgono verso la superficie e possono interagire con il citocromo c nello spazio intermembrana. Il complesso ha due distinti siti di legame per l’ubichinone, QN e QP. Citocromo c ossidoreduttasi– Complesso III Il funzionamento del Complesso III permette il passaggio da un trasportatore a due elettroni (l’ubichinone) a trasportatori a un solo elettrone (i citocromi b562, b566, c1 e c) e spiega la stechiometria della reazione con 4 protoni che traslocano per ciascuna coppia di elettroni che viene trasferita al citocromo c. Il risultato netto è l’ubichinolo QH2 viene ossidato a ubichinone Q e 2 molecole di citocromo c vengono ridotte. Il ciclo dell’ubichinone Sul lato esterno della membrana due molecole di QH2 vengono ossidate a Q a livello del sito QP, rilasciando 4 protoni nello spazio intermembrana. Ciascuna molecola di QH2 dona un elettrone (tramite il centro Fe‐S di Rieske) al citocromo c1 e un altro (tramite il citocromo b) lo dona a una molecola di Q a livello del sito QN, riducendo l’ubichinone a QH2 in due tappe successive. Questa riduzione utilizza due protoni prelevati dalla matrice. Citocromo c Il citocromo c è una proteina solubile nello spazio intermembrana. Quando il suo gruppo eme accetta un elettrone dal Complesso III, il citocromo c si sposta verso il Complesso IV per donare l’elettrone a un centro rameico binucleare di questo enzima. Citocromo ossidasi ‐ Complesso IV La parte centrale del Complesso IV possiede tre subunità. La subunità I (fucsia) ha due gruppi eme, a e a3 e uno ione rame, CuB (sfera verde). La subunità II (blu) contiene due ioni rame complessati con i gruppi ‐SH di due residui di Cys in un centro binucleare, CuA, che assomiglia ai centri 2Fe‐2S delle proteine ferro‐ zolfo. Questo centro binucleare e il sito di legame del citocromo c sono collocati in un dominio della subunità II che sporge verso lo spazio intermembrana. Citocromo ossidasi ‐ Complesso IV Attorno agli ioni rame sono compresi : due His, due Cys, un Asp e una Met Citocromo ossidasi ‐ Complesso IV Il Complesso IV trasporta gli elettroni dal citocromo c all’ossigeno molecolare riducendolo ad H2O Il Complesso IV si è evoluto in modo da catalizzare una reazione redox in cui la molecola di O2 viene ridotta contemporaneamente da 4 elettroni, senza la formazione di intermedi ridotti incompleti (es.: anione superossido O2 ‐) altamente reattivi. Le specie reattive dell’ossigeno Respirasoma (Complessi III e IV) La catena di trasporto degli elettroni mitocondriale Flusso degli elettroni e dei protoni attraverso i quattro complessi della catena respiratoria. La fosforilazione ossidativa Concetti chiave: • La teoria chemiosmotica spiega come un gradiente protonico possa collegare il trasporto degli elettroni alla sintesi dell’ATP. • L’ATP sintasi è costituita da un componente F1 che catalizza la sintesi dell’ATP tramite un meccanismo di variazione della propria capacità di legame. • Il componente F0 dell’ATP sintasi contiene un anello c la cui rotazione è alimentata dalla dissipazione del gradiente protonico e, a sua volta, determina i cambiamenti conformazionali nel componente F1. • Per ogni due elettroni che entrano nella catena di trasporto degli elettroni sotto forma di NADH e riducono un atomo di ossigeno, sono prodotte approssimativamente 2.5 molecole di ATP • Gli agenti che dissipano il gradiente protonico sono in grado di disaccoppiare il trasporto degli elettroni dalla sintesi dell’ATP. Teoria chemio‐osmotica (PeterMitchell, 1961) L’energia che deriva dal flusso di elettroni attraverso la catena respiratoria è utilizzata per pompare protoni (H+) dalla matrice mitocondriale verso lo spazio intermembrana. Si genera un gradiente di pH, ovvero la concentrazione di H+ è maggiore nello spazio intermembrana che nella matrice. Teoria chemio‐osmotica (PeterMitchell, 1961) Si genera un gradiente elettrico ‐ la matrice è negativa rispetto allo spazio intermembrana. L’energia potenziale elettrochimica generata è chiamata forza motrice protonica. Teoria chemio‐osmotica (PeterMitchell, 1961) Quando i protoni fluiscono all’indietro attraverso la membrana mitocondriale interna tramite un enzima legato alla membrana (ATP sintasi), l’ADP e il Pi vengono uniti a formare ATP. Circa 3 H+ devono attraversare l’ATP sintasi per ciascuno degli ATP sintetizzati. L’accoppiamento del trasporto degli elettroni alla sintesi dell’ATP Il numero di protoni pompati fuori per coppia di elettroni trasportati è 10 per il NADH e 6 per il succinato. Il numero di protoni richiesti per la sintesi di una molecola di ATP è di 4, di cui uno è utilizzato per trasportare Pi, ATP e ADP attraverso la membrana mitocondriale. Si sintetizzano 2,5 molecole di ATP (10/4) quando il donatore di elettroni è il NADH e 1,5 (6/4) quando il donatore è il succinato (FADH2). Modello chemiosmotico per la sintesi di ATP La forza motrice protonica è una forma di energia suddivisa in due componenti: un gradiente chimico ed un gradiente di carica. Modello chemiosmotico per la sintesi di ATP La sintesi di ATP avviene mediante l’ATP sintasi inizialmente chiamata ATPasi mitocondriale perché capace di catalizzare anche la reazione inversa ovvero l’idrolisi di ATP. Il complesso è anche detto Complesso V. Modello chemiosmotico per la sintesi di ATP L’ATP viene sintetizzato quando le vescicole di membrana ricostituite contenenti batteriorodopsina (una pompa protonica azionata dalla luce che, in questo esperimento, svolge il ruolo della catena di trasporto degli elettroni) e ATP sintasi sono illuminate. Luce ATP sintasi L’ATP sintasi è costituita da una porzione (F0) immersa nella membrana mitocondriale interna ed una porzione (F1) che sporge nella matrice mitocondriale e in cui ha luogo l’attività catalitica della sintasi. ATP sintasi La porzione F1 è formata da cinque tipi di catene polipeptidiche (α3, 3, , , ). Le subunità α e formano un anello esamerico . I siti attivi sono localizzati nelle subunità . Vi è poi uno stelo formato dalle subunità e . ATP sintasi La subunità è costituita da una lunga elica superavvolta che rompe la simmetria dell’esamero α3β3: ciascuna subunità β è distinta in virtù della sua interazione con una differente faccia di . Distinguere le tre subunità β è cruciale per il meccanismo di sintesi dell’ATP. ATP sintasi F0 è un segmento idrofobico che attraversa la membrana mitocondriale interna e contiene il canale protonico del complesso. Tale canale è formato da un anello che comprende 10‐14 subunità c (in blu) immerse nella membrana. Una singola subunità a (in viola) si lega all’esterno dell’anello. Le subunità F0 ed F1 sono collegate sia per mezzo dello stelo centrale sia da una giunzione esterna a colonna formata dalla subunità a, due subunità b e dalla subunità . Meccanismo di sintesi dell’ATP Uno degli atomi di ossigeno dell’ADP attacca l’atomo di fosforo di Pi per formare un intermedio pentacovalente, che a sua volta forma ATP e rilascia una molecola di H2O. Meccanismo di sintesi dell’ATP Nella reazione catalizzata dall’ATP sintasi la maggiore barriera energetica è il rilascio dell’ATP dall’enzima e non la sua formazione. Meccanismo di sintesi dell’ATP I siti di legame per i nucleotidi della ATP sintasi non sono equivalenti. La subunità passa attraverso il centro dell’esamero α3β3 e forma siti di legame per i nucleotidi nelle subunità β distinti l’uno dall’altro. Meccanismo di sintesi dell’ATP In ogni momento una subunità può esistere nella conformazione L (lassa) che lega l’ADP e il Pi, una seconda subunità può esistere nella conformazione T (tesa) che lega l’ATP con grande affinità tanto da convertire l’ADP e il Pi. La terza subunità si trova nella conformazione O (aperta) che può rilasciare i nucleotidi adenilici. Meccanismo di sintesi dell’ATP La rotazione della subunità interconverte le tre subunità . La subunità nella forma tesa converte l’ADP e il Pi in ATP. L’ADP e il Pi si legano alla forma L (1) Quando la subunità ruota in senso antiorario di 120° sfruttando l’energia del flusso di protoni (2), la subunità T si converte nella forma O e l’ATP viene rilasciato (3). In concomitanza, la forma L si converte nella forma T che converte altro ADP e Pi in ATP Meccanismo di sintesi dell’ATP La catalisi rotazionale può essere osservata al microscopio a fluorescenza utilizzando subunità α3 3 dell’ATP sintasi clonate. Le subunità sono ingegnerizzate con code di His‐tag che rendono possibile l’immobilizzazione su una superficie di vetro rivestita da nichel. La subunità è legata ad un filamento di actina marcato con una molecola fluorescente. Meccanismo di sintesi dell’ATP L’aggiunta di ATP fa ruotare il filamento di actina unidirezionalmente in senso antiorario. Meccanismo di sintesi dell’ATP In che modo il flusso dei protoni attraverso F0 favorisce la rotazione della subunità ? La subunità a contiene dei semicanali che permettono ai protoni di penetrare nella membrana senza attraversarla completamente. La subunità c contiene due alpha‐eliche transmembrana, una delle quali contiene un residuo di Asp61 al centro della membrana. Meccanismo di sintesi dell’ATP I protoni entrano nel semicanale sul versante intermembrana legandosi all’Asp61 della subunità c neutralizzandone la carica La subunità c con il protone legato ruota nella membrana fino a che l’acido aspartico non viene a trovarsi in un ambiente povero di protoni del semicanale sul versante della matrice dove il protone viene rilasciato Membrana interna Matrice Spazio intermembrana Trasportatori mitocondriali Sistemi di trasporto presenti nella membrana mitocondriale interna portano ADP e Pi nella matrice e consentono all’ATP appena sintetizzato di uscire nel citosol. Il potenziale di membrana è ridotto dallo scambio ADP/ATP, che risulta nel trasferimento netto di una carica negativa fuori dalla matrice. Lo scambio ADP/ATP ha un costo energetico. Circa un quarto dell’energia ricavata dal trasferimento di elettroni lungo la catena respiratoria è consumata per rigenerare il potenziale di membrana che si perde per il trasferimento dell’ATP nel citosol. Trasportatori mitocondriali Nei mitocondri ci sono anche altri trasportatori (carrier), proteine transmembrana che trasferiscono specifici ioni e metaboliti carichi attraverso la membrana mitocondriale interna. Shuttle del malato‐aspartato Poiché il NADH citosolico non può entrare nei mitocondri (la membrana mitocondriale interna è impermeabile al NADH e al NAD+), per la sua ossidazione nei mitocondri sono necessari sistemi navetta che trasportano gli elettroni del NADH al posto del NADH. Malato DH citosolica Aspartato amminotrasferasi Malato DH mitocondriale Aspartato amminotrasferasi Shuttle del glicerolo 3‐fosfato Questo sistema navetta differisce da quello malato‐aspartato in quanto trasporta equivalenti riducenti dal NADH (via ubichinone) al Complesso III e non al Complesso I. Si formano 1,5 molecole di ATP invece delle 2,5. Resa di ATP dall’ossidazione completa del glucosio Per ogni coppia di elettroni che arrivano all’ossigeno dal NADH sono prodotte 2,5 molecole di ATP. Per ogni coppia di elettroni che arrivano all’ossigeno dal FADH2 sono prodotte 1,5 molecole di ATP. Processo Prodotto Glicolisi 2 NADH (citosolici) 2ATP ATP finale 3 o 5* 2 Conversione del piruvato in acetil CoA (2xglucosio) 2 NADH (mitocondrio) 5 Ciclo dell’acido citrico (2xglucosio) 6 NADH (mitocondrio) 15 2 FADH2 2 GTP o ATP 3 2 Resa netta per ogni molecola di glucosio 30 o 32 La fosforilazione ossidativa può essere disaccoppiata dal trasporto degli elettroni Il DNP, utilizzato come erbicida e fungicida, e altri composti aromatici trasportano i protoni nella membrana mitocondriale interna secondo il loro di concentrazione dei protoni. In presenza di questi disaccoppianti il trasporto degli elettroni procede normalmente ma non si forma ATP in quanto la forza motrice protonica è continuamente dissipata. Generazione di calore mediante disaccoppiamento mitocondriale Alcuni organismi (animali ibernanti e mammiferi adattati al freddo) sono capaci di disaccoppiare la fosforilazione ossidativa dalla sintesi di ATP per generare calore. Il tessuto adiposo bruno, ricco di mitocondri, mediante la proteina disaccoppiante termogenina (UCP‐1), è specializzato in questo processo di termogenesi senza brividi. UCP‐1 genera calore permettendo il flusso di protoni nella matrice dei mitocondri senza sintesi di ATP. Quando la temperatura corporea diminuisce viene innescata una risposta ormonale che libera acidi grassi dai triacilgliceroli che, a loro volta, attivano UCP‐1. Le vie che producono ATP sono regolate in modo coordinato Le concentrazioni di ATP e ADP controllano non solo le velocità di trasferimento degli elettroni e della fosforilazione ossidativa, ma anche quelle del ciclo dell’acido citrico, dell’ossidazione del piruvato e della glicolisi Le vie che producono ATP sono regolate in modo coordinato Le concentrazioni di ATP e ADP controllano non solo le velocità di trasferimento degli elettroni e della fosforilazione ossidativa, ma anche quelle del ciclo dell’acido citrico, dell’ossidazione del piruvato e della glicolisi Le vie che producono ATP sono regolate in modo coordinato Glicolisi Ciclo dell’acido citrico Le vie che producono ATP sono regolate in modo coordinato Fosforilazione ossidativa
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