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ZytoLight SPEC p16/CEN 3/7/17 Quadruple Color Probe
IVD Dispositivo medico-diagnostico in vitro
Produttore: ZytoVision GmbH
Codice:
 Z-2081-200 (0.2ml)
 Z-2081-50 (0.05 ml)
..
Per l’identificazione del gene umano p16 e del DNA α-satellite dei
cromosomi 3, 7 e 17 mediante Ibridazione in Situ In Fluorescenza (FISH)
..
REAGENTE PRONTO ALL’USO
Dispositivo medico-diagnostico in vitro
secondo la direttiva europea 98/79/EC
Revisione 140702 del 02/07/14
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Descrizione del Prodotto
Contenuto:
Sonda ZytoLight SPEC p16/CEN 3/7/17 Quadruple Color (PL40)
in tampone di ibridazione. La sonda contiene polinucleotidi
marcati in giallo (ZyGold: eccitazione a 532nm, emissione
553nm simile alla Rodamina 6G), che identificano il gene p16,
polinucleotidi marcati in rosso (ZyRed: eccitazione a 582nm,
emissione a 599 nm simile a Texas Red), che identificano
sequenze alfa-satellite del centromero del cromosoma 3,
polinucleotidi marcati in verde (ZyGreen: eccitazione a 503 nm,
emissione a 528 nm simile al FITC) che identificano sequenze
alfa-satellite del centromero del cromosoma 7, e polinucleotidi
marcati in blu (ZyBlue: eccitazione a 426 nm, emissione a 480
nm, simile a DEAC), che identificano sequenze alfa-satellite del
centromero del cromosoma 17.
Prodotto:
Z-2081-200: 0.2 ml (20 reazioni da 10μl ciascuna),
Z-2081-50: 0.05 ml (5 reazioni da 10μl ciascuna).
Specificità:
La Sonda ZytoLight SPEC p16/CEN 3/7/17 Quadruple Color
(PL40) è adibita all’evidenziazione delle regioni del gene umano
p16 così come l’alfa satellite dei cromosomi 3, 7 e 17 su tessuti
o cellule fissati in formalina ed inclusi in paraffina, mediante
ibridazione in situ in fluorescenza (FISH).
Conservazione:
La Sonda ZytoLight SPEC p16/CEN 3/7/17 Quadruple Color
(PL40) deve essere conservata a -16°...-22°C protetta dalla luce
(2…8°C per brevi periodi di tempo). La sonda è stabile durante
il periodo indicato dalla data di scadenza.
Utilizzo:
Il prodotto è designato per la diagnosi in vitro (in accordo con
la direttiva EU 98/79/EC). L’interpretazione dei risultati deve
essere fatta in un contesto clinico e patologico del paziente da
un patologo esperto.
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Precauzioni per l’uso: Leggere le istruzioni prima dell’utilizzo del prodotto.
Non usare il prodotto dopo la data di scadenza.
Il prodotto contiene sostanze (a basse concentrazioni)
dannose per la salute, evitare il contatto diretto con il
prodotto. Usare dispositivi di sicurezza (guanti, occhiali di
protezione, camice). Se il prodotto viene a contatto con la
pelle, lavare abbondantemente con acqua. Su richiesta
dell’utilizzatore è disponibile una scheda di sicurezza.
Principio del Metodo
La presenza di determinate sequenze di acidi nucleici nelle cellule o nei tessuti può
essere rilevata attraverso ibridazione in situ con l'utilizzo di sonde a DNA marcate.
L'ibridazione induce la formazione di una struttura a doppio filamento (ibrido duplex)
tra le sequenze presenti nel campione in analisi e la sonda.
La formazione del duplex (con le sequenze del gene p16 e dell’alfa-satellite dei
cromosomi 3, 7 e 17 nel campione) può essere visualizzata attraverso l'utilizzo di un
microscopio a fluorescenza con filtri appropriati.
Istruzioni
Il pretrattamento (sparaffinatura, proteolisi, post-fissazione) deve essere effettuato
dipendentemente dalle esigenze dell'utilizzatore.
Denaturazione e ibridazione della sonda:
1) Pipettare 10 μl di Sonda ZytoLight SPEC p16/CEN 3/7/17 Quadruple Color
(PL40) in ciascun campione.
Un leggero riscaldamento della sonda, nonché l'utilizzo di una punta della pipetta
tagliata (per aumentare la dimensione dell'apertura), può facilitare il pipettaggio.
Evitare di esporre a lungo la sonda alla luce.
2) Evitare la formazione di bolle, coprire con un coprioggetto (22 mm x 22 mm).
Sigillare il coprioggetto, ad esempio con uno strato di colla a caldo o silicone.
3) Denaturare il DNA presente nei vetrini a 75°C (±2°C) per 10 minuti, e.g. su una
piastra termoriscaldata.
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La temperatura di denaturazione deve essere ottimizzata, nell'intervallo tra 73°C e
77°C, dipendentemente dal grado di fissazione e dal tempo di conservazione del
preparato istologico/citologico.
4) Trasferire i vetrini in una camera umida ed ibridare overnight a 37°C (e.g. in
termostato).
È essenziale che il tessuto/le cellule non si asciughino durante l'ibridazione.
Eventuali ulteriori processi, quali lavaggio e contro-colorazione, possono essere
completati secondo le esigenze dell'utente. Per ottenere prestazioni ottimali, si
consiglia l'uso di un sistema di FISH ZytoLight (ZytoVision). Questo sistema viene
anche utilizzato per confermare l’adeguatezza della Sonda ZytoLight SPEC p16/CEN
3/7/17 Quadruple Color (PL40).
Risultati:
Con l'uso di appositi set di filtri, i segnali di ibridazione del gene p16 marcato
appaiono di colore giallo, quelli delle sequenze alfa-satellite del centromero dei
cromosomi 3, 7 e 17 appaiono rispettivamente di colore rosso, verde e blu.
Nell’interfase di cellule normali o cellule senza aberrazione dei cromosomi 3, 7 e 17,
appaiono due segnali p16 e due segnali del cromosoma 3, due del cromosoma 7 e
due del cromosoma 17. In cellule con un’ aneuploidia dei cromosomi menzionati
sopra o una delezione del gene p16, nell’interfase è visibile un pattern di segnale
differente. I polinucleotidi contenuti nella Sonda ZytoLight SPEC p16/CEN 3/7/17
Quadruple Color (PL40) che riconoscono le sequenze alfa-satellite del centromero dei
cromosomi 3, 7 e 17, funzionano sia come un controllo interno che indica l’avvenuta
ibridazione della sonda e sia come verifica dell’integrità del DNA cellulare. Al fine di
valutare la specificità dei segnali, ogni ibridazione deve essere verificata mediante
controlli (positivo e negativo). Si consiglia di utilizzare almeno un campione di
controllo in cui sia inequivocabilmente noto il numero di copie del gene p16 e dei
cromosomi 3, 7 e 17. Si consiglia di prestare particolare attenzione nell'osservazione
di cellule sovrapposte, le quali potrebbero condurre ad una erronea interpretazione
dei risultati, e.g. un amplificazione dei geni. A causa della de condensazione della
cromatina, singoli segnali FISH possono apparire come piccoli cluster, comunque due
o tre segnali della stessa dimensione, separati da uno spazio pari alla dimensione di
un segnale, devono essere considerati come un unico segnale.
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Bibliografia:
Revisione 140702 del 02/07/14
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