NPE2015: COMUNICATO STAMPA

Antibody-targeted cell
fusion
Takafumi Nakamura, Kah-Whye Peng, Sompong
Vongpunsawad,Mary Harvey, Hiroyuki Mizuguchi,
Takao Hayakawa, Roberto Cattaneo & Stephen J Russell
Anna Raganato
Paola Saeli
Veronica Rainone
Leonardo Mirandola
1
La fusione cellulare
•
•
•
•
•
fertilizzazione
sviluppo di placenta, muscolo, osso
infezioni virali
produzione di anticorpi monoclonali
terapia antitumorale genica o
citoriduttiva
2
Measles virus
• Paramixovirus
• tropismo: epitelio respiratorio, leucociti,
sistema reticoloendoteliale.
• caratteristica dell’infezione è la presenza
di cellule giganti multinucleate, o sincizi,
che si formano per l’azione fusogena
delle proteine virali di membrana
espresse dalla cellula ospite.
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Proteine HN ed F
La proteina HN è bifunzionale: la
neuroaminidasi rimuove acido sialico dal
recettore cellulare per il virus (CD46 o
SLAM); poi l’emagglutinina si lega al
recettore.
Questo evento attiva la proteina F (fusion)
che è responsabile direttamente della
fusione tra pericapside virale e
membrana cellulare.
4
SLAM
• Glicoproteina di membrana espressa
da linfociti B
timociti immaturi
linfociti T
• Ha funzioni costimolatorie per i
linfociti
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SLAM è il recettore cellulare
per MV
Lo dimostrano esperimenti di transfezione
con plasmidi recanti il cDNA per SLAM
Cellule umane resistenti all’infezione di MV
diventano suscettibili se transfettate con il
gene che codifica SLAM
L’effetto immunosoppressore di MV si esplica
in gran parte per il solo legame delle proteine
virali a SLAM, anche senza effetti citopatici
diretti, per il blocco dell’attività
costimolatoria
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Emagglutinina ingegnerizzata
• Flag-tag per purificazione ed immunoblotting
(DYDDDK)
• TM: dominio transmembrana
• Fxa: sito di taglio riconosciuto dal fattore Xa
• scFv: single-chain Ab (c-ter) anti- CD38
(marker di mieloma)
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• Mutazioni puntiformi nel sito di
riconoscimento per CD46 ed in quello
per SLAM aboliscono la capacità della
proteina di legarvisi, mentre scFv
conferisce nuova specificità
recettoriale.
• La fusione può così essere ristretta
solo ad un particolare tipo cellulare,
che esprime la proteina antigenica
riconosciuta da scFv.
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Tre diverse linee cellulari esprimenti
diversi recettori per H o per Hmutata sono state cotransfettate con
un plasmide recante il gene F ed un
plasmide con H o H-modificata.
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L’attività della proteina H dipende dall’efficienza del
suo trasporto alla superficie cellulare.
Perciò è stata rilevata la quantità totale di H e quella
presente in membrana mediante FACS ed
immunoblotting
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Sono possibili altri bersagli?
Sono state prodotte emagglutinine
chimeriche doppio-mutanti anti-CEA o
anti-EGFR.
Tranfettando le cellule con F e con H o
H anti-CEA o H anti-EGFR o H antiCD38 si osservano sincizi solo se la
linea cellulare esprime l’antigene
riconosciuto da scFv
11
12
Applicazioni
Per determinare l’efficacia della fusione
cellulare nella terapia tumorale
citoriduttiva sono stati prodotti vettori
adenovirali esprimenti la proteina F ed una
proteina tra: H, H anti-CD38, H anti-EGFR.
Cellule SKOV3ip.1(cellule di tumore ovarico
umano) sono state transfettate con questi
vettori.
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La linea SKOV3ip.1 esprime bassi livelli di
CAR (recettore primario per
coxsackievirus-adenovirus): ha una certa
resistenza ai vettori adenovirali, perciò si
utilizza una MOI (multiplicity of infection)
elevata (300p/cellula).
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La fusione e l’uccisione più efficiente
delle cellule tumorali si ha con il vettore
esprimente H anti-EGFR. Il processo
mediato da H non mutata è meno
efficiente, probabilmente perchè la
cellule tumorali hanno una densità di
EGFR superiore a CD46.
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Effetti della fusione cellulare su
tumori in vivo
Cellule SCOV3ip.1 trattate con vettori:
• AdH/F
• AdH-CD38/F
• AdH-EGFR/F
sono state impiantate in topi privi di
timo in modo da evitare il rigetto.
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Il vettore AdH-EGFR/F è più efficiente
nel limitare la crescita tumorale data la
sua capacità di formare sincizi.
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La fusione cellulare può servire anche
per formare ibridi selettivi tra cellule
tumorali e APCs, indirizzando e
stimolando la risposta immunitaria.
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Le cellule K562 transfettate con H-EGFR o con HCD38 non si fondono tra loro, ma con cellule epiteliali
tumorali (A431 ) o con cellule T Jurkat CD38+ .
Quindi è possibile la fusione eterologa purchè la
cellula transfettata non possieda il recettore di H.
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Un anticorpo monoclonale anti-EGFR blocca la fusione
tra K562 esprimente H anti-EGFR/F e A431
esprimente EGFR.
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MV oncolitici
• Il virus del morbillo puo’ essere
utilizzato allo scopo di uccidere
cellule tumorali, come quelle del
mieloma multiplo, costituendo quindi
un nuovo agente terapeutico
21
Allo scopo sono necessari almeno 3
passaggi:
• identificare un recettore specifico
del tumore contro cui indirizzare
selettivamente il virus
• ottenere un’ emagglutinina mutata
fusa con un scFv anti-recettore (le
mutazioni eliminano il riconoscimento
dei recettori naturali)
• produrre virioni infettanti dotati
della proteina H cosi’ modificata
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• Le cellule di mieloma multiplo
esprimono quantita’ elevate di CD38
• E’ stato ottenuto il virus ricombinante
MV-Edm anti-CD38
• Cellule CHO (CD38-) sono resistenti
all’infezione di MVa-CD38
• Cellule CHO tranfettate con plasmidi
recanti il cDNA per CD38 sono uccise
da MVa-CD38 ma non da MV
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Esperimenti in vivo su roditori
dimostrano che il virus ricombinante
causa la formazione di cellule
sinciziali multinucleate con danno
esteso alle cellule tumorali ma molto
ridotto su cellule normali
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Conclusioni
• E’ possibile fondere tra loro
selettivamente alcuni tipi cellulari
(contro cui sia stato prodotto un Ab
specifico) mediante proteine fusogene
virali ingegnerizzate
• Questa tecnica puo’ essere impiegata
nella terapia antitumorale (fusione
omologa/ eterologa)
• Mediante simili tecniche di ingegneria
proteica si possono reindirizzare
viurus umani contro particolari tipi
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cellulari, come i tumori
Un’altra categoria di proteine fusogene è la
classe II.
La proteina “E” è una proteina di fusione di
classe II, strutturalmente diversa da quelle
di classe I
Classe I
myxo- paramyxovirus
retrovirus (HIV)
filovirus (Ebola)
Classe II
yellow fever
West Nile virus
dengue virus
alphavirus 26
La proteina “E” è costituita da tre domini,I,II e
III,ciascuno dotato di una specifica funzione,e si presenta
sul pericapside sotto forma di dimero.
La struttura secondaria prevalente è il β-foglietto
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• I virus dotati di proteine di classe II
entrano nelle cellule per endocitosi
(endosomi)
• L’acidificazione del pH endosomale
determina dei significativi cambiamenti
strutturali nella proteina caratterizzati dal
ripiegamento e dal ri-orientamento dei tre
domini strutturali l’uno rispetto all’altro
• In particolare tra i domini I e II è stata
riscontrata una regione“cerniera” pHsensibile(Kl loop, residui 270-279)
• Mutazioni a questo livello alterano il valore
soglia del pH di fusione
28
29
• Dominio III della proteina virale:
tramite interazioni glicano-mediate
lega il recettore cellulare
• Dominio II: presenta un loop con una
sequenza idrofobica conservata
responsabile del legame alla
membrana bersaglio
• A pH acido il dimero si dissocia per
formare trimeri
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Il trimero mantiene le trutture
secondarie del dimero, ma con
differenti orientazioni reciproche
• Il dominio II ruota di 30° rispetto al
D. I
• Il dominio III ruota di 70° verso il D.
II, portandosi quindi vicino al “fusion
loop” del dominio II
La formazione del trimero procede dal
dominio II verso il dominio III,
mediante interazioni sia polari che
apolari
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• Il riarrangiamento molecolare porta
all’esposizione del dominio II alla cui
estremità si trova il “loop” di fusione
• Il loop di fusione è responsabile
dell’ancoraggio alla membrana
bersaglio; essenziali per questa sua
attività sono i residui idrofobici Trp101, Leu-107,Phe-108
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Figure 4 The dengue sE trimer. a, Ribbon diagram coloured as in Fig. 1b. Hydrophobic
residues in the fusion loop (orange) are exposed. The expected position of the
hydrocarbon layer of the fused membrane is shown in green. Representative lipids are
shown to scale. A chloride ion (black sphere) binds near the fusion loop. b, Surface
representation of the trimer. The dashed grey arrow indicates the most likely location for
the stem (see text). An extended cavity is visible near the tip of the trimer; access to this
cavity will probably be occluded by the stem. The glycan on Asn 67 and representative 33
lipids are shown in space-filling representation.
Meccanismo della fusione mediata
da proteine di classe II
• E si associa ad un
recettore della
superficie cellulare
mediante il dominio
III
• Questo legame
permette
l’endocitosi del
virus
34
• Il ridotto pH
dell’endosoma causa
la dissociazione dei
dimeri sul virione
• Esposizione dei
”fusion loops”
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Trimerizzazione
• Si ipotizza che la
membrana
dell’endosoma
catalizzi la
trimerizzazione
promuovendo la
formazione di un
intermedio
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• La trimerizzazione
causa il
ripiegamento del
dominio III
• L’energia libera
sprigionata dal
ripiegamento spinge
le membrane l’una
verso l’altra
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• Nel trimero si
creano contatti
ulteriori tra la
regione “stem”
(vicino alla porzione
transmembranaria)
ed il dominio II
• Questo permette
l’emifusione
38
• Le membrane si
fondono formando
un poro
39
• Tatsuo,H.,Ono,N., Tanaka,K. & Yanagi, Y. “SLAM
(CDw150) is a cellular receptor for measles virus”
Nature 406, 893-897 (2000)
• Yargo Modis, Steven Okata, David Clements, and
Stephen C. Harrison “Structure of the dengue
virus envelope protein after membrane fusion”
Nature 427, 313-319 (2004)
• Peng,K.W. et al. “Oncolytic measles viruses
diplaying a single-domain antibody against CD38, a
myeloma marker” Blood,
Blood 2557-2562 (2003)
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