La batteriosi dellactinidia: verso la coesistenza Conoscenze di base ed epidemiologiche per la coesistenza con Pseudomonas syringae pv. actinidiae Marco Scortichini, Patrizia Ferrante, Simone Marcelletti, Milena Petriccione C.R.A. – Centro, Unità Ricerca per la Frutticoltura Roma, Caserta A) Cause della comparsa improvvisa e della rapida diffusione dell’epidemia nel Lazio e in Italia B) Il “ciclo della malattia”: conferme, aggiornamenti, momenti-chiave C) Le popolazioni di PSA D) Genomica e Proteomica E) Resistenze genetiche e difesa F) Tecniche agronomiche 0 January February March April May June July August September Octobert November December January February March April May June July August September Octobert November December January February March April May June July August September Octobert November December January February March April May June July August September Octobert November December January February March April May June July August September Octobert November December *Gelata autunnale: 4-5/11/2007 2007 (674mm) *Gelata invernale: 1/02/2010 2008 (1210mm) 2009 (908mm) *Gelata fine autunno: 17/12/2010 *Gelata invernale: 17 /02/2008 *Gelata fine inverno: 8/03/2011 20 350 18 300 16 14 250 12 10 8 6 2 2010 (936mm) 2011 (782mm) 200 Precipit./ month(mm) 150 Average Min. T° (°C) 100 Apofruit Infected Gold Ha 4 50 0 GELATE Moltiplicazione di PSA dopo gelata autunnale Sintomi osservati 24 ore dopo la gelata autunnale. Il giorno dopo la gelata: estesa presenza di essudati (con PSA) Dagli essudati è stato reisolato PSA Pianta inoculata senza inoculo batterico, sottoposta a gelata Dopo gelata: 100% di infettività tramite stomi Danni da gelo senza inoculazione Moltiplicazione di Psa dopo gelata invernale Rami 1 anno Inizio marzo 15°C x 7 gg - 10°C x 3 gg Migrazione sistemica di PSA a seguito dello scongelamento Tre minuti dopo l’inoculazione durante lo scongelamento (inizio inverno) Migrazione sistemica di PSA a seguito dello scongelamento Effetto dell’irrigazione antigelo Mangiatori di Patate, Vincent Van Gogh, 1865 Peronospora della Patata, Phytophtora infestans 1845: Europa nord Monocultura su vaste aree Actinidia: un caso moderno di monocultura Importanza di conoscere la struttura genetica del patogeno: - Evidenziare l’aggressività delle popolazioni >>> controllo in campo - Monitorare la distribuzione geografica >>> diffusione malattia - Legislazione fitosanitaria >>> tecniche diagnostiche per quarantena Psa 1: Giappone (1989); Italia (1994) Psa 2: Corea del Sud (1994) Psa 3: Ceppo pandemico 2008 (Europa, Cina, Cile, NZ (Italian, V, biovar 3) Psa 4: Less virulent (Asian, LV, biovar 4): Nuova Zelanda, Australia Morfologia su substrati di crescita (NSA) PSA 1 PSA 2 PSA 4 PSA 3 LV PCR di sequenze ripetute BOX ERIC LV LV a REP b c LV Presenza/Assenza di Effettori Crescita in foglie di Hayward PSA 4 PSA 2 PSA 1 PSA 3 Patogenicità di Psa 4 su Ciliegio Acido Patogenicità su frutti di Peperone 4b) Fuoriuscita di essudati 1a) Avvizzimento delle gemme e dei germogli INVERNO 1c) Maculature fogliari 23*/'(#%! 4'56/'(#%!7%))'#(16)(! !!!!!!!!!!!!!!!!!!!%!!!!!! ,'-.*&'(#%!/'/+%0'1*! PRIMAVERA 1d) Avvizzimento dei giovani rami 4a) Cancri su cordoni e tronco 1b) Infezione dei boccioli fiorali 3b) Penetrazione !! peduncoli 2a) Formazione di cancri sottocorticali AUTUNNO 4'56/'(#%! 7%))'#(16)(! 3a) Penetrazione nelle lenticelle 2b) Formazione di cancri su cordoni e tronco ESTATE !!"#$%&'(#%!)*+%#+%! PRIMAVERA (Diffusione dellinoculo) B) Avvizzimento gemme, A)! Disseccamento rami fiori, germogli (dopo gelata invernale) C) Maculature fogliari e migrazione sistemica ESTATE (Infezione latente) AUTUNNO (Diffusione dellinoculo) INVERNO (Evasione) Calendario trattamenti (indispensabili) A) Ripresa vegetativa B) Fioritura C) Post-allegagione D) Dopo la raccolta E) Pieno inverno (gelate) F) Eventi meteorici avversi (forti piogge, grandine, gelate) G) Prima e dopo la potatura Colonizzazione Latente >>> 1 anno Reazione di Ipersensibilità >>>> Resistenza/Tolleranza ???? 42 "#! Punti chiave a) Notevole competitività in pianta (siderofori, enzimi pectici); b) Potenziale genetico per resistenza al Rame ed Antibiotici; c) Presenza di effettori specifici; d) Presenza di regioni genomiche variabili (trasferimento orizzontale); e) Acquisizione e perdita di plasmidi ; f) Assenza di Tossine note PROTEOMICA Separazione proteine mono/bidimensionale (10 post) Controllo 89:! /;(+/! Ramo inoculato 99=! /;(+/! 8<<! /;(+/! Classificazione funzionale e distribuzione relativa delle 117 proteine differenzialmente espresse nel ramo infetto da PSA RT-PCR Punti chiave a) Presenza nel ramo infetto di proteine di difesa della pianta (PR, HSP, ROS); a) In particulare, HSP 70 che lega un effettore type III (hopI1) di Pseudomonas syringae pathovars; c) Riprogrammazione del metabolismo del ramo a seguito dell’infezione batterica; d) Presenza di proteine batteriche nel ramo infetto >>> Diagnosi Moltiplicazione di PSA nel fluido apoplastico della foglia a seguito dell’inoculazione (21 giorni) 7,0 6,0 Log (cfu/ml) 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 0 5 10 15 Time (days) 20 25 OmpA family protein HSP 60 kDa chaperonin Proteine batteriche nel fluido apoplastico Outer membrane protein assembly factor BamA Real-time PCR Principali acquisizioni PSA/fluido apoplastico nelle foglie di kiwi verde • Un’azione “concertata” ha bloccato la patogenicità di PSA nell’apoplasto fogliare • Sono state identificate 58 proteine differenzialmente espresse • Perossidasi, β-galattosidasi e “heat shock proteins” sono state rilevate come espresse inizialmente • Chitinasi e proteine PR (pathogenic-related) sono state indotte successivamente • BamA, OmpA e HSP Cpn 60 potrebbero essere fattori di patogenicità anche per pseudomonadi fitopatogene Effetto fitotossico del filtrato colturale Sample Yield (mg 20/ ml of CF) Tobacco leafc Kiwifruit leafc Lemon fruitc AcOEt extract at pH CFa 3.4 - - - AcOEt extract at pH 2 3.8 - - - AcOEt extract at pH 10 3.2 - - - Aqueous phase from extraction with AcOEt at pH CFa 320.3 + ++ ++ Aqueous phase from extraction with AcOEt at pH 2b 327.6 ++ +++ +++ Aqueous phase from extraction with AcOEt at pH 10b 332.0 ++ +++ +++ BuOH extract at pH CFa 134.8 + + + BuOH extract at pH 2 125.2 + + + BuOH extract at pH 10 207.2 +++ +++ +++ Aqueous phase from extraction with BuOH at pH CFa 178.0 ++ +++ ++ Aqueous phase from extraction with BuOH at pH 2b 182.0 ++ +++ +++ Aqueous phase from extraction with BuOH at pH 10b 148.2 ++ +++ +++ Positive control ophiobolin (1.5 mg/ml) - +++ ++ +++ Negative control DMSO at 4% in distilled water - - - - Negative control (distilled water) - - - - Table 2. Yield (mg) and phytotoxic activity on tobacco and kiwifruit leaf, and lemon fruit, as recorded two days after the infiltration of low molecular weight basic compounds, dialysed and crude exopolysaccharides (EPS), and ethanolic fractions as obtained from 20 ml of Pseudomonas syringae pv. actinidiae CRA-FRU 8.43 culture filtrate (CF). Sample Yield (mg 20/ml of CF) Tobacco leaf Kiwifruit leaf Lemon fruit Basic fraction 14.6 ++ ++ ++ Dialysed CF 3500 D (IN) 32.4 ++ ++ ++ Dialysed CF 3500 D (OUT) 293.2 + + + 6.2 ++ ++ ++ Ethanol residue 1 233.4 + + + Ethanol residue 2 78.7 - - - - - - - Crude EPS Control (distilled water) Resistenza agli Antibiotici Diffusione rapida della resistenza all’antibiotico Presenza di tratti genetici di Psa antibiotico-resistenti in patogeni umani Resistenza al Rame Tecniche agronomiche e PSA Forma allevamento: VASO >>> maggior arieggiamento, meno legno 30/09/14 75 Kiwi giallo Kiwi verde Strategie per la “convivenza” con la “batteriosi” dell’actinidia - Monitoraggio aziendale e di “area” (inclusi vivai) - Sostituzione impollinatori (serie Matua) molto suscettibili - Adeguamento forma di allevamento - Gestione ottimale del suolo >>> concimazione (azoto) e correzione - Gestione ottimale dell’irrigazione - Gestione ottimale tecniche agronomiche (legatura, piegatura) - Protezione periodi-chiave (inverno incluso) - Protezione eventi meteorici avversi (gelo, grandine) - Estrema cura in fase di potatura Ricordo epidemia del 2008 400 q.li/ha nel 2013
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