Diffusione anomala = assorbimento
Assorbimento
Emissione
1.380 Å
1.542 Å
http://skuld.bmsc.washington.edu/scatter/AS_periodic.html!
1!
Sommario di un esperimento MAD:
multiple wavelength anomalous dispersion
1. introduzione del diffusore anomalo (atomo pesante) nel campione (se non gia’ presente)
2. analisi dello spettro di fluorescenza del campione: scelta delle 3(4) λ sperimentali
3. raccolta dati su 1 cristallo (3(4) λ sperimentali)
4. individuazione delle posizioni dei diffusori anomali (atomi pesanti):
Patterson delle differenze anomale
5. ottenimento delle fasi usando 2-4 datasets raccolti a diverse lunghezze d’onda
2!
1. introduzione del diffusore anomalo nel campione:
- il diffusore anomalo potrebbe essere già presente: ad es. metalloproteine
- soaking del cristallo con un atomo pesante
- produzione della proteina con seleniometionine
f 0 ⇒ f (λ ) = f 0 + Δf (λ ) + if % (λ )
2. analisi dello spettro
di fluorescenza del campione:
Sperimentale: misura di λ1 e λ2
€
lo spettro di emissione (fluorescenza) genera
lo spettro di assorbimento
teorico
3!
http://www.bmsc.washington.edu/scatter/AS_periodic.html!
Scattering anomalo
fattore di scattering atomico:
f 0 ⇒ f (λ ) = f 0 + Δf (λ ) + if %%(λ ) = f % + if %%
ricavato da f’’ misurati (fluorescenza)
€
2
Δf (ω ) =
π
∞
∫
0
ω %f %%(ω )
dω %
(ω %2 − ω 2 )
Solitamente la fluorescenza viene usata per misurare λ1 e λ2
€ produce uno sfasamento della radiazione diffusa (diverso da π)
L’assorbimento
f0!
f(λ)#
Δf !
f0!
in assenza di assorbimento
if "!
f '!
in presenza di assorbimento
4!
Coppie di Friedel
F(h,k,l) =
la densità elettronica è una funzione reale
∫ ρ(x, y,z)exp[−2πi(hx + ky + lz)]dV
ρ(x, y,z) = ρ * (x, y,z)
cell
F * (h,k,l) =
∫ ρ(x, y,z)exp[2πi(hx + ky + lz)]dV = F(h ,k ,l )
cell
€
F * (h,k,l) = F(h,k,l) e
−iα ( h,k,l )
= F(h ,k ,l ) = F(h ,k ,l ) e
€
iα ( h ,k ,l )
€
€
#% F(h,k,l) = F(h ,k ,l )
$
%&arg[ F(h,k,l)] = −arg[ F(h ,k ,l )]
€
in presenza di scattering anomalo non vale più la legge di Friedel
$& F(h,k,l) ≠ F(h ,k ,l )
%
&'arg[ F(h,k,l)] ≠ −arg[ F(h ,k ,l )]
5!
€
f ( λ ) = f 0 + Δf ( λ ) + if !!( λ ) = f ! + if !!
FH = FH" + iFH""
arg( FH (+)) ≠ −arg( FH (−))
i=e
i
π
2
€
sfasamento !
FPH (+) = FP (+) + FH" (+) + iFH""(+) = FP (+) e iα P (+) + FH" (+) e iα H (+) + i FH""(+) e iα H (+)
€
€
$& F(h,k,l) = F(h ,k ,l )
%
&'α (h,k,l) = −α (h ,k ,l )
€
FPH (−) = FP (+) e
−iα P (+)
+ FH$ (+) e
−iα H (+)
+ FH$$(+) e
&
π)
−i( α H (+)− +
'
2*
(+) = h,k,l!
FPH (+) ≠ FPH (−)
€
€
(+) = h,k,l!
F”H
FPH(+)
F’H
F”H(+)
FPH(+)
F”H(-)
F’H
FP(+)
(-) = -h,-k,-l!
€F (-)
FPH(-)
FP(+)
P
FPH(-)
F’H
F”H
riflessione rispetto all’asse R
6!
3. individuazione delle posizioni dei diffusori anomali:
Patterson delle differenze anomale
Δ F ano ≡ { FPH (+) − FPH (−) }
f%
2 f %%
F”H(+)
da dimostrare:
€
(Δ F )
ano
FPH(+)
F’H
F”H(-)
GPH
FPH(-)
2
≅
1
2
FH$ + rumore
2
FP
FH = FH" + iFH""
€
€
α "H" (+)
GPH
%
%
π(
π(
i'α #H + *
i'α #H + *
iα P
iα #H
iγ PH
&
&
2)
2)
/ FPH (+) = FP e + FH# e + FH## e
= GPH e
+ FH## e
€
.
€
%
%
π(
π(
−i' α #H − *
−i' α #H − *
/
−iα P
−iα #H
−iγ PH
&
&
2)
2)
+ FH# e
+ FH## e
= GPH e
+ FH## e
0 FPH (−) = FP e
α "H" (−)
€
7!
€
2
2
2
2
FPH (+) = GPH + FH"" (+) = GPH + FH"" + 2 GPH FH"" cos(γ PH − α "H" (+)) =
€
' π
*
2
2
2
2
= GPH + FH"" + 2 GPH FH"" cos)− + (γ PH − α "H ), = GPH + FH"" + 2 GPH FH"" sin(γ PH − α "H )
( 2
+
€
F”H(+)
π
α "H" (+) = α "H +
2
π
α "H" (−) = α "H −
2
FPH(+)
α’’H(+)
F’H
α’H
γPH
€
€
2
2
2
2
FPH (−) = GPH + FH## (−) = GPH + FH## + 2 GPH FH## cos(γ PH − α #H# (−)) =
€
€
'π
*
2
2
2
2
= GPH + FH"" + 2 GPH FH"" cos) + (γ PH − α "H ), = GPH + FH"" − 2 GPH FH"" sin(γ PH − α "H )
(2
+
8!
2
2
FPH (+) − FPH (−) = 4 GPH FH## sin(γ PH − α #H )
vale inoltre
€ la relazione seguente:
2
2
FPH (+) − FPH (−) = ( FPH (+) − FPH (−) )( FPH (+) + FPH (−) ) ≅ 2 GPH ( FPH (+) − FPH (−) )
approssimazione
FPH (+) ≈ FPH (−) ≈ GPH ⇒ FPH (+) + FPH (−) = 2 GPH
€
( FPH (+) − FPH (−) ) ≅ 2 FH$$ sin(γ PH − α $H )
€
FH"" =
f j""
∑ f ""exp(2πih ⋅ r ) = ∑ f "
€
j
j
j
j
j
f ""
FH"
f"
f j" exp(2πih ⋅ r j ) =
( FPH (+) − FPH (−) ) ≅ 2
€
€
f $$
FH$ sin(γ PH − α $H )
f$
Δ F ano ≡ { FPH (+) − FPH (−) }
f%
≅ FH% sin(γ PH − α %H )
2 f %%
9!
€
Δ F ano ≡ { FPH (+) − FPH (−) }
(Δ F )
€
sin 2 x =
2
ano
cos2x = cos2 x − sin 2 x = 1− 2sin 2 x
€
f%
≅ FH% sin(γ PH − α %H )
2 f %%
2
≅ FH$ sin 2 (γ PH − α $H )
€
1 1
− cos2x
2 2
(Δ F )
ano
2
≅
1
1
2
2
FH$ − FH$ cos2(γ PH − α $H )
2
2
€
γ PH , α #H
€
(Δ F )
ano
2
indipendenti
1
2
€
≅ FH$ + rumore
2
10!
€
Mappa di Patterson delle differenze anomale: posizione degli atomi pesanti
P(u) =
1
∑ (Δ Fh
V h
ano
)
2
cos(2πih ⋅ u) =
2
2( f ' +
1
F
(+)
−
F
(−)
) * 2 f ''- cos(2πih ⋅ u) ≈
∑ ( PH
PH
V h
)
,
2
1
1
≈ ∑ FH' cos(2πih ⋅ u) + rumore
V h 2
deconvoluzione:
posizione degli atomi pesanti
n
FH
n
FH ( λ) = ∑ f j ( λ)exp[2πi(h ⋅ r j )] = [ f 0 + Δf ( λ) + if ''( λ)]∑ exp[2πi(h ⋅ r j )] = FH' + iFH''
€
j=1
j=1
n
( Δf +
FH" = [ f 0 + Δf ( λ )]∑ exp[2πi(h ⋅ r j )] = FH 0 *1+
f0 ,
)
j=1
€
F”H(+)
n
€
FH 0 = ∑ f 0 exp[2πi(h ⋅ r j )]
FPH(+)
j=1
F’H
F”H(-)
FPH
FPH(-)
FP
deconvoluzione: posizione degli atomi pesanti
€
11!
SIRAS: single isomorphous replacement anomalous scattering
2 esperimenti: |FP|, 1/2(|FPH(+)| + (|FPH(-)| ), |FPH(+)| e |FPH(-)|
differenze isomorfe
differenze anomale
posizione degli atomi pesanti
FH
fasi
FPH(-)
# FPH (+) = FP + FH (+)
$
% FPH (−) = FP + FH (−)
€
FP
-FH(-)
-FH(+)
# FP = FPH ( + ) − FH ( + )
"
! FP = FPH ( − ) − FH ( − )
|FPH(+)|
12!
4. ottenimento delle fasi usando 2-4 dataset raccolti a diverse
lunghezze d’onda: MAD
n
n
FH (h, λ ) = ∑ f j ( λ )exp[2πi(h ⋅ r j )] = [ f 0 + Δf ( λ ) + if ''( λ )]∑ exp[2πi(h ⋅ r j )] = FA + a
j=1
j=1
f ( λ ) = f 0 + Δf ( λ ) + if !!( λ ) = f ! + if !!
€
parte anomala!
n
)
+ a = [Δf ( λ ) + if $$( λ )]∑ exp[2πi(h ⋅ r j )]
+
j=1
*
n
n
F
+
F
=
f
exp
2
π
i(h
⋅
r
)
⇒
(...) = A
∑
∑
[
]
A
0
j
+
f0
,
j=1
j=1
%Δf ( λ)
f $$( λ ) (
a ='
+i
*FA
f0 )
& f0
€
€
FPH = FP + FH = FP + FA + a = FPA + a
2
2
2
FPH = FPA + a + 2 FPA a cosΔϕ
13!
€
€
2
% Δf
% Δf
Δf 2 + ( f $ )
f$(
f$(
2
a ='
− i *F *A '
+ i *FA =
FA
f0 )
f0 )
f 20
& f0
& f0
2
%Δf ( λ)
f $$( λ ) (
a ='
+i
*FA
f0 )
& f0
€
angolo tra FPA e a!
€
FAf’’/f0&
Δϕ = ϕ PA − ϕ a = ϕ PA − ϕ A − δ
a
δ&
180° φa&
€
φA&
FAΔf/f0&
FPH
FP
FPA
φa=δ+φA&
FA
ϕPA
FA
%
a cos δ =
'
'
&
' a sin δ =
'
(
Δf
FA
f0
f $$
FA
f0
%
a cos 2 δ =
'
'
&
' a sin 2 δ =
'
(
Δf
FA cos δ
f0
f $$
FA sin δ
f0
% Δf
(
f $$
a (cos2 δ + sin 2 δ ) = a = ' cos δ +
sin δ * FA
f0
& f0
)
14!
€
€
€
2
2
2
FPH = FPA + a + 2 FPA a cosΔϕ
cosΔϕ = cos(ϕ PA − ϕ A − δ ) = cos(ϕ PA − ϕ A ) cos(δ ) + sin(ϕ PA − ϕ A ) sin(δ )
€
€
a cosΔϕ = a (cos(ϕ PA − ϕ A ) cos(δ ) + sin(ϕ PA − ϕ A ) sin(δ )) =
= cos(ϕPA − ϕA )
€
Δf
f%
FA + sin(ϕPA − ϕA ) FA
f0
f0
€
15!
& Δf
)
f %%
2
2
2
FPH = FPA + a + 2 FPA FA ( cos(ϕ PA − ϕ A ) +
sin(ϕ PA − ϕ A )+ =
f0
' f0
*
= FPA
€
€
2
2
2
& Δf
)
Δf 2 + ( f ##)
f ##
2
+
F
+
2
F
F
cos
ϕ
−
ϕ
+
sin
ϕ
−
ϕ
(
)
(
)
(
+
A
PA
A
PA
A
PA
A
f 02
f0
' f0
*
2
2
(
)
FPH = FPA + p( λ) FA + 2 FPA FA q( λ)cos(ϕPA − ϕA ) + r( λ)sin(ϕPA − ϕA )
misura sperimentale
€
∀λ ⇒ FPH (+), FPH (−)
€
FPA , FA , ϕ PA − ϕ A
sono sufficienti 2 esperimenti (2 terne di valori p, q, r) con 2 lunghezze d’onda differenti:
4 equazioni in 3 incognite
€
ϕA
€
2 equazioni in 3 incognite:
è noto dalle posizioni degli atomi pesanti: mappa di Patterson diff. anomale
16!
Scelta delle lunghezze d’onda sperimentali
f ( λ) = f 0 + Δf (λ ) + if $$(λ ) = f $ + if $$
peak: f’’ massimo, Δf medio
€
remote1:
f’’ medio, Δf grande
remote2: f’’ minimo, Δf grande
17!
inflection: f’’ medio, Δf minimo
Configurazione assoluta degli atomi pesanti nel MIR: uso del segnale anomalo
Δ F ano ≡ { FPH (+) − FPH (−) }
f%
≅ FH% sin(α PH − α %H )
2 f %%
€
FH" =
€
k
sin(α PH − α "H )
{ FPH (+) − FPH (−) } ≥ 0
sperimentale: dai dati isomorfi
sperimentale
2 configurazioni degli atomi pesanti
(α PH
%' FH" ≥ 0
&
'( FH" ≤ 0
%'+ α PH − α $H
− α $H ) = &
'(− α PH − α $H
configurazione “giusta”
configurazione “sbagliata”
18!
€
€
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