Lezione XXIII 30.05.14 Cromat-mod

Corso di insegnamento Biochimica e Biotecnologie degli Alimenti
Tecniche cromatografiche
Lezione n. XXIII-30.05.14
Principi generali
Con il termine “cromatografia” si intende qualsiasi tecnica che consente di ottenere
la separazione dei componenti di una miscela di sostanze – generalmente affini – in
base alla loro migrazione differenziale tra
- una fase stazionaria (solido, gel, liquido, miscela solido/liquida) immobilizzata e
- una fase mobile che la attraversa (liquido o gas).
La base di tutte le forme di cromatografia è il coefficiente di
ripartizione Kd (o di distribuzione) che descrive il modo in cui un
composto si distribuisce tra le due fasi immiscibili A e B:
Concentrazione nella fase A (mobile)
= Kd
Concentrazione nella fase B (stazionaria)
Il coefficiente effettivo di distribuzione invece è definito come:
quantità totale nella fase A
quantità totale nella fase B
= Ked
La scelta della fase stazionaria e di quella mobile viene eseguita in modo tale che i
composti da separare abbiano diversi coefficienti di distribuzione.
Ciò si ottiene sfruttando:
Un equilibrio di ADSORBIMENTO tra una fase stazionaria solida e una fase mobile
liquida (cromatografia di adsorbimento, cromatografia ad interazione idrofobica);
Un equilibrio di RIPARTIZIONE tra una fase stazionaria liquida e una fase mobile
liquida o gassosa (cromatografia di ripartizione, cromatografia in fase inversa,
cromatografia per accoppiamento ionico, cromatografia chirale, cromatografia di
ripartizione gas-liquida, cromatografia controcorrente);
Un equilibrio di SCAMBIO IONICO tra uno scambiatore ionico stazionario e una fase
elettrolitica mobile (cromatografia a scambio ionico, cromatofocalizzazione);
Un equilibrio tra una fase liquida intrappolata all’interno dei pori di una struttura
stazionaria porosa e una fase liquida mobile (cromatografia ad ESCLUSIONE
MOLECOLARE o cromatografia per permeazione su gel);
Un equilibrio tra un ligando stazionario immobilizzato e una fase liquida mobile
(cromatografia per AFFINITA’).
Tipi di cromatografia
Le separazioni cromatografiche possono essere ottenute con due tecniche di base:
Cromatografia su colonna, in cui la fase
stazionaria, attaccata a una matrice adatta
(un supporto inerte e insolubile) è
impaccata in una colonna di vetro o di
metallo e la fase mobile passa attraverso
la colonna per gravità o usando un
sistema di pompaggio oppure applicando
un gas sotto pressione.
Cromatografia su strato sottile o planare,
in cui la fase stazionaria, attaccata a una
matrice adatta, ricopre di uno strato
sottile una superficie di vetro, plastica o
metallo. La fase mobile liquida passa
attraverso lo strato sottile per capillarità.
Vantaggio: studio di molti campioni.
Include la cromatografia su carta in cui la
fase liquida stazionaria è supportata dalle
fibre di cellulosa di un foglio di carta.
(Prima cromatografia utilizzata).
Separazione cromatografica
Cromatografia su colonna
Concentazione
Kd= 1
*
*
*
*
*
*
*
Dopo un numero relativamente piccolo di ”equilibri” (ripartizioni), il composto nella
colonna avrà una distribuzione gaussiana.
Se, in una miscela, due componenti hanno coefficienti di distribuzione diversi,
si separeranno in due bande distinte.
Tanto maggiore è il numero di piatti e tanto più efficiente è la colonna
Fattori che influenzano la RISOLUZIONE di un miscuglio di composti
1. La velocità di avanzamento di un composto lungo la colonna, che dipende dal suo
coefficiente effettivo di distribuzione;
2. La forma del picco di concentrazione, che dipende dal numero di equilibramenti
che si sono verificati.
Risoluzione
V2 – V1
RS =
(w1 + w2) /2
La RISOLUZIONE dunque è in relazione con le proprietà
dei picchi ed è definita come il rapporto tra la
separazione dei picchi e la media della loro ampiezza.
Fasi stazionarie
Forma e dimensioni influenzano la velocità di flusso ed il potere di risoluzione.
- più grosse sono le particelle, più veloce è il flusso. Particelle di piccole
dimensioni hanno però un rapporto superficie-volume più elevato e quindi
potenzialmente un potere di risoluzione maggiore.
- le particelle sferiche offrono caratteristiche migliori. Le dimensioni delle
particelle vengono espresse in termini di larghezza di maglia (mesh).
Più grande è il valore di mesh e tanto più piccola è la particella.
Applicazione del campione
1- Rimozione del solvente e applicazione
del campione;
2- Aumento della densità del campione;
Sviluppo della colonna
- Separazione isocratica.
- Eluizione tramite gradiente.
- Pompa peristaltica.
Raccolta ed analisi delle frazioni
-Rivelatore (?)
-Collettore
-Registratore
- Analisi immediata e raccolta delle sole frazioni d’interesse;
- Raccolta di tutte le frazioni ed analisi successiva.
CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO
Principio
Scambio di ioni tra supporto e soluzione. Legami non covalenti (ponti salini).
Eluizione selettiva mediante variazione di pH o forza ionica o entrambi.
Materiali
- Polimeri di stirene e di divinilbenzene (legami crociati);
- cellulose modificate chimicamente;
- derivati del destrano e dell'agarosio (Sephadex e Sepharose).
Procedura
- Si può competere per i siti di legame con altri gruppi ionici (sali).
- In alternativa è possibile variare il pH per modificare lo stato ionico delle
molecole legate.
- Si può variare la temperatura.
Tamponi cationici più usati: Tris, piridina, alchilamine;
Tamponi anionici più usati: acetato, barbiturato, fosfato.
Cromatografia ad esclusione molecolare
Principio
Separazione in funzione delle differenze di dimensioni (forma e peso
molecolare).
Materiali
I gel usati comprendono:
- destrani a legami crociati (nome depositato Sephadex),
- agarosio (Sepharose Bio-Gel A, Sagavac),
- poliacrilamide (Bio-Gel P),
- poliacriloilmorfolina (Enzocryl Gel) e
- polistireni (Bio-Beads S).
Procedura
Le molecole troppo grandi per entrare nei pori, passano rapidamente e sono
eluite in un’unica frazione.
Le molecole in grado di diffondere attraverso i pori vengono ritardate.
Ripartizione liquido (fase stazionaria dentro i pori) – liquido (eluente)
Cromatografia di affinità
Principio
A differenza degli altri tipi di cromatografia non si basa sulle differenze nelle
proprietà fisiche delle molecole da separare, ma sfrutta le interazioni altamente
specifiche delle molecole biologiche.
Materiali
- Formazione di legami stabili di tipo covalente tra i gruppi o composti attivi (ligandi)
e le matrici inerti.
- Formazione di legami deboli tra ligando e molecola da separare.
Rapida ed altamente specifica.
Matrice
Ligando
L
Braccio spaziatore
Proteina
Cromatografia liquida a bassa pressione
Pompa
Peristaltica
Colonna
Contenitore
di eluente
Schema dello sviluppo di una cromatografia a
bassa pressione con metodologia classica.
L’eluizione può avvenire per gravità o con
l’ausilio di una pompa peristaltica.
Collettore di
frazioni
detector
REGISTRATORE
Lettura automatica.
Si ottiene direttamente il cromatogramma.
Lettura “manuale” delle
frazioni
ottenute
per
costruire il cromatograma.
Cromatografia liquida ad alta pressione (alta risoluzione) - HPLC
Aumento piatti teorici per unità di lunghezza delle colonne = aumento risoluzione.
Diminuzione diametri delle sfere della matrice = aumento superfice di interazione.
Conseguente difficoltà di passaggio dell’eluente = aumento della pressione.
Cromatografia di affinità
Principio
A differenza degli altri tipi di cromatografia non si basa sulle differenze nelle
proprietà fisiche delle molecole da separare, ma sfrutta le interazioni altamente
specifiche delle molecole biologiche.
Materiali
- Formazione di legami stabili di tipo covalente tra i gruppi o composti attivi (ligandi)
e le matrici inerti.
- Formazione di legami deboli tra ligando e molecola da separare.
Rapida ed altamente specifica.
Matrice
Ligando
L
Braccio spaziatore
Proteina
Cromatografia liquida a bassa pressione
Pompa
Peristaltica
Colonna
Contenitore
di eluente
Schema dello sviluppo di una cromatografia a
bassa pressione con metodologia classica.
L’eluizione può avvenire per gravità o con
l’ausilio di una pompa peristaltica.
Collettore di
frazioni
detector
REGISTRATORE
Lettura automatica.
Si ottiene direttamente il cromatogramma.
Lettura “manuale” delle
frazioni
ottenute
per
costruire il cromatograma.
Cromatografia liquida ad alta pressione (alta risoluzione) - HPLC
Aumento piatti teorici per unità di lunghezza delle colonne = aumento risoluzione.
Diminuzione diametri delle sfere della matrice = aumento superfice di interazione.
Conseguente difficoltà di passaggio dell’eluente = aumento della pressione.
PURIFICAZIONE DI PROTEINE
Le proteine possono essere purificate in base alle proprietà che
posseggono e che permettono di applicare tecniche differenti.
Proprietà delle Proteine
Tecnica
Grandezza molecolare
Cromatografia per gel filtrazione
Carica
Cromatografia a scambio ionico
Idrofobicità
Cromatografia ad alta pressione,
a fase inversa (RP-HPLC)
Cromatogfrafia di affinità
Attività biologica

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