Real-Time Quantitative PCR t(11;14) (BCL1/IgH) MTC per la diagnosi ed il monitoraggio del linfoma mantellare QUANT-BCL1/IgH Cat. n.1.007 Il linfoma mantellare (MCL) è una forma aggressiva di linfoma non Hodgkin (LNH) che tipicamente colpisce i maschi anziani ed è generalmente associato al riarrangiamento genico BCL1/JH. Esso costituisce il 4-6% di tutti i LNH dell’adulto e si presenta generalmente alla diagnosi con linfoadenopatia, coinvolgimento del midollo osseo e del tratto gastro-intestinale. Il linfoma mantellare è associato alla traslocazione t(11;14) che provoca la traslocazione del gene BCL1 (Ciclina D1), localizzato sul cromosoma 11q13, con la regione “joining” (J) della catena pesante delle immunoglobuline (IgH), presente sul cromosoma 14q32 (riarrangiamento BCL1/IGH). Circa la metà di tali traslocazioni avviene all’interno di una regione di 500 basi, denominata regione “major translocation cluster” (MTC), localizzata a monte della regione 5’ non tradotta (5’UTR) del gene BCL1 sul cromosoma 11q13. I restanti punti di rottura sul cromosoma 11 sono ampiamente distribuiti su di una regione di circa 120 Kb, al cui interno è presente una regione “minor translocation cluster” (mtc-1) di 500 bp localizzata a valle della MTC. I punti di rottura sul cromosoma 14 avvengono all’interno della porzione 5’ di una delle 6 regioni J del gene IgH. Come effetto della t(11;14), il gene BCL-1, non alterato dalla traslocazione, passa sotto il controllo dell’enhancer IgH con la conseguente iperespressione costitutiva, nelle cellule linfomatose, della proteina Ciclina D1 (BCL1). Solo le traslocazioni che coinvolgono la regione MTC possono essere evidenziate con una analisi di routine mediante PCR. Pertanto solo il 30-40% dei casi di MCL possono essere individuati, mediante metodica PCR, come portatori della traslocazione t(11;14). Recentemente è stato dimostrato che la valutazione quantitativa delle cellule positive per la traslocazione t(11;14), dopo terapia convenzionale o ad alte dosi, rappresenta un potente fattore predittivo di una remissione prolungata nei pazienti con MCL. Pertanto la possibilità di misurare a livello molecolare la malattia minima residua (MRD) dopo appropriate terapie, costituisce un potente strumento per la identificazione di sottogruppi di pazienti affetti da MCL con una prognosi significativamente differente. La valutazione quantitativa delle cellule BCL1/IgH+ in vari campioni di tessuto (sangue periferico, midollo osseo, linfonodi, biopsie di altri tessuti) ottenuti da pazienti con MTC+ MCL, rappresenta un sistema rapido, accurato e riproducibile per: I) la diagnosi molecolare dei pazienti con MCL MTC+ (30-40% dei casi), II) il monitoraggio accurato e diretto della MRD nei casi MTC+, III) la valutazione precoce dell’efficacia terapeutica di specifici trattamenti come chemioterapia, immunoterapia, chemio-immunoterapia, terapia ad alte dosi, e radio-immunoterapia, IV) il monitoraggio della contaminazione tumorale di espianti cellulari (midollo osseo, cellule staminali periferiche) da utilizzare nelle procedure di autotrapianto, V) la valutazione prognostica precoce dei pazienti con MCL MTC+. Il kit QUANT-BCL1/IgH permette la quantificazione delle cellule t(11;14)+ in campioni di tessuto (sangue periferico, linfonodi, biopsie di altri tessuti) da pazienti con linfoma mantellare. Principio del metodo: a) estrazione del DNA genomico; b) amplificazione Real-time con SYBR Green® Applicabilità: su DNA estratto da sangue periferico, midollo osseo, cellule di linfonodi o altri tessuti. Numero di Test: 24 campioni da eseguire in duplicato (o 132 reazioni), curve standard e controlli. CONTENUTO DEL KIT E SUA CONSERVAZIONE CD ROM 700 MB Software per il calcolo dei risultati STANDARD DILUTIONS St1-pMTC 9x105 copie/2µl - Alb 9x104 copie/2µl St2-pMTC 9x104 copie/2µl - Alb 9x103 copie/2µl St3-pMTC 9x103 copie/2µl - Alb 9x102 copie/2µl St4-pMTC 9x102 copie/2µl - Alb 9x101 copie/2µl St5-pMTC 9x101 copie/2µl - Alb 9x100 copie/2µl St6-pMTC 9x100 copie/2µl REAL-TIME PCR 10X Albumin Primers 10X BCL1/IgH Primers SYBR Green® Master Mix 2X H2O DNase/RNase-free RT -20°C -20°C -20°C -20°C -20°C -20°C -20°C -20°C +4°C -20°C Stabilità: superiore a 18 mesi se correttamente conservato. Materiali Richiesti: provette da 1,5 ml e da 15 ml in polipropilene; portaprovette refrigerato; puntali sterili con barriera antiaerosol; Provette da PCR con tappo ottico. Reagenti richiesti non compresi nel kit: Per l'estrazione del DNA si consiglia di utilizzare il seguente kit: • Kit Estrazione DNA - cat. n. 101 Strumenti richiesti: centrifuga con rotore ad angolo fisso per provette da 2 ml (12.000 x g) e centrifuga a rotore oscillante con adattatori per provette da 15 ml (1.500 x g); Set di pipette pre-PCR e post-PCR (0.5 – 20 µl, 10 – 100 µl, 20 – 200 µl, 200 – 1000 µl); Cappa Biohazard classe II; Camera elettroforetica con alimentatore; Transilluminatore UV; Apparato fotografico. Strumento Real-time PCR. Tutti i materiali necessari all’esecuzione del test devono essere sterili, DNase/RNase free e monouso. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI L’uso di una curva standard di quantità note sia del gene endogeno di riferimento (Albumina) che delle copie riarrangiate di BCL1/IgH (pMTC), consente il calcolo, in ciascun campione, del rapporto tra le copie geniche specifiche BCL1/IgH e il DNA di riferimento (Albumina). In basso sono mostrati i risultati relativi alle curve di amplificazione BCL1/IgH e alle curve standard (diluizioni Albumina e BCL1/IgH). Amplification Plots Curva Standard STANDARDS DILUTIONS - rearrenged gene BCL1/IgH-MTC (St.1 - St.6) Y = -3.04 (+/-0.3) *LOG(X) + 36.98, Eff. = 97.7% STANDARDS DILUTIONS - control gene Albumin (St.1 - St.5) Y = -3.05(+/- 0.5)*LOG(X) + 35.42(+/-5.5), Eff. = 92.8% I risultati sono espressi contemporaneamente come stima diretta delle copie di BCL1/IgH-MTC, copie BCL1/IgH-MTC normalizzate con l’albumina e numero assoluto di cellule BCL1/IgH-positive/105 cellule normali. I calcoli sono eseguiti automaticamente dal software dedicato allegato BIBLIOGRAFIA The Non-Hodgkin's Lymphoma Classification. Blood (1997) 89:3909-3918 Frater JL et al. Curr Opin Hematol (2002) 9: 56-62 Tsujimoto Y et al. Science (1984) 224:1403-1406 Williams ME , Swet al. Leukemia (1993) 7: 241-245 Tsujimoto Y et al. Nature (1985) 315:340-343 de Boer CJ et al. Oncogene (1995) 10: 1833-1840 Pott C et al. Blood (2006) 107: 2271-2278 Howe JG et al. Clinical Chemistry (2004) 50: 80-87 Thomazy VA et al. J Mol Diagn. (2002) 4:201-408 Pott C et al. Eur J Haematol (2005) 74: 353-358 Andersen NS et al. Exp Hematol (2002) 30: 703-710
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