Development of new therapeutic tools and - ETH E

DISS. ETH NO. 22214
Development of new therapeutic
tools and genetic in vivo models to
study the function of podoplanin
in the lymphatic vascular system
A thesis submitted to attain the degree of
DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH
(Dr. sc. ETH Zurich)
presented by
ROBERTA BIANCHI
Laurea specialistica in Biotecnologie Mediche,
Università degli Studi di Brescia, Italy
Born on 22.06.1985
Citizen of Italy
Accepted on recommendation of
Prof. Dr. Michael Detmar
Prof. Dr. Cornelia Halin Winter
2014
1. SUMMARY
1.1 Summary
The lymphatic vascular system has important physiological functions in maintaining tissue fluid balance and in the trafficking of immune cells. Moreover,
lymphangiogenesis is involved in pathological conditions such as inflammation and cancer, and it is considered a valuable approach to fight cancer dissemination.
Podoplanin is a small, heavily O-glycosylated transmembrane glycoprotein expressed on the surface of a variety of cell types including lymphatic endothelial
cells and lung alveolar type-1 cells. Insights into the function of podoplanin
in the lymphatic vascular system have been gained by competitive inhibition
studies employing a soluble form of the protein, podoplanin-Fc, and by the
analysis of podoplanin-deficient animals. Podoplanin-Fc reduced lymphangiogenesis in vitro and in vivo, but induced bleeding side effects by interacting with
CLEC-2 and activating platelets, leading to disseminated intravascular coagulation. Podoplanin global constitutive knockout mice displayed defects in the
development of the lymphatic system including blood-filled lymphatic vessels.
Since they died at birth due to lung abnormalities, podoplanin functions in the
adult lymphatic system have not been well explored so far.
The present work was aimed at improving podoplanin-Fc as a therapeutic tool
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and at generating novel in vivo models for the study of the function of podoplanin in the lymphatic vascular system.
To improve the tolerability of podoplanin-Fc, we produced and characterized a
mutant form, in which we mutagenized a threonine residue considered essential for CLEC-2 binding to alanine. The mutant podoplanin-Fc displayed a 30fold reduced binding affinity for CLEC-2 as compared to the wild-type isoform.
Mutant podoplanin-Fc was equally active as the wild-type protein in inhibiting
lymphangiogenesis in vitro, and it also showed in vivo activity. Mice treated
with mutant podoplanin-Fc showed fewer platelet activation-related side effects in vivo. These data suggest that CLEC-2 binding is not a requirement for
the anti-lymphangiogenic activity of podoplanin-Fc and that mutagenesis is a
valid approach to improve the in vivo tolerability of this inhibitor.
As a second tool for the study of podoplanin in the lymphatic system, we generated a lymphatic-specific podoplanin knockout mouse and induced gene deletion postnatally. The mice were viable and their lymphatic vessels appeared
morphologically normal and were functional. Interestingly, we frequently
observed lymph nodes that appeared bloody. There were red blood cells in
lymphatic vessels within the lymph nodes, but there was no extravasation of
erythrocytes from blood vessels. We hypothesize that podoplanin may have an
important function preventing backflow of blood into the lymphatic circulation at the interconnection between the blood and lymphatic vascular systems
(i.e. the lymphovenous valve).
Lastly, we generated a reporter mouse expressing tdTomato under control of
the Prox1 promoter for the in vivo imaging and analysis of the lymphatic system. We found that lymphatic vessels expressed tdTomato that co-localized
with known lymphatic markers. This novel in vivo tool was successfully applied
to intravital microscopy of dendritic cell migration and to fluorescence-activated single cell analysis of lymphatic endothelial cells.
In conclusion, we developed novel therapeutic and genetic tools that allow to
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investigate the function of podoplanin and to visualize the lymphatic endothelium. They have the potential to be of great use for further research regarding
podoplanin and the lymphatic vascular system.
1.2 Riassunto
Il sistema linfatico svolge importanti funzioni fisiologiche nel mantenimento
dell’equilibrio dei fluidi corporei e nel trasporto delle cellule immunitarie. È
inoltre coinvolto in alcune condizioni patologiche come l’infiammazione e il
cancro, per questo motivo l’inibizione della linfangiogenesi è considerata una
valida possibilità nel trattamento della disseminazione tumorale.
Podoplanina è una piccola glicoproteina transmembrana, estensivamente
O-glicosilata ed espressa sulla superficie di diversi tipi cellulari, tra i quali le
cellule endoteliali linfatiche e gli pneumociti di tipo 1. Informazioni riguardo alla funzione di podoplanina nel sistema linfatico sono state ottenute sia da
studi d’inibizione competitiva, in cui è stata utilizzata una forma solubile della
proteina, podoplanina-Fc, che dall’analisi dei topi knockout. Podoplanina-Fc
inibisce la linfangiogenesi in vitro e in vivo, ma allo stesso tempo induce effetti
collaterali a carico della coagulazione dovuti alla sua interazione con CLEC-2 e
alla conseguente attivazione piastrinica, che porta allo sviluppo della sindrome
da coagulazione intravascolare disseminata.
I topi knockout per podoplanina mostrano difetti nello sviluppo del sistema
linfatico, tra i quali la presenza di sangue all’interno dei vasi linfatici. Inoltre,
il fenotipo è letale alla nascita, a causa di difetti nello sviluppo polmonare. Per
questo motivo lo studio della funzione di podoplanina nel sistema linfatico
adulto non è stato finora possibile.
Gli obiettivi di questo lavoro di tesi sono stati: (a) l’ottimizzazione di podoplanina-Fc mirata ad un suo possibile sviluppo terapeutico e (b) la creazione di nuovi
modelli in vivo per lo studio della funzione di podoplanina nel sistema linfatico.
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Per migliorare la tollerabilità di podoplanina-Fc, abbiamo prodotto e caratterizzato una forma mutante della stessa, nella quale una treonina, considerata
essenziale per il legame a CLEC-2, è stata mutata in alanina. La podoplanina-Fc mutante mostra un’affinità di legame per CLEC-2 di 30 volte inferiore
rispetto all’isoforma wild-type. La podoplanina-Fc mutante ha la stessa attività
della wild-type nell’inibire la linfangiogenesi in vitro, ed è inoltre caratterizzata da attività anti-linfangiogenetica in vivo. Topi trattati con podoplanina-Fc
mutante sviluppano minori effetti collaterali relativi a disturbi dell’attivazione
piastrinica in vivo. Questi dati suggeriscono che il legame a CLEC-2 non sia
necessario per l’attività anti-linfangiogenetica di podoplanina-Fc e che la mutagenesi sia un valido approccio per migliorare la tollerabilità in vivo di questo
inibitore.
Come secondo modello per lo studio del ruolo di podoplanina nel sistema linfatico, abbiamo generato un topo knockout condizionale per podoplanina, in
modo da poter indurre delezione genica esclusivamente nel sistema linfatico
dopo la nascita. I topi sopravvivono e la morfologia e la funzione dei loro vasi
linfatici appaiono normali. Tuttavia, abbiamo frequentemente osservato la
presenza di sangue nei linfonodi, non dovuta a rottura dei vasi sanguigni, ma
alla presenza di globuli rossi all’interno dei vasi linfatici linfonodali. Ipotizziamo che podoplanina possa svolgere una funzione importante nel prevenire
il reflusso di sangue nella circolazione linfatica, nel punto in cui i due sistemi
vascolari si uniscono, cioè la valvola linfatico-venosa.
Infine, abbiamo generato un modello animale che esprime la proteina fluorescente tdTomato sotto il controllo del promotore linfatico Prox1, in modo da
permettere la visualizzazione e l’analisi in vivo del sistema linfatico. Abbiamo
dimostrato che l’espressione di tdTomato nei vasi linfatici co-localizza con noti
marcatori delle cellule endoteliali linfatiche. Questo nuovo modello in vivo è
stato applicato con successo sia in esperimenti di microscopia intravitale, finalizzati allo studio della migrazione delle cellule dendritiche, che nell’analisi
citofluorimetrica delle cellule endoteliali linfatiche.
In conclusione, abbiamo sviluppato nuovi strumenti terapeutici e genetici che
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ci hanno permesso di studiare la funzione di podoplanina e di visualizzare il
sistema linfatico. Questi strumenti hanno un grande potenziale di utilizzo in
futuri studi riguardanti podoplanina e il sistema linfatico.
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