EPR1

Spettroscopia EPR
ELECTRON PARAMAGNETIC RESONANCE
E’ una tecnica basata sull’assorbimento di radiazione elettromagnetica (frequenza
nel campo delle microonde) da parte di un campione paramagnetico immerso
nelle linee di forza di un campo magnetico esterno.
L’assorbimento avviene per ben precise coppie di valori campo-frequenza
dipendenti dalla natura del campione (assorbimento risonante).
Il paramagnetismo di un sistema è legato alla presenza di elettroni disaccoppiati
portatori di momento di dipolo magnetico.
Campo
elettrico
λ
Campo
magnetico
L’ EPR è basato
sull’interazione del momento
di dipolo magnetico (µ
µe) con il
vettore magnetico associato
alla radiazione
EPR: applicazioni biologiche
• Piccole molecole coinvolte in reazioni Enzimatiche
Rapid freeze-quench EPR
• Proteine Fotosintetiche:
Reaction Centres, Oxygen evolving complex;Cytochrome b6fComplex
• Metalloproteine
-Copper (Cu) Proteins: Type I and Type II copper proteins; Multicenter
copper proteins
-Iron (Fe) proteins: Non-haem Iron proteins and Haem Iron proteins
Iron Sulphur Proteins
-Nickel: enzimi contenenti Ni
-Molybdenum: enzimi contenenti Mb
-Tungsten; enzimi contenenti W
-Manganese enzimi contenenti Mn
EPR: applicazioni biologiche
• Spin labeling accoppiata a mutagenesi sito-specifica (SDSL)
Site directed spin labelling (SDSL)
• Determinazione di concentrazioni e cinetiche di radicali a vita
corta mediante spin trapping (ex. Free radicals in tessuti)
R
R
N O +
X
N O
X
Nitrosoderivati alifatici
o aromatici
NMR
Resonance freq. (0.32 T)
Wavelength
Transition energy
Rel. population difference
Sensitivity
EPR
EPR
9000 MHz
3.3 cm
3.7*10-5 eV
~10-3
~1011 spins
µ e ≅ 1000 ⋅ µ H
NMR
14 MHz
~2200 cm
5.6*10-8 eV
~10-6
~1017 spins
Momento di dipolo magnetico
Il momento di dipolo magnetico ( o momento
magnetico) è proporzionale al momento angolare
ma ha verso opposto:
r
µe = − g e µ B S
r
S
fattore-g o fattore di Landé
g e = 2.0023
per l'elettrone libero
magnetone di Bohr
µ
µB =
eh
= 9.273 ⋅10−24 JT -1
2me
Sono i momenti magnetici ad interagire con un campo magnetico esterno
B0 secondo una nota equazione della fisica classica E = -µ
µ • B0
Effetto Zeeman
Iα>, Iβ>
Sono le autofunzioni di spin per l’elettrone su cui operano gli operatori di spin.
Sz Iα>= +1/2 Iα> Sz Iβ>= -1/2 Iβ>
Traduciamo l’equazione classica.. E = -µe • B0
…in forma operatoriale
(µe = -ge µB S)
Ĥ = + ge µB Sz B0
E = ge µB Sz B0
Hamiltoniano di spin
Applicando Ĥ alle funzioni Iα> e Iβ> si ottiene
Ĥ Iα
α> = +1/2 ge µB B0 Iα
α>
Eα = +1/2 ge µB B0
Ĥ Iβ
β> = -1/2 ge µB B0 Iβ
β>
Eβ = -1/2 ge µB B0
In presenza di un campo magnetico gli stati α e β hanno diversa energia
Effetto Zeeman
Gli stati α e β in un campo magnetico B0 mostrano una differenza di
energia che dipende linearmente da g (2.0023 per un elettrone libero)
e dal valore di B0
z
MS =
1
h
2
x
E
y
α
1
Eα = + gµ B B0
2
∆E = hν
= gµBB0
∆E = g e µ B B0
0
x
β
y
1
MS = − h
2
1
EΒ = − gµ B B0
2
z
B
E’ possibile indurre transizioni tra i due livelli irraggiando il sistema con
una radiazione tale che:
hν = Eα − Eβ = gµ B B0
L’esperimento EPR
L’equazione base dell’EPR hυ = ∆E = g µB B0 suggerisce che la condizione di
risonanza possa essere ricercata giocando su due parametri: la frequenza e il campo
magnetico.
Ragioni tecnologiche spingono ad utilizzare il secondo approccio.
Frequenza costante
Campo variabile
Campo mag. costante
Frequenza variabile
E
E
α
α
0
0
β
β
ν0
ν
B0
B
Lo spettro EPR in onda continua
Lo spettro CW-EPR di un sistema S = ½ senza interazioni di alcun tipo si ottiene irraggiando il
campione in cavità con la microonda selezionata facendo variare con continuità il campo
magnetico in un determinato intervallo.
Frequenza costante
Campo variabile
E
α
0
β
B0
B
Bo
B
Quando si determina la condizione di risonanza hυ
= ∆E = g µB B0 si osserva un assorbimento
registrato in termini di derivata prima del segnale.
E
Saturazione in EPR
0
1/T1
L’assorbimento di
mw A prevale sulla
emissione
stimolata ES
 − gµ β B0 
N +1/ 2

= exp
N −1/ 2
 kT 
. A = ES
SATURAZIONE
(nessun segnale
EPR)
Il trasferimento di energia non
radiativo dal sistema di spin al
reticolo (spin-lattice
relaxation) tende a ristabilire
la differenza di popolazione
A RT e per un campo magnetico di 0.35 T (Banda X) la
differenza tra le due popolazioni è di circa 1/1000
Dipendenza del segnale EPR dalla
potenza delle MW
ω1M 0T2
My =
1 + T22 (ω − ω0 ) 2 + ω12T1T2
ω1 = gµ B B1
Saturazione
B1 ampiezza del campo mw
fattore di saturazione
B1 ∝ Pm w
1,0
0,9
0,8
EPR intensity
ω12T1T2
ω12T1T2 > 1
0,7
ω12T1T2 << 1
0,6
0,5
No saturazione
0,4
0,3
0
20
40
60
80
( Microwave power P )1/2
mw
100
Interazione Zeeman: fattore-g
Spin-orbit coupling
geff ≠ ge
∆E = hν = geffµ BB0
geff µB B0
B
Il tensore g
Il risultato dell’esperimento può essere descritto dal seguente Hamiltoniano
H 0 = µ B B% 0 g S
g è una matrice 3x3 ( o tensore di secondo rango) che modula l’interazione tra il
campo magnetico e lo il momento magnetico associato allo spin
g xx
g yx
g zx
g xy
g yy
g zy
g xz
g yz
g zz
E’ sempre possibile trovare una terna di assi per cui la matrice è diagonale DT
tij= 0 (i≠j) ASSI PRINCIPALI
La diagonalizzazione corrisponde ad una rotazione degli assi:
U T U-1 = DT
gxx
0 0
D
g = 0 gyy 0
0 0 gzz
Anisotropia del fattore g
Dipendenza orientazionale delle righe di risonanza EPR:
gxx=2.0085
.
gyy=2.0065
gzz=2.0027
High field EPR: risoluzione dell’anisotropia di g
Fattori-g di alcuni composti paramagnetici di rilevanza biologica
Flavin semiquinone, ubiquinone,
ascorbate, etc
Nitroxide spin labels and traps
g-value
2.0030 2.0050
2.0020 2.0090
sulphur radicals : S-S, S-H
MoV (in aldehyde oxidase)
Cu2+
Fe3+ (low spin)
Fe3+ (high spin)
2.02 - 2.06
1.94
2.0 - 2.4
1.4 - 3.1
2.0 - 10
•Molecole con un elettrone spaiati in orbitali di atomi leggeri, di tipo
organico o contenenti metalli di transizione della I serie sono
caratterizzati da fattori-g ≅ 2.0023
•Molecole con un elettrone o piu’ elettroni spaiati in orbitali di atomi
pesanti sono caratterizzati da fattori-g che si discostano anche
notevolmente da 2.0023 e da forte anisotropia.
Lo spin dei nuclei
Anche i nuclei hanno momento angolare di spin (I). Ad esso corrisponde un momento
magnetico µN con la stessa direzione e verso di I.
Il numero quantico I relativo allo spin nucleare può assumere valori interi o seminteri
incluso lo zero. Le regole di quantizzazione sono quelle di ogni momento angolare
Per il nucleo d’idrogeno (1H):
I=½
a.n. = 99.985
gN = 5.5856912
µN = 28.212x10-27 JT-1
µ = gNµNI = γNI
r
I
I
Nucleo
0
12C, 16O
½
1H, 13C, 15N, 31P
1
2H, 14N
3/2
23Na, 35Cl, 37Cl, 39K, 41K, 63Cu, 65Cu
5/2
17O, 27Al, 55Mn
In un campo magnetico B0 il
momento magnetico nucleare
assumerà, se I = 1, tre valori
permessi (uno dei quali è zero)
In generale i valori sono 2I+1
14N
99.63% ,
15N
0.366%
Hyperfine interaction
r r
Hˆ = S AI
A = a1 + A'
Electron spin density at nucleus: ISOTROPIC a
a ∝ g e β e g N β N ψ (r = 0 )
2
Dipolar coupling to nucleus: ANISOTROPIC A’
Spettri EPR di un sistema S=1/2, I=1/2 (H)
Hˆ = µ B gBSˆ z − g N µ N BIˆz + aiso Iˆz Sˆ z
Campo
nullo
Zeeman
elettronico
½geµBB
Zeeman
nucleare
½gNµNB0
Accoppiamento
iperfine
a/4
Costante di
accoppiamento iperfine
E1 αe αn
0
-½gNµNB0
≈
½gNµNB0
≈
-a/4
a/4
E2 αe βn
E3
βe βn
B0
BI
-½geµeB0
-½gNµNB0
-a/4
regole di selezione per EPR sono:
E4 βe αn
∆Sz = ± 1 e ∆ Iz = 0
BII
B
L’intensità relativa delle righe spettrali dovute
all’accoppiamento con nuclei con I=1/2 è data dai
coefficienti dello sviluppo binomiale (a+b)n. Per
calcolare questi ultimi si può utilizzare il triangolo di
Tartaglia.
Nuclei (I=1/2)
Equivalenti
Intensità relativa
0
1
1
1
2
1
3
1
4
1
5
1
6
1
7
1
8
9
1
1
8
9
10
35
1
5
15
35
70
126
1
4
20
56
84
3
10
21
1
6
15
28
36
3
5
7
2
4
6
1
6
21
56
126
1
1
7
28
84
1
8
36
1
9
1
k
∏ ( 2n I
k k
+ 1)
n = number of equivalent nuclei
k =1
k = sets
MS
n=4
I = 1/2 (ex.H)
k=1
n=1
I = 1 (ex. N)
k=1
MI
Anisotropic Hyperfine interaction:
H = b S g(W) B
orientational sensitivity of EPR spectra
+ S A(W) I
disorded sample
PROTEINS

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