Diapositiva 1 - Dipartimento di Scienze Mediche Veterinarie

ALMA MATER STUDIORUM-UNIVERSITÀ DI BOLOGNA
DIPARTIMENTO DI SCIENZE MEDICHE VETERINARIE
Sistema Nervoso Enterico
Cane sano vs. Cane con problemi gastro-enterici
Dottoranda: Dott. ssa Martina Asti
Dottorato: Scienze Mediche Veterinarie (Neurologia)
Tutors: Prof. Gandini & Prof. Chiocchetti
INTRODUZIONE
Il Sistema Nervoso Enterico (SNE) è rappresentato da gangli e
plessi localizzati nella parete del tratto gastrointestinale,
dall’esofago allo sfintere anale interno. I neuroni sono organizzati
in due principali plessi nervosi: il plesso mioenterico (MP) e il
plesso sottomucoso (SMP) (Furness, 2006).
Questo progetto si inserisce in un filone di ricerca atto a valutare
le caratteristiche neurochimiche del SNE nel cane. Si è voluto
approfondire le conoscenze valutando le caratteristiche dei
neuroni che lo costituiscono in cani sani e in cani affetti da
patologie gastroenteriche.
OBIETTIVI
Il Progetto di Ricerca è finalizzato a valutare le caratteristiche del SNE di cane. Nello specifico valutare le
normali caratteristiche morfologiche dei neuroni del plesso mioenterico e sottomucoso in diversi tratti
dell’apparato gastroenterico di cani deceduti o soppressi nell’Ospedale Didattico Veterinario del
Dipartimento di Scienze Mediche Veterinarie per patologie non gastroenteriche, utilizzando per l’analisi
anatomica tecniche istologiche “classiche” e tecniche di immunoistochimica su sezioni di tessuto incluse
in paraffina e su criosezioni. Queste tecniche, che permettono di quantificare e caratterizzare
(morfologia, neurochimica, funzione) le principali sotto-popolazioni enteriche, permettono anche una
valutazione comparativa tra soggetti sani e soggetti ammalati.
RISULTATI PRELIMINARI
Le immagini ottenute al microscopio a fluorescenza a seguito di valutazione immunoistochimica permettono di
evidenziare le diverse caratteristiche dei neuroni nel plesso sottomucoso e nel plesso mioenterico dei diversi tratti
indagati. La valutazione morfometrica è stata effettuata, per ora, nel tratto di ILEO dei tre campioni.
3B
3A
1B) ILEO CTR 1 (40x) a livello di plesso
mioenterico è apprezzabile la marcatura delle
fibre nervose SP –IR + dapi (Alexa 594)
4B
4A
4A
FIGURA 4:
4A) ILEO PAT 1 (20x) a livello di plesso
mioenterico è apprezzabile la marcatura delle
fibre nervose CGRP – IR + dapi (FITC)
4B
4B) ILEO CTR 1 (40x) a livello di plesso
mioenterico è apprezzabile la marcatura delle
fibre nervose CGRP – IR + dapi (FITC)
5A
5A
PROGETTO
A tale scopo si prevede di reperire n° 6 cadaveri di cani adulti, di media-grossa taglia, senza distinzione di
sesso e razza, che vengano sottoposti ad autopsia e prelievo dei campioni dal tratto gastrointestinale. Tre
dei candidati sono cani morti o soppressi per patologie non gastroenteriche (questi ci permetteranno di
definire una mappatura di controllo per i neuroni enterici; di contro saranno utilizzati tessuti provenienti
da cani deceduti o soppressi affetti da patologie gastroenteriche. I campioni di tessuto gastrointestinale
delle dimensioni di 3/4 cm, sono stati prelevati in quattro precisi punti: esofago, stomaco, ileo e colon
discendete.
STATO ATTUALE DEL PROGETTO
Ad oggi sono stati selezionati tre candidati definiti cani di CONTROLLO (di cui uno ancora da sottoporre
ad indagine immunoistochimica), privi cioè di affezioni a carico dell’apparato gastroenterico ed un cane
PATOLOGICO, portatore, invece, di alterazioni gastroenteriche (diagnosi di enterite catarrale a seguito di
necroscopia).
FIGURA 3:
1A) ILEO CTR 1 (20x) marcatura di muscolaris
mucosae SP –IR + dapi (Alexa 594)
5B
5B
FIGURA 5:
5A) ILEO CTR 1 (20x) a livello di plesso
mioenterico è apprezzabile la marcatura di
cellule nervose Hu – IR e glia enterica S100-IR +
dapi (FITC + Alexa 594)
5B) ILEO CTR 1 (40x) a livello di plesso
mioenterico è apprezzabile la marcatura di
cellule nervose Hu – IR e glia enterica S100-IR +
dapi (FITC + Alexa 594)
Le seguenti TABELLA 1 e TABELLA 2 riportano la valutazione semiquantitativa della densità dei neuroni e delle fibre
peptidergiche (CGRP e SP), nitrergiche (nNOS) (Berezin et all., 94)e calbindina (CALB) immunoreattive sulla base
della seguente simbologia: - non rilevato, + rilevato in un numero ridotto, ++ in modesto numero, +++ in elevato
numero. La cella vuota sta ad indicare che l’antigene non è stato valutato. Abbreviazioni: plesso mioenterico (MP),
plesso sottomucoso (SMP), muscolatura circolare (CML), muscolatura longitudinale (LML), muscolaris mucosae
(mm), cripte, villi.
TABELLA 1)
TABELLA 2)
ISTOLOGIA
I campioni fissati in Bouin sono stati inclusi in paraffina. Una volta effettuati i tagli, le sezioni di paraffina
sono state sottoposte alla colorazione istologica Tricromica di Masson. Questo tipo di colorazione è stata
effettuata per avere un’idea generale sui vari strati che costituiscono i diversi tratti dell’apparato
gastroenterico e poter effettuare una misurazione dello spessore degli stessi ai fini comparativi
(sopprattutto della strato della componente muscolare).
1A
1B
1A) ILEO CTR1 (2.5x). Panoramica a tutto spessore di ileo.
1B) ILEO CTR 2(10x). Dettaglio di ganglio nervoso nel plesso
mioenterico di ileo.
2A
2B
2C
È stata eseguita la conta totale dei neuroni ileali HU/Calbindina, Hu/CGRP, Hu/VIP positivi sia nei soggetti controllo
che nel patologico, rispettivamente nel plesso mioenterico e sottomucoso (utilizzando l’obiettivo 40x del
microscopio a fluorescenza) su campi contigui per tutta la lunghezza del campione. La percentuale dei neuroni
marcati è di seguito rappresentata con due istogrammi.
2A) COLON D. CTR1 (2.5x). Panoramica a tutto spessore di Colon Discendente
2B) COLON D. CTR2 (5x). Dettaglio di plesso sottomucoso, tonaca muscolare circolare, plesso mioenterico,tonaca
muscolare longitudinale e tonaca sierosa di Colon Discendente
2C) COLON D. CTR2 (10x). Dettaglio di ganglio nervoso nel plesso mioenterico di Colon Discendente.
IMMUNOISTOCHIMICA
Gli anticorpi primari che sono stati utilizzati per la valutazione immunoistochimica vengono riassunti
nella tabella sottostante con relativo riferimento della casa produttrice e della diluizione utilizzata.
Il giorno successivo i campioni sono stati sottoposti a incubazione di tre ore in camera umida a
temperatura ambiente nell’ Anticorpo Secondario. Gli Anticorpi Secondari utilizzati sono riportanti di
seguito.
Dopo le tre ore di incubazione e i successivi lavaggi ogni campione è stato coperto con vetrino coprioggetto usando buffer glycerol e sottoposto alla valutazione con microscopio a fluorescenza e alla
valutazione quantitativa.
E’ evidente come la percentuale dei neuroni del plesso mioenterico Hu/Calbindina immunoreattivi sia
sovrapponibile, mentre, la stessa marcatura sia notevolmente ridotta a livello di plesso sottomucoso nel gruppo
patologico. La marcatura Hu/CGRP evidenzia in entrambi i plessi una netta riduzione nel gruppo patologico rispetto
al controllo, con assenza di marcatura dei neuroni CGRP positivi a livello del plesso mioenterico. Studi inerenti al
ruolo dei neuroni CGRP positivi (Chiocchetti et all., 2006) sulle funzioni dello stesso sul SNE, tra cui il controllo
della motilità gastrointestinale e della microcircolazione intestinale, rende questa valutazione estremamente
interessante. Per quanto riguarda la marcatura Hu/Vip si evidenzia una maggiore reattività del plesso mienterico
nel gruppo patologico rispetto al sottomucoso dove vi è maggiore reattività, di contro, nei soggetti controllo.
L’aumento del peptide vasoattivo intestinale (VIP) è un dato altrettanto interessante da comparare con ulteriori
approfondimenti su cani patologici. Questo peptide è implicato infatti nell’inibizione della muscolatura circolare
(Wang et all.,1997; Lars Ny et all., 1997).
OBIETTIVI FUTURI DEL PROGETTO
-Provare la reattività neuronale utilizzando altri anticorpi primari come nNOS (diventano nNOS reattivi i neuroni
nitrergici) (Larysa et all., 1994); SP (utilizzata su un unico animale controllo); S100, la cui marcatura è già stata
verificata in un campione controllo e verrà perciò estesa anche a tutti gli altri campioni; GFAP che permette di
marcare la glia enterica.
-Estendere la valutazione morfometrica anche ai tratti Esofago, Piloro e C. Discendente così da ottenere una
comparazione quali e quantitativa dei neuroni nei diversi tratti dello stesso campione e comparare poi ogni tratto
tra campioni differenti.
-Reperire altri candidati patologici.
BIBLIOGRAFIA
•Berezin et all. (1994) Ultrastructural localization of nitric oxide synthase in canine small intestine and colon.
•Chiocchetti et all. (2006) Extrinsic and intrinsic sources of cgrp IR in the lamb ileum:morphometric and neurochemical investigation.
•Furness (2006) The Enteric Nervous System.
•Larysa et all. (1994) Nitric Oxide (NO) Inhibits Release of Acetylcholine from Nerves of Isolated Circular Muscle of the Canine Ileum: Relationship to Motility and Release of Nitric Oxide1.
•Lars Ny et all. (1997) Morphological relations between haem oxygenases, NO-synthase and VIP in the canine and feline gastrointestinal tracts.
•Wang et all. (1997) Colocalization of Inhibitory Mediators, NO, VIP and Galanin, in Canine Enteric Nerves..

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