nir e uv-vis per la determinazione del grado di

APPLICAZIONE IN CAMPO DI STRUMENTAZIONE PORTATILE FTNIR E UV-VIS PER LA DETERMINAZIONE DEL GRADO DI
MATURAZIONE DI FRUTTI CLIMATERICI
Elisa Bertone*, Marianna Calderara*, Alessandro Giraudo*, Alberto Venturello*, Francesco
Geobaldo*
* Dipartimento di Scienza Applicata e Tecnologia, Politecnico di Torino, Corso Duca degli Abruzzi, 24 – 10129 Torino
Riassunto
La scelta della data di raccolta influisce profondamente sulla qualità finale dei frutti climaterici. Lo
scopo di questo lavoro è quello di stimare il momento ottimale per la raccolta attraverso il
monitoraggio del grado di maturazione dei frutti, effettuato direttamente sull’albero grazie alla
messa a punto di strumentazione portatile. E’ stato preso in esame il melo (cv Gala e Fuji), frutto
particolarmente importante per l’industria agro-alimentare del Piemonte; per il monitoraggio in
campo sono stati utilizzati due spettrofotometri portatili, il primo nel range del vicino infrarosso, il
secondo nel range UV-Vis-NIR. La tecnica NIR associata alla chemiometria (è stato usato
l’algoritmo PLS) ha permesso di elaborare modelli predittivi per stimare il contenuto di diversi
parametri convenzionali: si ottiene per la varietà Gala un RMSECV di 0.37 Indice Lugol per il
contenuto di amido, 0.31 kg/cm2 per la durezza e 0.17 °Brix per il contenuto di solidi totali. Il
metodo UV-Vis ha consentito invece di misurare il contenuto di clorofilla, marker di maturazione,
nella buccia dei frutti durante tutto il periodo di sviluppo dei frutti. Attraverso l'integrazione dei
risultati ottenuti dalla misura dei parametri qualitativi e della clorofilla è stato possibile sviluppare
un metodo non distruttivo e applicabile direttamente in campo per la determinazione della data di
raccolta ottimale delle mele, applicabile anche ad altri frutti climaterici.
Introduzione
Per garantire lo sviluppo ottimale delle proprietà organolettiche di un frutto climaterico al momento
del consumo, lo stacco del frutto deve avvenire durante una specifica fase della maturazione (il
cosiddetto minimo climaterico, legato alla diminuzione del contenuto di etilene). In generale, più il
frutto rimane sulla pianta, migliore è il gusto finale. Infatti, al procedere della maturazione, le
proprietà sensoriali si evolvono: il contenuto di zuccheri e di componenti aromatiche aumenta,
mentre gli acidi totali diminuiscono. Nonostante ciò, i frutti vengono solitamente raccolti in una
fase iniziale di maturazione, per evitare che la movimentazione causi danni sulla superficie del
prodotto, a causa della polpa troppo morbida. Se la raccolta avviene troppo presto però vi è il
rischio che i frutti restino acerbi e non raggiungano lo stadio di maturazione ottimale.
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La data di raccolta viene generalmente determinata sulla base di indicatori quali il trend climatico,
l’esperienza del coltivatore e utilizzando alcuni indici di maturazione (durezza, contenuto di amido,
di solidi totali e di clorofilla). Questi indici si basano su metodi distruttivi, spesso non
rappresentativi della variabilità all'interno del lotto e, soprattutto, non consentono di monitorare i
cambiamenti fisiologici sugli stessi campioni durante l'intero periodo di maturazione.
Recentemente sono stati messi a punto diversi metodi spettroscopici nel range dell’UV-Vis e NIR
per l’analisi di parametri qualitativi di prodotti ortofrutticoli, metodi che hanno il vantaggio di
essere veloci e non distruttivi [1]; particolarmente interessante risulta l’applicazione di
strumentazione portatile in questi intervalli spettrali [2]. In queste applicazioni la spettroscopia UVVis viene usata per l’analisi di specifiche bande di assorbimento legate a pigmenti presenti nella
buccia dei frutti, come la clorofilla, mentre la tecnologia NIR risulta utile per l’elaborazione di
modelli di regressione multivariati per la predizione del contenuto di diversi parametri di qualità [34]. Questo lavoro è focalizzato sull'applicazione in campo della spettroscopia UV-Vis e NIR, in
modalità di riflettanza diffusa e utilizzando strumentazione portatile al fine di monitorare il grado di
maturazione dei frutti direttamente sull’albero. In parallelo vengono eseguite le misure distruttive
per i parametri convenzionali e questi valori correlati agli spettri NIR attraverso un’elaborazione dei
dati multivariata.
Materiali e Metodi
Questo lavoro è stato svolto presso i frutteti sperimentali del CReSO (Centro Ricerche per la
Frutticoltura, Manta di Saluzzo, CN, Italia). La sperimentazione ha riguardato principalmente il
melo, cultivar Gala. La scelta di tale frutto è motivata sia da logiche economico-geografiche (in
quanto il melo è un frutto importante per l’industria agricolo-alimentare del Piemonte) che per le
sue caratteristiche di maturazione, di tipo scalare, con periodo di raccolta dalla metà di agosto. Oltre
al melo sono stati esaminati altri tipi di frutti climaterici, in particolare il pesco e l’albicocco, e il
melo cv Fuji; il numero esiguo di campioni analizzati non ha consentito di ottenere un modello
statisticamente significativo per questi frutti. La sperimentazione ha riguardato gli anni 2011 e
2012; le misure sono state eseguite durante l’intero periodo di maturazione. Il calendario dei rilievi
ha previsto 6 sessioni di misura per il raccolto 2011 e 5 sessioni per l’anno 2012, organizzate
rispetto alla data di raccolta stimata dal coltivatore. Per ogni rilievo tutti i campioni scelti sono stati
sottoposti ad analisi non distruttive di tipo spettroscopico; i medesimi frutti sono poi stati utilizzati
per la determinazione dei parametri distruttivi (durezza della polpa, residuo secco rifrattometrico –
TSSC-, contenuto di amido e di clorofilla [5]). Per il monitoraggio in campo dei frutti sono stati
utilizzati due strumenti portatili: il primo è uno spettrofotometro NIR (prototipo Bruker Optics,
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Ettlingen, Germania, Figura 1a), il secondo uno spettrofotometro nel range UV-Vis-NIR (Jaz,
Ocean Optics, Dunedin, USA, Figura 1b).
a)
b)
Figura 1 – Strumentazione portatile utilizzata per le misure in campo a) Spettrofotometro NIR; b) spettrofotometro Jaz
nel range UV-Vis-NIR
I campioni del raccolto 2011 sono stati esaminati con lo strumento portatile Jaz e con uno
spettrofotometro NIR fisso (MPA, Bruker Optics, Ettlingen, Germania), mentre i rilievi del 2012
sono stati eseguiti con i due strumenti portatili. Questi dispositivi sono stati utilizzati in modalità di
riflettanza diffusa, mediante una sfera di integrazione e utilizzando una fibra ottica. Per le misure in
campo i parametri strumentali sono stati settati in modo da far fronte all’intensa luminosità presente
durante la stagione estiva. Lo spettrometro portatile NIR è stata gestito mediante un tablet
(IconiaTab, Acer Inc., Taiwan) appositamente predisposto. La messa a punto dei parametri
strumentali, l’acquisizione degli spettri ed il trattamento dei dati sono stati effettuati mediante il
software OPUS (Bruker Optics, Ettlingen, Germania); gli spettri NIR sono stati acquisiti in triplo
nel range 4000-12000 cm-1. Sugli spettri sono stati provati diversi pretrattamenti ed è stata applicata
una selezione delle variabili spettrali, identificando i migliori risultati in termini di RMSECV. E’
stato poi applicato l’algoritmo PLS per ogni parametro di qualità misurato con metodo distruttivo:
contenuto di amido, contenuto dei solidi solubili e durezza. I modelli ottenuti con algoritmo PLS
sono stati validati utilizzando una cross validazione con 5 gruppi di cancellazione.
La misura con lo spettrofotometro UV-Vis-NIR Jaz ha previsto tre ripetizioni per ogni campione;
ogni spettro è stato ottenuto mediando 20 acquisizioni. Il range di acquisizione è stato impostato tra
400 e 1000 nm, e il tempo di integrazione a 1000 s. Il trattamento dei dati è stato effettuato
mediante il software Origin (OriginLab, V 8.0, Northampton, USA). I valori di altezza del picco di
assorbimento della colorofilla sono stati esaminati a 678 nm. Il pre-trattamento dei dati ha previsto
la conversione degli spettri mediante la funzione di Kubelka-Munk: l’intensità del segnale dopo
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trasformazione con questa funzione risulta infatti legata direttamente al contenuto dell’analita [5].
La quantificazione del pigmento è stata ottenuta dallo spettro grazie alla correlazione con una
taratura precedentemente realizzata utilizzando due standard di clorofilla (chl a e chl b, Sigma
Aldrich, St. Louis, USA) e un test set di frutti a diverso grado di maturazione. I metodi di
estrazione, concentrazione e quantificazione con analisi HPLC (LC 920, Agilent Technologies,
Santa Clara, USA), sono l’adattamento di metodi presenti in letteratura [6].
Risultati e Discussione
Sugli spettri NIR è stata eseguita la selezione delle variabili spettrali (range selezionati: per amido
9411-7498 cm-1 e 6109-5770 cm-1, per TSSC 9411-7498 cm-1 e 6109-5770 cm-1, per durezza 75135446 cm-1) e il pretrattamento degli spettri (normalizzazione Min-Max), ed è stato poi applicato
l’algoritmo PLS per la creazione di tre diversi modelli di regressione multivariata. Gli spettri NIR
vengono così correlati ai rispettivi valori determinati con analisi distruttive; su questi modelli è stata
poi effettuata una validazione (cross validation).
Figura 2 – Grafici dei valori predetti vs. misurati ottenuti dai modelli PLS dei parametri qualitativi (Gala, rilievi 2012)
a) Contenuto di amido; b) Contenuto di solidi solubili totali; c) Durezza
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La Figura 2 riporta i grafici dei valori misurati vs. predetti per il contenuto di amido (Figura 2a), per
il contenuto di solidi solubili totali (Figura 2b) e per la durezza (Figura 2c). Si osserva per tutti i
modelli un esiguo numero di campioni outliers (in rosso). Si ottiene un errore RMSECV di 0.37
Indice Lugol (amido), 0.31 kg/cm2 (durezza) e 0.17 °Brix (TSS); questi errori sono confrontabili
con quelli ottenuti mediante strumentazione fissa e consentono di misurare i parametri qualitativi in
esame con una certa accuratezza. Per aumentare la significatività statistica risulterebbe necessario
ampliare il dataset con nuovi rilievi, anche al fine di esaminare la robustezza dei modelli rispetto a
diverse annate di raccolto.
A partire dagli spettri UV-Vis-NIR è stato quantificato, mediante le apposite rette di taratura, il
contenuto di clorofilla nella buccia dei frutti durante tutto il periodo di maturazione. La Figura 3
mostra l’andamento del contenuto di clorofilla a per i rilievi dell’anno 2012 sulle mele Gala.
Figura 3 – Andamento del contenuto di clorofilla a, mele Gala, rilievi anno 2012
Si osserva una diminuzione del contenuto di clorofilla nel tempo, in linea con i dati di letteratura;
questo trend si osserva per tutti le tipologie di frutti analizzati, evidenziando come il metodo risulta
adatto a monitorare in modo non distruttivo il contenuto del marker clorofilla nella buccia dei frutti
durante l’intero periodo di maturazione, attraverso un monitoraggio in campo con strumentazione
portatile. Questi risultati sono poi stati infine comparati con i dati delle altre prove distruttive:
l’amido segue un andamento decrescente, in linea con la degradazione, così come la clorofilla; la
durezza mostra un trend decrescente, mentre la quantità di zuccheri aumenta nel tempo.
Conclusioni
Questo lavoro mira a valutare la fattibilità dell’utilizzo in campo di strumentazione spettroscopica
portatile nel range dell’UV-Vis e NIR come metodo non distruttivo per il monitoraggio del grado di
5
maturazione di frutti climaterici. Tale approccio è stato utilizzato in particolare sul melo, cv Gala e
ha riguardato due diverse annate di raccolto. Il metodo UV-Vis ha permesso di monitorare il
contenuto della clorofilla (marker di maturazione) nella buccia dei frutti durante l'intero processo di
maturazione. La spettroscopia NIR associata alla chemiometria ha consentito di elaborare modelli
predittivi per i parametri di maturazione convenzionali quali durezza, quantità di zuccheri e
degradazione dell’amido; questi modelli hanno mostrato buone performance in cross validazione.
L’integrazione tra i dati relativi al contenuto di clorofilla, ottenuti mediante spettri UV-Vis, e i dati
NIR correlati ai dati delle prove distruttive, è stato molto incoraggiante: è stato infatti ottenuto un
metodo non distruttivo e applicabile direttamente sull’albero, utile per la misura del tempo di
raccolta ottimale delle mele e di altri frutti climaterici, seppur con i limiti e le criticità che uno
strumento da campo può presentare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato realizzato nell’ambito del Progetto SAFEFOOD CONTROL (Sviluppo Di
Sistemi E Tecnologie Innovative Per La Produzione, Conservazione, Trasformazione E
Valorizzazione Dell’orto-Frutticoltura Piemontese Di Qualità) della Piattaforma Agrolimentare. La
sperimentazione è stata realizzata presso i frutteti sperimentali del CReSO (Manta di Saluzzo, CN,
Italia).
Bibliografia
[1] E. Mehinagic et al., 2003. Relationship between sensory analysis, penetrometry and visible–NIR
spectroscopy of apples belonging to different cultivars. Food Qual. Prefer. 14, 473-484.
[2] J. Nyasordzi et al., 2013. Utilizing the IAD index to determine internal quality attributes of
apples at harvest and after storage. Postharvest Biol. Technol. 77, 80-86.
[3] A.E. Solovchenko et al., 2005. Relationships between chlorophyll and carotenoid pigments
during on- and off-tree ripening of apple fruit as revealed non-destructively with reflectance
spectroscopy. Postharvest Biol. Technol. 38, 9-17.
[4] E. Bertone et al., 2012. Prediction of the optimum harvest time of 'Scarlet' apples using DR-UVVis and NIR spectroscopy, Postharv. Biol. Technol. 69, 15-23.
[5] A. Venturello et al., 2012. Fast non-destructive determination of chlorophylls in apple skin, Ital.
J. Food Sci. 24, 168-172.
[6] M. Edelenbos et. al., 2001. HPLC Determination of Chlorophyll and Carotenoid Pigments in
Processed Green Pea Cultivars (Pisum sativum L.), J. Agric. Food Chem. 49, 4768-4774.
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