Effetti di flavonoidi estratti da pastazzo di

ESSENZE DERIVATI AGRUMARI
Ess. Deriv. Agr., 74, 3-10 (2004)
Pubblicato dalla Stazione Sperimentale per l’Industria delle Essenze e dei Derivati dagli Agrumi (www.ssea.it)
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Effetti di flavonoidi estratti da pastazzo di bergamotto sul
metabolismo del Fattore di Attivazione Piastrinico (PAF)
Maria Luisa Balestrieri, Ciro Balestrieri, Francesca Felice, Davide Palma, Luigi Servillo
Dipartimento di Biochimica e Biofisica "F. Cedrangolo", Seconda Università di Napoli
Domenico Cautela, Castrese Esposito, Domenico Castaldo
Stazione Sperimentale per l’Industria delle Essenze e Derivati Agrumari, via Gen. Tommasini, 2 - 89127 Reggio Calabria, Italy
RIASSUNTO
ABSTRACT
Sono stati analizzati mediante analisi HPLC gli estratti idroalcolici dei flavonoidi glucosidici da pastazzo di bergamotto. I flavonoidi sono stati
identificati sulla base dei tempi di ritenzione e quantificati per comparazione delle aree dei picchi con quelle dei relativi standard. I principali flavonoidi presenti negli estratti di bergamotto sono: neoeriocitrina, eriocitrina, esperidina, neoesperidina e naringina.
Gli estratti idroalcolici dei flavonoidi hanno dimostrato un coinvolgimento nella attività degli enzimi coinvolti nel PAF in culture cellulari di
cellule endoteliali. In particolare è risultato che i flavonoidi estratti da
pastazzo di bergamotto modulano l'attività TAL della PAF-lisofosfolipid
Transacetilasi (TA) favorendo così la sintesi di acil-PAF.
Per quanto riguarda le attività AH e TAS della TA i nostri risultati hanno
mostrato che entrambe le attività AH e TAS non sono indotte in cellule
endoteliali né da stress ossidativo né da pretrattamento con flavonoidi
indicando così che queste due vie di protezione non sono probabilmente
attivate. Inoltre, i flavonoidi di pastazzo di bergamotto inibiscono l'attività dell'acetil-CoA liso-PAF acetiltransferasi (AT), l'enzima chiave responsabile della biosintesi del PAF. L'azione antinfiammatoria dei flavonoidi
sembra dovuta ad un meccanismo concertato coinvolgente sia la riduzione della sintesi del PAF che un incremento della sua utilizzazione la quale,
in definitiva, porta alla sintesi del meno attivo acil-PAF.
HPLC analysis of flavonoids in the hydroalcoholic extracts of Bergamot
pastazzo is reported. Flavonoids were identified on the basis of retention
times and quantified from the peak areas compared to standards. The most
represented flavonoids in the Bergamot pastazzo were found to be: neoeriocitrin, eriocitrin, hesperidin, neohesperidin, naringin. The whole flavonoid extract was demonstrated to modulate the activities of enzymes
involved in Platelet Activating Factor (PAF) in cultured endothelial cells.
In particular the TAL activity of the PAF-lysophospholipids transacetylase (TA), which favours acil-PAF synthesis, resulted more affected. As for
AH and TAS activities of TA, our results showed that both these activities
are induced in endothelial cell neither by oxidative stress nor by pretreatment with flavonoids, thus indicating that probably these two protection
ways are not involved. Moreover, we have also confirmed that flavonoids
from Bergamot pastazzo inhibit the activity of the acetyl-CoA lyso-PAF
acetyltransferase (AT), the key enzyme responsible for PAF biosythesis.
Therefore, it seems that the anti-inflammatory action of flavonoids occurs
through concerted mechanisms which encompass both a reduced PAF
synthesis and an increased PAF utilization that leads to the synthesis of the
less active acyl-PAF.
Parole chiave: Pastazzo di Bergamotto; flavonoidi; Fattore di Attivazione
Piastrinico (PAF); attività antinfiammatoria.
Keywords: Bergamot pastazzo; flavonoids; Platelet Activating Factor
(PAF); anti-inflammatory action.
INTRODUZIONE
coronarici nelle donne in post menopausa (Yochum et
al., 1999).
I principali responsabili dei danni cellulari in seguito a stress ossidativo sono le specie reattive dell'ossigeno (ROS), prodotte per effetto dello stesso metabolismo cellulare e capaci di ossidare proteine, acidi
nucleici e lipidi. Le ROS contribuiscono all'invecchiamento cellulare (Sastre et al., 2000), alla mutagenesi (Takabe et al., 2001), alla carcinogenesi
(Kawanishi et al., 2001) e all'instaurarsi di malattie
coronariche (Khan et al., 2000).
Gli effetti protettivi dei flavonoidi nei sistemi biologici derivano dalla loro capacità di trasferire elettroni, chelare ioni metallici che catalizzano reazioni
di ossidazione (Ferrali et al., 1997) e attivare enzimi
antiossidanti (Elliott et al., 1992). Lo scopo del presente lavoro è stato quello di valutare, in cellule
endoteliali sottoposte a stress ossidativo, l'effetto dei
flavonoidi sul metabolismo del PAF (Platelet
Activating Factor), un potente mediatore dei processi infiammatori. Data la loro localizzazione nella
parete vasale sanguigna all'interfaccia del sistema
vascolare, le cellule endoteliali sono nel tempo espo-
I flavonoidi sono un'ampia classe di sostanze naturali a basso peso molecolare caratterizzate dalla presenza nella loro struttura di un nucleo flavonico.
Attualmente sono stati isolati e caratterizzati alcune
migliaia di flavonoidi da fonti naturali, che comprendono essenzialmente vegetali, nei quali tali composti
hanno funzioni protettive di vario tipo (Harborne et
al., 2000). Un notevole interesse è suscitato poi dai
diidrocalconi, ottenuti per idrogenazione catalitica
della naringina e della neoesperidina, principali flavonoidi glucosidici presenti nel bergamotto, per il
potere edulcorante rispettivamente pari a 300 e 1100
volte quello del saccarosio (Di Giacomo et al.,1991).
Grazie alla loro capacità di inibire l'ossidazione delle
lipoproteine a bassa densità (LDL), i flavonoidi
hanno rivelato effetti cardioprotettivi peculiari
(Kondo et al., 1996; Mazur et al., 1999). Diete ricche
in flavonoidi riducono il danno miocardico postischemico nei ratti (Facino et al., 1999), il danno
coronarico e l'incidenza dell'infarto in uomini d'età
avanzata (Hertog et al., 1993) e il rischio di danni
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M.L. BALESTRIERI ET AL. / Ess. Deriv. Agr., 74, 3-10 (2004)
ste ai perossidi e alle lipoproteine ossidate come, ad
esempio, nel corso di una reazione infiammatoria
locale. Al sito d'infiammazione l'H2O2 generata dai
neutrofili attivati modula il processo infiammatorio
aumentando l'espressione delle molecole di adesione,
controllando la proliferazione cellulare o l'apoptosi e
modulando l'aggregazione piastrinica. In più, la produzione di H2O2 gioca un ruolo chiave nella patogenesi dell'aterosclerosi, modificando le LDL e aumentando la loro aterogenicità. Lo stato redox cellulare
omeostatico rappresenta il primo meccanismo di
difesa antiossidante che protegge la cellula da incrementi dei livelli di ROS nel tessuto vascolare, ma
anche sostanze antiossidanti naturali, come appunto i
flavonoidi, possono svolgere un importante ruolo
nella prevenzione di patologie aterosclerotiche e
infiammatorie dipendenti da condizioni di aumentato
stress ossidativo.
I flavonoidi, infatti, sono una delle classi di antiossidanti naturali più studiate per le loro proprietà antiinfiammatorie e anti-aterosclerotiche. Diversi studi
hanno dimostrato che essi inibiscono l'espressione di
molecole di adesione in cellule endoteliali bloccando,
in tal modo, l'adesione di monociti all'endotelio
vascolare e il loro successivo trasferimento all'interno
della parete arteriosa. Numerosi dati sperimentali
hanno dimostrato che i flavonoidi agiscono anche su
sistemi enzimatici implicati nell'inizio e nel mantenimento della risposta infiammatoria, tra i quali, principalmente, quelli coinvolti nel metabolismo del PAF,
come l'attività acetiltransferasica (AT) e la fosfolipasi
A2 (PLA2). Inoltre l'addizione di flavonoidi a cellule
endoteliali incubate con LDL ossidate, attenua l'effetto citotossico di queste lipoproteine modificate.
Inoltre è stato da noi recentemente riportato che flavonoidi quali la naringina e l'esperidina espletano la
loro azione antinfiammatoria anche attraverso la
modulazione del metabolismo del PAF e di suoi analoghi acilici, bloccando la biosintesi di questo potente mediatore dell'infiammazione (inibizione dell'attività AT) e favorendo la biosintesi di acil-PAF mediante l'induzione di una delle attività della Transacetilasi
PAF-dipendente CoA-indipendente (TA) e, specificamente, quella che utilizza i lisofosfolipidi come substrato accettore di acetile (attività TAL) (Balestrieri et
al., 2003).
Alla luce di ciò, lo scopo del nostro lavoro è stato
quello di mettere a punto una metodica rapida e con
alta resa per poter estrarre i flavonoidi dal pastazzo di
bergamotto e verificare le proprietà antinfiammatorie
di tale estratto andando a valutare il loro effetto sul
metabolismo del PAF e dell’acil-PAF in cellule endoteliali durante stress ossidativo.
MATERIALI E METODI
I flavonoidi utilizzati per gli esperimenti sono stati
estratti da pastazzo di bergamotto proveniente dalla
campagna agrumaria 2002-2003. Il pastazzo è stato
cubettato a 1 cm3 di dimensione e suddiviso in aliquote di 2 Kg subito congelale e conservate a -28 °C.
Su ciascuna aliquota, dopo scongelamento, veniva
determinato il residuo secco medio secondo il metodo
MUACV. E' stata utilizzata per l'estrazione della frazione flavonica una miscela estraente costituita da
etanolo:acqua (70:30) con rapporto 1:10
pastazzo:miscela estraente, in contenitori a chiusura
ermetica, sotto agitazione per 24 ore a temperatura
ambiente. Gli estratti idroalcolici sono stati infine
opportunamente filtrati e portati a secco con evaporatore rotante. I flavonoidi glucosidici dell'estratto sono
stati caratterizzati quali-quantitativamente e il contenuto in eriocitrina, neoeriocitrina, naringina, esperidina e neoesperidina, che rappresentano pressoché la
totalità dei flavonoidi nell'estratto, è stato determinato
mediante analisi HPLC utilizzando un cromatografo
capillare mod. Surveyor (ThermoFinnigan). PAF,
GSH, acido 5-solfosalicilico, glutatione reduttasi, i
flavonoidi usati come standard, perossido di idrogeno, acetil-CoA, fosfolipasi C tipo XI dal Bacillus
Cereus, anidride benzoica, DMSO, sono stati ottenuti
dalla Sigma-Aldrich (Italia). [H3]-acetil-PAF (13.5
Ci/mmol) e [H3]-acetil-CoA (1.54 Ci/mmol) sono
stati forniti da NEN Life Science Products (Belgio).
Tutti i reagenti per le colture cellulari sono stati acquistati presso la Life Technologies (Milano), compresi i
fosfolipidi, la cui purezza è stata determinata mediante TLC e soltanto quelli con una purezza superiore al
95% sono stati usati nei nostri esperimenti.
Colture cellulari
Il lavoro è stato svolto su cellule endoteliali ottenute da arteria polmonare bovina (CPAE, American
Type Culture Collection, CCL 209). Monostrati di
cellule (passaggio tra il 19 e il 25) sono state coltivate in fiasche da 75 cm2 contenente mezzo MEM al
20% di FBS. Solo i monostrati subconfluenti e al
passaggio indicati sono stati utilizzati per i nostri
esperimenti al fine di evitare che le cellule siano sottoposte a probabili modificazioni metaboliche passaggio-dipendenti. Lo strato subconfluente è stato
preparato il giorno prima ogni esperimento piastrando cellule endoteliali in Petri da 100 mm ad una densità di 5 x 106 cellule/piastra. Una volta raggiunta una
condizione di subconfluenza stabile, le cellule sono
pronte per il trattamento. Dopo aver lavato 2 volte il
monostrato cellulare con 5 mL HBSS-10 mM
HEPES, le cellule sono state incubate per 10 min con
H2O2 in mezzo senza siero ad una concentrazione
finale di 1mM. E' stata utilizzata H2O2 al 30% w/w e
le appropriate diluizioni venivano effettuate in
mezzo senza siero per evitare la rapida degradazione
dell'H2O2, da parte di antiossidanti presenti nel siero.
I flavonoidi (25 M in DMSO) sono stati utilizzati
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per pretrattare le cellule a 37°C per 1h prima della
stimolazione con H2O2. Alla fine della preincubazione, il mezzo di coltura è stato rimosso e le cellule
sono state lavate due volte con 5 mL HBSS-10mM
HEPES, allo scopo di evitare la possibilità di una
interazione diretta tra H2O2 e i flavonoidi al di fuori
dell'ambiente cellulare.
Determinazione delle attività enzimatiche
Gli omogenati cellulari per la determinazione delle
tre attività enzimatiche della transacetilasi PAFdipendente CoA-indipendente (attività TAL, TAS e
AH), sono stati preparati grattando le cellule dalla
superficie delle fiasche in 2 mL di tampone di omogenizzazione costituito da saccarosio 0.25 M, TrisHCl (pH 7.3) 100mM, leupeptina 1 g/mL, DTT
(ditiotreitolo) 1mM. Le sospensioni cellulari sono
state successivamente omogenizzate mediante sonicazione 5 volte per 15 secondi in ghiaccio con intervalli di 20 secondi (sonicatore W-375, Ultrasonic,
Inc., 30 % di potenza). La concentrazione proteica
degli omogenati cellulari è stata determinata con il
metodo di Lowry. L'attività di trasferimento da parte
della TA del gruppo acetile verso un lisofosfolipide
accettore (attività TAL ) è stata saggiata in una miscela di incubazione preparata utilizzando i seguenti reagenti: 1-O esadecil-2-[H3]-acetil-GPC(0.15mCi) 50
M, lisoplasmalogeno sospeso in 0.1 % di albumina
di siero bovino (BSA)-salina, tris-HCl (pH 7.4)
100mM, sodio acetato 2mM, e EDTA 10mM in un
volume finale di 125 L. L'incubazione, come di routine, è stata effettuata a 37 °C per 15 min e i lipidi
sono stati estratti con il metodo di Bligh e Dyer
(1959), eccetto il fatto che il metanolo conteneva il
2% di acido acetico. I lipidi estratti sono stati separati mediante TLC utilizzando un sistema di solventi
costituito
da
CHCl3/CH3OH/CH3COOH/H2O
(50:25:8:4, v/v/v/v). La radioattività delle aree corrispondenti al PAF e all' alchenil-acetil-GPE sono state
determinate mediante scintillazione in fase liquida.
L'attività di trasferimento da parte della TA del
gruppo acetile verso la sfingosina, che funge da accettore (attività TAS ) procede, per quanto riguarda il
saggio, in modo simile a quello visto per la TAL, salvo
alcune modifiche. La miscela di incubazione contiene: 1-O esadecil-2-[H3]-acetil-GPC (0.15Ci), 15
M, sfingosina sospesa in BSA allo stesso rapporto
molare, Tris-HCl (pH 7.4) 100mM, sodio acetato
2mM, e EDTA 10mM in un volume finale di 125 L.
Le incubazioni sono state condotte alla temperatura di
37 °C per 30 o 60 min. Dopo la loro estrazione, i lipidi sono stati separati mediante TLC utilizzando, questa volta, un sistema di solventi costituito da
CHCl3/CH3OH (90:10, v/v) e la radioattività delle
aree corrispondenti al PAF e al C2-Ceramide sono
state valutate come citato precedentemente.
L' attività PAF-acetilidrolasica (attività AH) è stata
determinata in omogenati cellulari, preparando la
miscela di incubazione in tubi di polipropilene secondo la metodica descritta da Lee et al. (1994) come
5
segue: 20 M esadecil-[3H]acetil-GPC (0.1 Ci ),
1mM EDTA, 100 mM tampone fosfato (pH 8.0),
50g di proteine di omogenato cellulare in un volume
finale di 0.5mL per 10 e 20 min at 37°C. Le incubazioni sono state interrotte mediante aggiunta di 1 mL
di cloroformio, 1mL metanolo, e 0.5 mL di una soluzione al 10% di sodio bicarbonato preparata al
momento. Dopo l' estrazione iniziale, la fase acquosa
superiore è stata recuperata e lavata 3 volte con 1mL
di cloroformio.
La quantità di [ 3H]acetile liberato per azione
dell' enzima è stata determinata su 0.8 mL della
fase acquosa mediante scintillazione in fase liquida. L' attività enzimatica è stata espressa come
picomoli di [ 3H]acetile prodotte al minuto/mg di
proteine nell' omogenato cellulare (pmol/min/ mg
prot).
Il saggio enzimatico per determinare l'attività acetilCoA acetiltrasferasica (attività AT) è stato realizzato
mediante preparazione della seguente miscela di
incubazione: 500 M [3H]acetil-CoA (0.2 Ci), 50
M lisoPAF in 3.3% di BSA salina, 100 mM Tris-HCl
(pH 7.2) e 100 g di proteine di omogenato cellulare
in volume finale di 0.5 mL. La miscela è stata incubata a 37 °C per 15 minuti e i prodotti della reazione
enzimatica, estratti dalla miscela di incubazione
secondo il metodo Bligh e Dyer (1959), sono stati
separati mediante TLC con lastre di silice di tipo H
utilizzando come solvente cloroformio: metanolo:
ammoniaca e acqua (60:35:8:2.3 v/v/v/v). L' attività
enzimatica specifica è stata espressa come nanomoli
di 1-palmitoil-2-[3H]acetil-GPC prodotte al min/mg
di proteina presente nell' omogenato cellulare
(nmol/min/mg prot).
Determinazione dell'efficienza di trasferimento
del gruppo [3H]acetile dal [3H]acetil-PAF all' 1acil-2-lisoPAF
Il monostrato di cellule endoteliali è stato preincubato con flavonoidi e trattato con H2O2 come precedentemente descritto. In questo caso però l'H2O2, veniva
aggiunta in presenza di [3H]acetil PAF (2.5 Ci) in 0.1
% di BSA. Alla fine dell'incubazione è stato rimosso il
mezzo di coltura e le cellule sono state lavate due volte
con HBSS-10mM HEPES dopodiché sono state grattate in 3 mL di metanolo. I lipidi cellulari sono stati
estratti (Bligh e Dyer, 1959) e, dopo successiva idrolisi con fosfolipasi C (PLC), benzoilazione e analisi cromatografica su lastra sottile (TLC), è stata effettuata la
quantificazione del [3H]acetile trasferito dal [3H]acetil
PAF al 1-acil-2-lisoPAF come descritto da Balestrieri
et al. 1997. Brevemente, la frazione lipidica corrispondente all' 1-radil-2-[3H]acetil-GPC è stata purificata mediante TLC con silice di tipo H, utilizzando
come solvente di sviluppo una miscela di cloroformio:metanolo:acido acetico:acqua (50:25:8:6 v/v/v/v).
La frazione di 1-radil-2-[3H]acetil-GPC purificata è
stata risospesa in 0.7 mL di tampone fosfato 0.05 M
pH 7.1 e 2 mL di etere in presenza di 40 unità di PLC.
Dopo incubazione condotta per 3 ore a temperatura
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ambiente in continua agitazione, la digestione con
PLC è stata interrotta ed i lipidi 1-radil-2-[3H]acetil-G
sono sono stati estratti dal tampone fosfato (0.05M pH
7.1) mediante aggiunta di 2mL di esano per 3 volte.
Dopo aver portato a secco sotto flusso di azoto la soluzione, gli 1-radil-2-[3H]acetil-G, sono stati derivatizzati con 200 L di anidride benzoica (50 mg/mL in benzene anidro) e 100 L di dimetilamminopiridina
disciolta in benzene anidro (40 mg/mL). I lipidi benzoilati sono stati estratti dalla miscela di derivatizzazione mediante aggiunta di 2mL di esano e 1mL di
NH4OH e separati nelle diverse sottoclassi mediante
TLC con silice di tipo G.
La radioattività di ciascuna sottoclasse di lipidi è
stata determinata attraverso scintillazione in fase
liquida.
Determinazione del rilascio di [3H]acido arachidonico
La determinazione del rilascio di [3H]acido arachidonico, come indice dell'attività della PLA2, è stata
effettuata
come
descritto
precedentemente
(Balestrieri et al. 1998). Brevemente, le cellule endoteliali, piastrate in piastre da 6 pozzetti, sono state
preincubate con [3H]acido arachidonico (0.25 Ci)
per 40h a 37 °C, al fine di incorporare [3H]acido arachidonico per effetto dei processi reversibili di mobilizzazione dei fosfolipidi di membrana. Dopo l'incorporazione, le cellule sono state lavate con 2 mL di
HBSS-10mM HEPES e trattate con flavonoidi (25
M) e H2O2 (1mM) come precedentemente descritto.
Infine viene misurato il rilascio di acido arachidonico
mediante spettrometria di scintillazione liquida.
Analisi statistica dei risultati
RISULTATI
Le condizioni adottate per l'analisi cromatografia
HPLC dell'estratto idroalcolico del pastazzo di bergamotto sono riportate in Tabella 1.
L'identificazione dei flavonoidi è stata effettuata
in base ai tempi di ritenzione e la quantificazione
è stata eseguita per integrazione dell'area dei picchi dei campioni e dei rispettivi standard mediante
la costruzione di una retta di calibrazione. I flavonoidi più rappresentati, identificati nell'estratto
idroalcolico, sono: neoeriocitrina, eriocitrina,
esperidina, neoesperidina, naringina. In Figura 1 è
riportato un tipico cromatogramma di un estratto
idroalcolico. L'estratto idroalcolico totale contenente neoeriocitrina, eriocitrina, esperidina, neoesperidina, naringina è stato utilizzato per i successivi esperimenti dissolvendo il prodotto liofilizzato in dimetilsolfossido e diluendo la soluzione nel
tampone opportuno alla concentrazione finale stabilita.
Effetto dello stress ossidativo sul metabolismo del
PAF
Lo stress ossidativo è stato indotto nelle cellule
endoteliali tramite incubazione in presenza di perossi-
Tabella 1 - Condizioni cromatografiche adottate per l'analisi
HPLC dell'estratto.
neoesperidina
2e+5
naringina
neoeriocitrina
3e+5
I dati dei diversi gruppi di esperimenti sono stati
analizzati mediante il test t di Student e sono stati
considerati statisticamente significativi i valori con p
< 0.05. I valori dei dati, espressi come media ± ESM
(errore standard della media), provenivano da almeno
tre esperimenti indipendenti eseguiti in duplicato.
Volume iniezione
5L
Colonna
RP-C 18 l50x3mm 5m (Phenomenex)
Lunghezza d'onda analitica 287 nm
AU
2e+5
600 L/min
Flusso
5e+4
Tampone A:
esperidina
eriocitrina
1e+5
Tampone B:
Gradiente:
0
24
26
28
30
32
34
tempo (min)
Figura 1 - Profilo HPLC Flavonoidi glucosidici di un estratto
idroalcolico da Pastazzo.
KH2PO4 5mM pH 3.05
ACN:H2O:H2PO4 (70:26:4 v/v/v) +100L
H3PO4 87%
tempo (min.)
composizione
0-3
100% A
3-38
38% A-42% B (lineare)
38-48
100% B
48-60
100% A
M.L. BALESTRIERI ET AL. / Ess. Deriv. Agr., 74, 3-10 (2004)
do di idrogeno alla concentrazione 1 mM, concentrazione che è stato dimostrato non essere citotossica
(Vepa et al., 1999) nei tempi impiegati nei nostri
esperimenti. Preliminarmente sono state fatte prove
per trovare i tempi ottimali per la migliore induzione
degli enzimi di interesse. I risultati hanno mostrato
che l'attività acetiltransferasica (AT) presenta il maggior incremento dopo 10 min di incubazione con
H2O2, passando dall'attività specifica basale di circa
40 nmoli/min/mg prot a oltre 180 nmoli/min/mg prot.
Negli stessi esperimenti, allorché si comparavano le
attività della TA (TAL, TAS e AH) rispetto alle attività
basali delle cellule non stimolate, si è osservato che
l'attività AH non subisce variazioni così come l'attività TAS. L'attività TAL, invece, subisce un modesto
incremento di circa il 25% passando da circa 75
pmoli/min/mg prot nel basale a 100 pmoli/min/mg
prot dopo la stimolazione per 10 min con H2O2. In
conclusione, questo primo gruppo di esperimenti ha
dimostrato che nelle EC lo stress ossidativo induce un
rilevante aumento della sintesi di PAF attraverso l'induzione dell'AT. Viceversa le attività enzimatiche che
abbassano i livelli di PAF (TAL,TAS e AH) sono scarsamente o per nulla modificate.
Effetti dei flavonoidi da estratto di bergamotto sul
metabolismo del PAF
Per verificare l'ipotesi che l'estratto totale di flavonoidi da bergamotto avesse un effetto antinfiammatorio che si espleta mediante la regolazione degli enzimi del metabolismo del PAF, cioè l'AT e la TA, come
da noi precedentemente dimostrato per altri antiossidanti naturali (Balestrieri 2003, 2004), le cellule
endoteliali sono state preincubate per 1 h con l'estratto totale di flavonoidi di bergamotto in modo che la
concentrazione finale dei flavonoidi fosse 25M.
Successivamente, dopo aver allontanato i flavonoidi
dell'estratto per lavaggio con il mezzo di incubazione,
le cellule sono state trattate con 1 mM H2O2 per 10
min. Come indicato in Figura 2 i risultati mostrano
che i flavonoidi dell'estratto di bergamotto (estratto)
inibiscono l'attività AT ed inducono significativamente l'attività TAL. Più precisamente, l'attività AT viene
fortemente inibita dai flavonoidi dell'estratto totale in
maniera paragonabile alla naringina standard, in
accordo con quanto da noi precedentemente dimostrato (Balestrieri, 2003). Anche l'attività TAL incrementa in modo significativo e, precisamente, del
380% in più rispetto alle EC trattate con H2O2. Questi
risultati indicano che anche i flavonoidi da estratto di
bergamotto modulano l'attività TAL in cellule endoteliali durante stress ossidativo.
L'induzione dell'attività TAL da parte dei flavonoidi
dell'estratto di bergamotto è stata verificata anche in
cellule endoteliali intatte mediante la determinazione
dell'efficienza di trasferimento del gruppo [3H]acetile
dal [3H]acetil-PAF all' 1-acil-2-lisoPAF. I risultati
mostrati in Tabella 2 indicano che il trasferimento del
gruppo [3H]acetile dal [3H]acetil-PAF all' 1-acil-2lisoPAF incrementa da 420x103 cpm/fiasca in cellule
endoteliali trattate con H2O2 a circa 750x103 cpm/fiasca e 890x103 cpm/fiasca in cellule trattate rispettiva-
attività specifiche(% del controllo)
600
500
controllo
H2O2
400
Nar+H2O2
Estratto+H2O2
300
200
100
0
AT
7
TAL
Figura 2 - Effetto dei flavonoidi estratti da pastazzo di bergamotto sul metabolismo del PAF in cellule endoteliali durante stress ossidativo.
M.L. BALESTRIERI ET AL. / Ess. Deriv. Agr., 74, 3-10 (2004)
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mente con naringina o flavonoidi di estratto da
pastazzo di bergamotto.
Infine, per verificare se i flavonoidi dell'estratto
totale di pastazzo di bergamotto esercitavano l'azione
antinfiammatoria anche attraverso l’attivazione dell'attività AH, favorendo l'idrolisi del PAF, abbiamo
esaminato quest’ultima sull'omogenato cellulare totale in cellule preincubate con flavonoidi dell'estratto
(estratto) e poi trattate con H2O2. I risultati hanno
indicato che l'attività AH non subisce modifiche e,
pertanto, l'estratto di flavonoidi da pastazzo di bergamotto modula soltanto l'attività TAL ma non quella
AH, che rimane ai livelli basali.
Tabella 2 - Effetto dei flavonoidi estratti da pastazzo di bergamotto sul trasferimento del gruppo [3H]acetile dal [3H]acetil-PAF all' 1-acil-2-lisoPAF.
1-acil-2-[3H]acetile-PAF
cpm x103/fiasca
Controllo
330 ± 33.6
420 ± 22.5
H2O2
890 ± 44.8
Estratto + H2O2
750 ± 47.5
Naringina + H 2O2
3
[ H]acido arachidonico rilasciato (cpm/piastra)
Effetto dei flavonoidi estratti da pastazzo di bergamotto sul rilascio di acido arachidonico
Allo scopo di verificare se l'effetto dei flavonoidi
estratti da pastazzo di bergamotto si estendesse anche
a livello della prima tappa della via biosintetica di
rimodellamento del PAF catalizzata dalla fosfolipasi
A2 (PLA2) abbiamo misurato il rilascio di acido
[H3]arachidonico come indice dell'attività di questo
enzima, secondo la procedura descritta in Materiali e
Metodi. I risultati mostrati in Figura 3 indicano che i
flavonoidi estratti da pastazzo di bergamotto inibiscono in maniera significativa il rilascio di [H3]acido arachidonico che va da circa 4.100 cpm/piasta in cellule
endoteliali trattate solo con H2O2 a circa di 1.900
cpm/piasta in cellule endoteliali pretrattate con flavonoidi da pastazzo di bergamotto prima della stimolazione con H2O2. I risultati riportati indicano che i flavonoidi estratti da pastazzo di bergamotto proteggono
le cellule endoteliali durante lo stress ossidativo non
solo direzionando, tramite l'aumento dell'attività TAL,
l'utilizzazione del PAF verso la sintesi degli analoghi
acilici, ma anche inibendo l'attività della PLA2 e,
quindi, la produzione dei lisofosfolipidi precursori
della biosintesi del PAF.
DISCUSSIONE
Nello strato interno della parete dei vasi sanguigni,
le cellule endoteliali possono, in condizioni di stress,
essere esposte ai perossidi come, ad esempio, quelli
prodotti dai neutrofili attivati al sito d'infiammazione
(Van der Vliet et al., 1994). Lo stress ossidativo e la
produzione delle ROS sono implicati in una varietà
di patologie come il morbo di Alzheimer, il cancro e
patologie vascolari come l'aterosclerosi. In particolare, si ritiene che due processi correlati siano responsabili dell'insorgere dell'aterosclerosi: le disfunzioni
endoteliali (vasocostrizione, attivazione piastrinica,
adesione leucocitaria, infiammazione e trombogenesi) e accumulo di lipidi con conseguente produzione
di LDL ossidate (Steinberg et al., 1989; Alexander et
al., 1995). Questi processi sono mediati da un numero di agenti che includono i mediatori dell'infiammazione. L'inibizione dell'ossidazione delle LDL è un
5000
4000
3000
2000
1000
0
controllo
H2O2
Nar+H2O2
Estratto+H2O2
Figura 3 - Effetto dei flavonoidi estratti da pastazzo di bergamotto sul rlascio di [3H]acido arachidonico in cellule endoteliali durante stress ossidativo.
M.L. BALESTRIERI ET AL. / Ess. Deriv. Agr., 74, 3-10 (2004)
processo ben caratterizzato che include il controllo
della concentrazione o della reattività degli ossidanti
capaci di modificarle e la resistenza delle stesse LDL
a questi ossidanti (Diaz et al., 1997). La suscettibilità delle LDL alle modificazioni ossidative può essere diminuita dall'acil-PAF (Maziere et al., 1994), l'analogo acilico del PAF. L'acil-PAF è il componente
predominante prodotto dalle cellule endoteliali attivate e la TAL contribuisce alla sua biosintesi
(Balestrieri et al., 1997; Balestrieri et al., 1998). E'
riportato che l'attività AH riveste un ruolo fondamentale contro stress di tipo ossidativo (Matsuzawa et
al., 1997), probabilmente idrolizzando i fosfolipidi
ossidati. Inoltre, nelle LDL umane, l'AH possiede
entrambe le attività transacetilasica e acetilidrolasica
(Tsoukatos et al., 2001). Nel presente lavoro è stato
mostrato che i flavonoidi estratti da pastazzo di bergamotto modulano l'attività TAL della TA favorendo
così la sintesi di acil-PAF. Per quanto riguarda le attività AH e TAS della TA, i nostri risultati hanno
mostrato che entrambe le attività non sono indotte in
cellule endoteliali né dallo stress ossidativo, né da
pretrattamento con flavonoidi (dati non mostrati),
indicando così che queste due vie di protezione non
sono probabilmente attivate. In conclusione, in questo lavoro abbiamo mostrato che i flavonoidi estratti
da pastazzo di bergamotto esercitano la loro azione
antinfiammatoria regolando le attività degli enzimi
responsabili della biosintesi del PAF e dell'acil-PAF.
In particolare, noi abbiamo mostrato l'incremento
della biosintesi di acil-PAF in seguito al pretrattamento delle cellule endoteliali con flavonoidi estratti
da pastazzo di bergamotto. Le cellule endoteliali sintetizzano acil-PAF come prodotto predominante in
seguito a stimoli infiammatori (Clay et al., 1991;
Whatley et al., 1992), e l'attività TAL contribuisce
9
significativamente alla sua biosintesi (Balestrieri et
al., 1997). I nostri risultati suggeriscono che la TAL
media l'azione antinfiammatoria dei flavonoidi da
pastazzo di bergamotto in cellule endoteliali durante
stress ossidativo, provvedendo all’inattivazione del
PAF con la concomitante biosintesi di acil-PAF, il
quale esercita un ruolo benefico durante l'inizio e il
decorso dell'aterosclerosi (Maziere et al., 1994). Nel
presente lavoro, abbiamo anche confermato che i flavonoidi da pastazzo di bergamotto inibiscono l'attività AT, l'enzima chiave responsabile della biosintesi
del PAF. Il meccanismo attraverso il quale essi inibiscono l'attività AT è purtroppo ancora poco chiaro
(Yanoshita et al., 1996). Un' evidenza suggerisce che
l'azione biologica di flavonoidi estratti da agrumi è
probabilmente legata alla loro interazione con un
particolare recettore (Manthey et al., 2001). Le proprietà antiossidanti dei flavonoidi sono per lo più
relazionate alla loro diretta azione intrappolante (scavenging) delle ROS e dei radicali liberi (Simon et al.,
1997) o alla loro interazione con agenti intracellulari
responsabili di meccanismi antiossidativi come la
glutatione perossidasi (Galati et al., 2001; Nagata et
al., 1999). Tuttavia, noi abbiamo mostrato che in cellule pretrattate con flavonoidi da estratto di bergamotto la variazione del livello di GSH totale non è
significativa se comparata a quella di cellule non pretrattate (dati non mostrati): sembrerebbe, pertanto,
che il meccanismo di attivazione della AT, come pure
della TAL, durante trattamento delle cellule endoteliali con flavonoidi, sia indipendente dallo stato
redox dell'ambiente intracellulare.
BIBLIOGRAFIA
Ringraziamenti
Il presente lavoro è stato finanziato dal progetto Ricerche e
Sperimentazioni nel Settore dell'Agrumicoltura Italiana del
Ministero delle Politiche Agricole e Forestali. Pubbl. n. 90
Alexander R.W., Theodore Cooper Memorial Lecture.
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