ESPRESSIONE DI UN RECETTORE OLFATTIVO IN

ESPRESSIONE DI UN RECETTORE OLFATTIVO IN UN CLONE DI NEURONI
SENSORIALI OLFATTIVI UMANI
P. Gavazzo1, C. Picco1, G. B. Vannelli2, H. Zhao3, S. Firestein3 e A. Menini1
1
Istituto di Cibernetica e Biofisica, CNR, Genova; 2Dipartimento di Anatomia Umana ed Istologia, Università di
Firenze; 3Department of Biological Sciences, Columbia University, New York, USA
Il riconoscimento degli odori inizia nelle cilia dei neuroni sensoriali olfattivi, dove le molecole odorose
interagiscono con vari recettori; tale interazione innesca una serie di cascate enzimatiche che portano alla sintesi
di un secondo messaggero, la depolarizzazione della membrana cellulare e la generazione di potenziali di azione
che vengono trasmessi lungo l'assone al bulbo olfattivo. Centinaia di recettori olfattivi sono presenti nei neuroni
olfattivi e molti tra questi sono stati clonati (Buck and Axel, Cell 65:175,1991). Vari tipi di esperimenti
sembrano indicare che ogni neurone esprime un solo tipo o comunque un numero ristretto di recettori. Ogni
recettore probabilmente riconoscerebbe caratteristiche strutturali specifiche delle molecole odorose ed è
probabile che un odore attivi più di un recettore. Purtroppo si sono incontrate molte difficoltà nell'ottenere
l'espressione funzionale dei recettori olfattivi clonati. Solo recentemente un recettore, denominato I7, è stato
espresso nell'epitelio olfattivo di ratto utilizzando un sistema basato su un adenovirus ricombinante e misure
elettrofisiologiche hanno finalmente permesso di identificare alcune molecole che lo attivano specificamente
(Zhao et al., Science 279:237, 1998).
Sembra particolarmente importante a questo punto individuare sistemi cellulari di facile utilizzo in grado di
esprimere correttamente i recettori olfattivi, nei quali cioè le proteine recettoriali riescano a raggiungere la
membrana plasmatica e ad accoppiarsi efficacemente alla catena enzimatica che produce una risposta misurabile
allo stimolo.
Nel 1995 per la prima volta neuroni sensoriali olfattivi sono stati isolati da feti umani, clonati e mantenuti
in coltura per circa 1 anno (Vannelli et al., J. Neurosci. 15(6); 4382, 1995). Indagini biochimiche e
immunologiche hanno dimostrato il raggiungimento di una maturità funzionale di tali cellule che possono
rappresentare un buon sistema per lo studio dei meccanismi del riconoscimento degli odori.
In questo lavoro vengono presentati i risultati preliminari ottenuti infettando un clone di neuroni olfattivi
con l'adenovirus ricombinante che contiene il gene del recettore olfattivo I7. Per identificare rapidamente le
cellule infettate è stata utilizzata la "green fluorescent protein" (GFP), che fluoresce intensamente nel campo del
visibile con luce verde. La GFP è prodotta in natura dalla medusa Aequorea e, non essendo tossica per le cellule,
può essere utilizzata in vivo come marker fisiologico. Il gene della GFP è stato inserito nel costrutto virale
utilizzato e viene trascritto insieme al gene del recettore olfattivo, rendendo fluorescenti, e quindi facilmente
identificabili, solo le cellule che hanno espresso il recettore I7. Nei nostri esperimenti le cellule sono state
infettate il giorno successivo la loro semina su vetrino con 100-200 pfu/cellula, per tempi variabili da 15 minuti a
1 ora; sono poi state incubate per 36-48 ore a 37°C per permettere l'espressione del DNA virale. Dall'analisi in
fluorescenza si è visto che in queste condizioni più del 50% delle cellule esprime il recettore I7. Si proverà
quindi ad esprimere altri recettori e, con misure di elettrofisiologia, si cercherà di determinare da quali molecole
odorose sono attivati.

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