IT HT101.qxd - Sigma

abbondante acqua e ricorrere all’assistenza di un medico. Indossare indumenti
adeguatamente protettivi, guanti e protezione per gli occhi e il viso. In caso di incidente o
di malessere, ricorrere immediatamente a cure mediche (mostrando l’etichetta del prodotto
se possibile).
COLORAZIONE ARGENTO
STEINER-STEINER
MODIFICATA ACCUSTAIN®
(Procedura n. HT101)
Dichiarazioni sui rischi e la sicurezza (U.E.)
La soluzione di nitrato di uranile è TOSSICA. Tossica per inalazione e ingestione. In
caso di incidente o di malessere, ricorrere immediatamente a cure mediche (mostrando
l’etichetta del prodotto se possibile).
Soluzione di nitrato d’argento. Nociva per gli organismi acquatici. A lungo termine, può
provocare effetti negativi per l’ambiente acquatico. Non respirare i vapori. Evitare il contatto
con la cute e gli occhi.
La soluzione di mastice è FACILMENTE INFIAMMABILE e IRRITANTE. Facilmente
infiammabile. Irritante per gli occhi, il sistema respiratorio e la cute. Mantenere i contenitori
ben chiusi. Tenere lontano da fiamme e scintille – Non fumare. In caso di contatto con gli
occhi, sciacquare immediatamente con abbondante acqua e ricorrere all’assistenza di un
medico. Indossare indumenti protettivi idonei.
Le compresse di idrochinone sono NOCIVE e pericolose per l’ambiente. Nocive per
ingestione. Prove insufficienti di effetti cancerogeni. Rischio di gravi lesioni oculari. Possono
causare sensibilizzazione in caso di contatto con la cute. Molto tossiche per gli organismi
acquatici. Possibile rischio di effetti irreversibili. In caso di contatto con gli occhi, sciacquare
immediatamente con abbondante acqua e ricorrere all’assistenza di un medico. Indossare
indumenti adeguatamente protettivi, guanti e protezione per gli occhi e il viso. Non
disperdere nell’ambiente. Consultare le istruzioni speciali o le schede di sicurezza.
L’alcol anidro è FACILMENTE INFIAMMABILE e IRRITANTE. Facilmente infiammabile.
Irritante per gli occhi, il sistema respiratorio e la cute. Mantenere i contenitori ben chiusi.
Tenere lontano da fiamme e scintille – Non fumare. In caso di contatto con gli occhi,
sciacquare immediatamente con abbondante acqua e ricorrere all’assistenza di un medico.
Indossare indumenti protettivi idonei.
Lo xilene è NOCIVO. Infiammabile. Nocivo per inalazione e a contatto con la cute.
Irritante per la cute. Evitare il contatto con gli occhi.
USO PREVISTO
La colorazione argento Steiner-Steiner modificata di Sigma-Aldrich viene impiegata
per la rivelazione di spirocheti e batteri non filamentosi in sezioni di tessuto sparaffinate. I
reagenti della colorazione argento sono riservati al solo “uso diagnostico in vitro”.
Tra le tecniche documentate per la rivelazione degli spirocheti e di altri organismi
opportunisti, ricordiamo le procedure Warthin-Starry, Dieterle e Steiner-Steiner.1-3 In genere
queste procedure comportano una preparazione della soluzione alquanto elaborata e
producono risultati altamente variabili.
La metodica Sigma-Aldrich è una variante della metodica Steiner-Steiner, la quale
prevede un’applicazione al microonde che consente di accelerare ed accentuare la
colorazione d’argento nelle sezioni di tessuto. Il calore prodotto dal microonde facilita
l’impregnazione del nitrato d’argento nelle sezioni di tessuto, procedura che spesso
garantisce uno sfondo molto più pulito rispetto alla tecnica tradizionale. La procedura
prevede un lavaggio con acqua corrente, un’asciugatura all’aria oppure un’asciugatura
rapida completa. La variazione della procedura Steiner-Steiner messa a punto da SigmaAldrich garantisce una colorazione coerente e riproducibile.
REAGENTI
SOLUZIONE DI NITRATO DI URANILE, n. di catalogo HT101-1
Nitrato di uranile 1%, in acqua.
SOLUZIONE DI NITRATO D’ARGENTO, n. di catalogo HT101-2
Nitrato d’argento 1%, in acqua.
SOLUZIONE MASTICE (ALCOLICA), n. di catalogo HT101-3
Mastice in alcol assoluto
PROCEDURA
COMPRESSE DI IDROCHINONE, n. di catalogo HT101-4
Idrochinone 0,5 g, con eccipienti
RACCOLTA E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI
Per la raccolta dei campioni, attenersi alla procedura descritta nel documento NCCLS
numero M29-A2. Nessun metodo di analisi noto garantisce con assoluta certezza che i
campioni di sangue o il tessuto non trasmettano infezioni. Di conseguenza tutti i derivati del
sangue e i campioni di tessuto devono essere considerati potenziali veicoli di infezioni.
Fissare i campioni in una soluzione di formalina neutra tamponata al 10%, sparaffinare
e tagliare sezioni di 5 micron.
CONSERVAZIONE E STABILITÀ
Conservare i reagenti per la colorazione argento in frigorifero (2–8°C). Scartare i
reagenti se intorbidiscono. La data di scadenza è indicata sull’etichetta dei reagenti.
DETERIORAMENTO
Scartare la soluzione di nitrato d’argento e la soluzione di mastice alcolica se
intorbidiscono.
MATERIALI SPECIALI NECESSARI MA NON FORNITI
In ogni seduta includere vetrini di controllo positivi, ad esempio Sigma TISSUE-TROL
spirocheti (n. di catalogo S 2645) oppure TISSUE-TROL elicobatteri (n. di catalogo H 1898).
Alcol assoluto
Alcol al 95%
Xilene
PREPARAZIONE
Per preparare la soluzione di lavoro di idrochinone, fare sciogliere una compressa di
idrochinone in 25 ml di acqua deionizzata. Mescolare con cura.
Le soluzioni di nitrato di uranile, di nitrato d’argento e di mastice sono già pronte per
l’uso.
SOLO PER LA PROCEDURA STANDARD:
Bagnomaria a 45°C e 60°C
Vaschette Coplin di plastica con coperchio, n. di catalogo S 5641
PRECAUZIONI
Seguire le normali precauzioni adottate per i reagenti di laboratorio. Smaltire i rifiuti in
conformità alle normative vigenti a livello locale, regionale o nazionale. Fare riferimento al
foglio dati relativo alla sicurezza dei materiali per informazioni aggiornate riguardanti i
rischi, i pericoli e la sicurezza associati all’uso di questi prodotti.
I vetrini di controllo TISSUE-TROL spirocheti e TISSUE-TROL elicobatteri sono sezioni
di tessuto umano o di coniglio sparaffinate, contenenti rispettivamente spirocheti ed
elicobatteri, da considerarsi come potenziali veicoli di infezioni.
SOLO PER LA PROCEDURA IN MICROONDE:
Forno a microonde ACCUMATE™ H2100, n. di catalogo A 9084 (110 v) o A 9209 (220 v)
Vaschette Coplin di plastica con coperchio perforato, n. di catalogo C 3883
NOTE
Evitare di utilizzare i sostituti dello xilene, in quanto tendono a scolorire gli spirocheti.4
Se si adotta la procedura Sigma-Aldrich per forno a microonde H2100, fare riferimento
al manuale del produttore per le istruzioni operative.
I dati generati da questa procedura sono da utilizzarsi soltanto a sostegno della
diagnosi e devono essere valutati congiuntamente ad altri esami e dati diagnostici.
Dichiarazioni sui rischi e la sicurezza (U.S.A.)
La soluzione di nitrato di uranile è TOSSICA. Tossica per inalazione e ingestione. In
caso di incidente o di malessere, ricorrere immediatamente a cure mediche (mostrando
l’etichetta del prodotto se possibile). Organi colpiti: reni e fegato.
Soluzione di nitrato d’argento. Nociva per gli organismi acquatici. A lungo termine, può
provocare effetti negativi per l’ambiente acquatico. Attenzione: evitare il contatto e
l’inalazione. Organi colpiti: sangue e nervi.
La soluzione di mastice è INFIAMMABILE e IRRITANTE. Irritante per gli occhi, il
sistema respiratorio e la cute. Mantenere i contenitori ben chiusi. Conservare il contenitore
in un ambiente adeguatamente ventilato. Tenere lontano da fiamme e scintille – Non
fumare. In caso di contatto con gli occhi, sciacquare immediatamente con abbondante
acqua e ricorrere all’assistenza di un medico. Indossare indumenti protettivi idonei. Organi
colpiti: fegato e nervi.
Le compresse di idrochinone sono TOSSICHE e pericolose per l’ambiente. Nocive per
ingestione. Irritanti per la cute. Prove insufficienti di effetti cancerogeni. Rischio di gravi
lesioni oculari. Possono causare sensibilizzazione in caso di contatto con la cute. Molto
tossiche per gli organismi acquatici. In caso di contatto con gli occhi, sciacquare
immediatamente con abbondante acqua e ricorrere all’assistenza di un medico. Indossare
indumenti adeguatamente protettivi, guanti e protezione per gli occhi e il viso. Non
disperdere nell’ambiente. Consultare le istruzioni speciali o le schede di sicurezza.
L’alcol anidro è INFIAMMABILE e IRRITANTE. Irritante per gli occhi, il sistema
respiratorio e la cute. Mantenere i contenitori ben chiusi. Tenere lontano da fiamme e
scintille – Non fumare. In caso di contatto con gli occhi, sciacquare immediatamente con
abbondante acqua e ricorrere all’assistenza di un medico. Indossare indumenti protettivi
idonei. Organi colpiti: nervi e fegato.
Lo xilene è INFIAMMABILE e NOCIVO. Possibile rischio di riduzione della fertilità. Può
provocare danni al feto. Nocivo per inalazione e a contatto con la cute. Irritante per il
sistema respiratorio e la cute. Rischio di gravi lesioni oculari. Tenere lontano da fiamme e
scintille – Non fumare. In caso di contatto con gli occhi, sciacquare immediatamente con
PROCEDURA
PROCEDURA STANDARD
1. Utilizzare vaschette Coplin di plastica pulite chimicamente.
2. Preriscaldare 40 ml di nitrato di uranile (n. di catalogo HT101-1) e 40 ml di soluzione
di nitrato d’argento (n. di catalogo HT101-2) a 60°C.
3. Riscaldare la soluzione di mastice (n. di catalogo HT101-3) a temperatura
ambiente.
4. Deparaffinare e idratare le sezioni in acqua deionizzata.
5. Collocare le sezioni nella soluzione di nitrato di uranile preriscaldata per 15 minuti in
un bagnomaria a 60°C.
6. Sciacquare in tre ricambi di acqua deionizzata.
7. Collocare le sezioni nella soluzione di nitrato d’argento preriscaldata in un
bagnomaria a 60°C per 1 ora e mezza.
8. Sciacquare in tre ricambi di acqua deionizzata.
9. Sciacquare in due ricambi di alcol al 95% e due ricambi di etanolo assoluto.
10. Collocare le sezioni nella soluzione di mastice per 5 minuti.
11. Estrarre i vetrini dalla soluzione di mastice e lasciare asciugare le sezioni.
12. Preparare la soluzione riducente mescolando 10 ml di soluzione di mastice (n. di
catalogo HT101-3), 25 ml di soluzione di lavoro di idrochinone e 5 ml di alcol
assoluto. Filtrare con carta tipo Whatman n. 54 o prodotto equivalente e aggiungere
200 µl di soluzione di nitrato d’argento.
NOTA La soluzione riducente potrebbe apparire lattiginosa.
1-IT
13.
14.
15.
16.
Riscaldare la soluzione riducente in una vaschetta Coplin di plastica, senza i vetrini,
in un bagnomaria a 45°C. Aggiungere le sezioni nella soluzione riducente già calda
e incubare fino a 25 minuti.
Lasciare riposare i vetrini nella soluzione riducente a temperatura ambiente fino ad
ottenere il grado desiderato di colorazione nera (il tempo ottimale dovrebbe essere di
1–2 minuti). Se lo si desidera, è possibile prolungare i tempi di colorazione. Scartare
la soluzione dopo averla utilizzata una volta.
Disidratare le sezioni con l’alcol.
Chiarificare in xilene e montare.
PROCEDURA PER MICROONDE ACCUMATE™ H2100
1. Deparaffinare e idratare in acqua deionizzata.
2. Collocare i vetrini in 40 ml di soluzione di nitrato di uranile (n. di catalogo HT101-1)
all’interno di una vaschetta Coplin di plastica. Richiudere la vaschetta senza stringere
il coperchio oppure utilizzare un coperchio perforato.
3. Mettere in microonde a 600 watt per 30 secondi.
4. Sciacquare accuratamente i vetrini cambiando più volte l’acqua deionizzata.
5. Collocare i vetrini in 40 ml di soluzione di nitrato d’argento (n. di catalogo HT101-2).
6. Mettere in microonde a 600 watt per 30 secondi. Mescolare la soluzione con una
pipetta Beral o un bastoncino applicatore e incubare per 10 minuti.
7. Sciacquare cambiando più volte l’acqua deionizzata.
8. Sciacquare i vetrini in due ricambi di alcol al 95% e due ricambi di alcol assoluto.
9. Collocare i vetrini nella soluzione di mastice (n. di catalogo HT101-3) e lasciare
incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
10. Estrarre i vetrini dalla soluzione di mastice e lasciare asciugare le sezioni all’aria.
11. Preparare la soluzione riducente mescolando 10 ml di soluzione di mastice (n. di
catalogo HT101-3) con 25 ml di soluzione di lavoro di idrochinone e 5 ml di etanolo
assoluto. Filtrare la soluzione, quindi aggiungere 200 µl (0,2 ml) di soluzione di
nitrato d’argento. Mescolare.
12. Mettere in microonde la soluzione riducente all’interno di una vaschetta Coplin di
plastica senza i vetrini a 600 watt per 15 secondi. Mescolare la soluzione con una
pipetta Beral o un bastoncino applicatore.
13. Aggiungere subito i vetrini nella soluzione riducente e mettere in microonde a
400 watt per 20 secondi.
14. Mescolare la soluzione con una pipetta Beral o un bastoncino applicatore, quindi
incubare i vetrini nella soluzione riducente fino ad ottenere il grado desiderato di
colorazione nera. Il tempo ottimale va da 45 a 60 secondi circa. Se lo si desidera, è
possibile prolungare i tempi di colorazione. Scartare la soluzione dopo averla
utilizzata una volta.
15. Sciacquare i vetrini in acqua deionizzata.
16. Disidratare con alcol, chiarificare in xilene e montare.
CARATTERISTICHE PRESTAZIONALI
Gli spirocheti e gli altri batteri non filamentosi assumono una colorazione da marrone
scuro a nero. Lo sfondo assume una colorazione da giallo chiaro a marrone chiaro.
Se i risultati osservati si discostano dai risultati attesi, contattare l’assistenza tecnica
Sigma-Aldrich per informazioni di supporto.
BIBLIOGRAFIA
1.
2.
3.
4.
Van Orden AE, Greer PW: Modification of the Dieterle spirochete stain.
J Histotechnol 1 (2):51–53, 1977
Churukian CJ, Schenk EA: A Warthin-Starry method for spirochetes and bacteria
using a microwave oven. J Histotechnol 11 (3): 149–151, 1988
Swisher BL: Modified Steiner procedure microwave staining for spirochetes and
nonfilamentous bacteria. J Histotechnol 10 (4): 241–243, 1987
Davis, Mary M., HT (ASCP): Joy of Microwaving, NSH Symposium, Buffalo, NY, Oct.
1995
Sigma-Aldrich, Inc. garantisce che i propri prodotti sono conformi alle informazioni
contenute nel presente documento e in altre pubblicazioni Sigma-Aldrich. Spetta
all’acquirente stabilire se i prodotti sono idonei all’uso particolare che ne viene fatto. È
possibile che sussistano ulteriori termini e condizioni. Vedere il retro della fattura o la
distinta di imballaggio per i termini e le condizioni di vendita.
Procedura n. HT101
Revisione precedente: 2003-03
Revisione: 2003-09
AR-MED Ltd., Runnymede Malthouse
Egham TW20 9BD (Regno Unito)
SIGMA-ALDRICH, INC.
3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 (USA) +1 314 771 5765
Assistenza tecnica: a carico del destinatario +1 314 771 3122
o tramite e-mail all’indirizzo [email protected]
Per ordinare: a carico del destinatario +1 314 771 5750
www.sigma-aldrich.com
SIGMA-ALDRICH CHEMIE GmbH
P.O. 1120, 89552 Steinheim (Germania) 49-7329-970
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