Dai raggi-X alla progettazione di farmaci: le radici matematiche e

Dai raggi-X alla progettazione di
farmaci: le radici matematiche e
fisiche della biologia del XXI secolo
Martino Bolognesi
Dipartimento di BioScienze
Università di Milano
http://users.unimi.it/biolstru/Home.html
1
- VITA  ORDINE, ORGANIZZAZIONE, COMPLESSITA’
- LA MATERIA BIOLOGICA E’ UNA MANIFESTAZIONE
DEI PRINCIPI FONDAMENTALI DELLA FISICA E
DELLA CHIMICA, CHE IN QUESTO
CASO RAGGIUNGONO COMPLESSITA’ MASSIME
- OGGI DISPONIAMO DI APPROCCI MULTIDISCIPLINARI PER STUDIARE LA MATERIA
E I PRINCIPI FONDAMENTALI DELLA BIOLOGIA
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PERCHE’ LE PROTEINE ?
- Le proteine sono gli attuatori della cellula
- Disponibilita’ di nuovi strumenti
(sincrotroni, super-computing, microscopie)
- La material biologica a risoluzione atomica
- Le sfide della biologia moderna
(biochimica, genomicsa, proteomica, …)
- Applicazioni
(farmaci, biotecnologie, biosensori …) 3
La complessita’ strutturale delle proteine
4
Nuovi strumenti per lo studio della materia biologica
• Microscopie ottiche
(200 nm)
• microscopia a “Forza Atomica” (1 nm)
• Diffrazione di elettroni
(0.5 nm)
• NMR
(0.5 nm)
• Microscopie elettroniche
(0.1 nm)
• Diffrazione
(0.05 nm)
di raggi-X
- 1 nm = 10-9 m -
5
Raggi-X
• “Microscopia” a livello atomico – risolve gli atomi
• La risoluzione della struttura 3D avviene in maniera
“indiretta”, attraverso la misura di diagrammi di diffrazione
• La risoluzione delle strutture 3D richiede un approccio
computazionale intensivo, spesso abbinato a metodi di
simulazione computazionale.
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I metodi della bio-cristallografia
Ribosoma
19198 protein atoms
32470 RNA atoms
7
Premi Nobel per la Chimica 2009
V. Ramakrishnan T.A. Steitz A.E.Yonath
8
(Courtesy
Cristalli di diverse proteine di interesse
biotecnologico
9
Cristalli di proteine:
Cella elementare
molecola
Unita’ asimmetrica
symmetry
 Cristallo
cristallo
volume  0.1 mm3
 Cella elem. > 100 Å
 Contenuto solvente 30% - 80% v/v
 Bassa stabilita’ meccanica (Estab.< 10 kcal/mol)
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Crescita di cristalli:
Variazione di parametri chimico-fisici che influenzano la solubilita’
delle proteine
 forza ionica (conc. sali)
 pH
 temperatura
 concentrazione proteica
 additivi (molecole organiche)
 costante dielettrica del solvente
 gravità
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Approcci robotici alla
crescita di cristalli
12
L vs. nL
13
Crescita di cristalli in
micro-gravita’ (Stazione
Spaziale Internazionale)
ASI - NASA
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Microgravità:
In assenza di moti convettivi:
 Maggiore ordine intrinseco
 Minore formazione di nuclei
 Minore incorporazione di contaminanti
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L’esperimento di diffrazione
16
Apparato per
Diffrazione di raggi-X
17
ESRF - Grenoble - F
SORGENTI DI
RAGGI-X
ELETTRA Trieste
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Radiazione di sincrotrone
http://biosync.sbkb.org/regionallisting.do?region=European
19
http://www.esrf.eu/UsersAndScience/Experiments/MX/
Stazione sperimentale ad ESRF
= 0.933 Å (13.294 keV)
9.6 < E < 14.5 keV
Beamsize 50-200 m
dmax= 0.97 Å
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Diffrazione di raggi-X da parte di un cristallo:
raggi X
Ihkl
2
cristallo
h = 2, k = 1, l = 0
h = 1, k = 3, l = 0
detector
2dhkl sin= n (Bragg’s eqn.)
21
Perche’ i sincrotroni?
e4
Vx
I (hkl) = ------------ Io 3 ALP ------- F2(hkl)
Vc2
m2 c4 
http://www.esrf.eu/UsersAndScience/Experiments/MX
22
Il «problema della fase»
?
Ihkl
(x,y,z)
23
Il «problema della fase»
Ihkl  |Fhkl|2
N atomi
Fhkl =
Fattore di
struttura
Densità
elettronica
 f exp [2i (hx + ky + lz )] = |F
j
j=1
j
j
j
hkl|
exp (ihkl)
i

Fhkl = (x,y,z) exp [2i(hx+ky+lz)] dV
Vcell
1
(x,y,z) =
V
f3
F


|Fhkl| exp [-2i(hx+ky+lz-’hkl)]
hkl

P
Non misurabile
sperimentalmente
f1
f2
r
24
Dal cristallo alla struttura 3D – un processo lineare
25
Legame di molecole/farmaci a
proteine
N
C
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Strutture 3D presenti nel Protein Data Bank
applicazioni
discovery
http://www.rcsb.org/pdb/
UNA VISONE DEL PRESENTE
La ricerca di farmaci antivirali
La battaglia contro le malattie infettive ha
allungato la vita media dell’uomo
• Nell’Inghilterra di metà ‘800 il 60% delle
morti era dovuto a malattie infettive
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Il dilagare di malattie infettive
Ebola deaths
Figures up to 3 February
2015
9,019
Deaths - probable, confirmed and
suspected
(Includes one in the US and six in Mali)




3,746 Liberia
3,301 Sierra Leone
1,957 Guinea
8 Nigeria
Source: WHO
30
Il Progetto SILVER
EU HEALTH-2010 Collaborative Project
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Norovirus una minaccia per la salute
nei paesi tropicali e non solo
Il Norovirus (NV) e’ una delle principali cause di
malattie trasmesse attraverso il cibo, ed e’ causa di
morbidità e mortalità particolarmente tra i bambini
delle regioni tropicali.
NV e’ altamente infettivo e non esiste un vaccino.
32
Bersagli di farmaci nel genoma di NV (ca. 7.4 kb)
La RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) e’ uno
dei bersagli piu’ interessanti in quanto:
- enzima essenziale per la replicazione del virus
- enzima non presente nell’uomo.
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Diversi cristalli di RdRp di NV, preparati sotto opportune condizioni sperimentali,
sono stati utilizzati per le analisi cristallografiche sulla struttura 3D dell’enzima
34
Mastrangelo et al. J.Mol.Biol. (2012)
Norovirus RdRP
umana
Norovirus RdRp
murina
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Ricerca di ligandi
tramite simulazioni
computazionali
Volume esplorato
I composti migliori selezionati presentano (alla simulazione)
“energie di legame” all’enzima favorevoli.
Quindi potrebbero agire da inibitori bloccando l’attivita’
dell’enzima (e la replicazione del virus)
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Due potenziali inibitori della RdRP di NV
NF023
Suramin
Caratterizzazione in
vitro
* L’analisi biochimica ha confermato che
Suramina e NF023 si legano alla RdRp e la
inibiscono (Drug Hit)
38
Una serie di studi cristallografici
ha permesso di studiare il modo di
legame degli inibitori alla RdRp e
progettare modifiche chimiche
delle molecole che le rendano
«Drug LEADS»
39
40
41
Croci, et al. (2014) PloS one 9, e91765
Phe 29
Lys 419
Amido group 1
Tyr 418
Arg 436
Arg 392
Gln 414
Gln 439
Arg 393
Cpd6 legato in prossimita’ del dominio “Thumb” di mRdRp.
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IC50 (nM)
MNVRdRp
hNVRdR
p
Suramin
70±3
27±3
Cpd3
200±10
1280±70
Cpd4
160±7
1100±20
0
Cpd6
115±15
1000±90
Cpd7
160±6
1100±50
Cpd 8
60±4
28±4
Cpd6 legato alle RdRp murina e umana (strutture 3D sovrapposte)
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Principi dedotti per l’inibizione di NV RdRP
a partire dalle analisi cristallografiche e
biochimiche.
Gli inibitori da noi studiati:
a) Bloccano l’accesso di NTP al
sito attivo per effetti sterici
ed elettrostatici.
b) Limitano il corretto
posizionamento dei NTP
bloccando la formazione di
RNA
c) Inteferiscono con il
posizionamento del dsRNA e
limitano la via di uscita della
catena nascente di RNA
dall’enzima.
44
45
Mario Milani
Eloise Mastrangelo
Michela Bollati
Federica Cossu
Delia Tarantino
Margherita Pezzullo
Romina Croci
Louise Gourlay
Patricia Lassaux
Marco Nardini
Lucia Perletti
Riccardo Villa
Francesca Pedretti
Stefano Ricagno
Levon Chant Halabelian
Matteo DeRosa
Dip. BioScienze
U. MILANO
IBF-CNR MILANO
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