Experimentele Vaardigheden Boek II: Biochemische vaardigheden © Academia Press INHOUD Symbolen en afkortingen XI Hoofdstuk 1 Microscopie 1 Werken met de lichtmicroscoop 1 Gebruik2 Olie-immersie4 Fasecontrastmicroscoop4 Invertmicroscoop5 Fluorescentiemicroscoop5 Confocale (fluorescentie)microscoop 7 Elektronenmicroscoop8 Kleuringsmethoden8 Het maken van een preparaat Het kleuren van preparaten voor lichtmicroscopie Verschillende soorten kleuringen 9 10 11 Hoofdstuk 2 Fagen, gisten en eukaryote cellijnen 17 Werken met fagen 17 Werken met gisten 20 Werken met eukaryote cellijnen 23 Inleiding17 Faagkweek17 Inleiding20 Identificatie van gisten 21 Databank23 Belangrijkste indeling 24 Contaminatie voorkomen 24 Veiligheid25 Materialen25 Eukaryote cellen in vitro groeien 28 Het tellen van cellen 29 Cellen bewaren en ontdooien 35 Hoofdstuk 3 Staalbereiding 37 Inleiding Interacties tussen biomoleculen en detergentia en diverse stoffen 37 39 Stabiliteit en conformatie van de biomolecule 39 Stoffen die door beïnvloeding van de waterstructuur de conformatie van de biomoleculen beïnvloeden40 Stoffen die door directe interactie met biomolecule de conformatie ervan beïnvloeden 40 Reductantia voor disulfidebindingen 49 SH-modificatie reagentia 50 INHOUD Book- Labo 2.indb 7 VII 25/09/14 12:31 Experimentele Vaardigheden Boek II: Biochemische vaardigheden © Academia Press Breken van cellen en weefsels 50 Zuiveringsstrategie Isolatie, zuivering en controle zuiverheid van nucleïnezuren 57 59 Isolatie, zuivering en controle zuiverheid van eiwitten 67 Inleiding50 Overzicht van de verschillende methoden 51 Isolatie en zuivering van chromosomaal DNA Isolatie en zuivering van plasmide DNA Isolatie en zuivering van RNA Controle op zuiverheid 59 63 64 67 Algemeen overzicht isolatie en zuivering van een eiwit 67 Efficiëntie van de zuiveringsstap en zuiverheidscontrole 70 Fractionatie via precipitatie 72 Solventfractionatie77 Verwijdering van zouten 78 Bewaring83 Oplossen van een eiwit 85 Hoofdstuk 4 Scheidingstechnieken Centrifugatie 87 87 Centrifugatieversnelling88 Rotor90 Types centrifuge 91 Centrifugeerbuizen92 94 Balanceren van de rotor Centrifugale scheidingsmethoden 95 Elektroforese100 Inleiding100 Dragermateriaal102 106 Keuze stroombron Eiwitelektroforese 107 Nucleïnezuurelektroforese138 Kwantitatieve gel- en blotanalyse 148 Chromatografie Algemeen principe Gelfiltratie- of gelpermeatiechromatografie Ionenuitwisselingschromatografie Affiniteitschromatografie Hoofdstuk 5 Analysemethoden 149 149 152 158 159 161 Concentratiebepaling161 Concentratiebepaling van eiwitten Concentratiebepaling van nucleïnezuren 161 172 Structuurbepaling 175 Enzymatische bepalingsmethoden 194 Aminozuuranalyse175 Sequentie van polypeptideketens 180 DNA-sequentiebepaling187 Inleiding194 Bepaling van de reactiesnelheid 196 Substraat- en enzymconcentratiebepalingen 198 VIII Book- Labo 2.indb 8 INHOUD 25/09/14 12:31 Experimentele Vaardigheden Boek II: Biochemische vaardigheden © Academia Press Gekoppelde enzymatische reacties 202 Uitgewerkte voorbeelden 203 Bepaling van de Michaëlis-Mentenparameters Vmax en KM207 Blottingstechieken209 Soorten membranen 209 Southern blotting 210 Detectie214 Northern blotting 214 Western blotting 215 Dotblotting217 Detectie218 Hoofdstuk 6 Immunologische methoden 219 Antilichamen219 Structuur en klassen van antilichamen 219 Aanmaak van antilichamen voor wetenschappelijk onderzoek: polyklonale en monoklonale antilichamen220 220 Detectie van de antigeen-antilichaamreactie Gebruikte Labels 222 Immunoprecipitatie223 Kort samengevat Immunoprecipitatie m.b.v. proteïne A/G-partikels Immunoprecipitatie in gel 223 224 225 ELISA226 Principe226 Ontwikkelen van een ELISA 227 Sandwich ELISA 228 229 Indirecte ELISA Competitieve ELISA 229 Hoofdstuk 7 Moleculaire biologie 233 Polymerase ketting reactie 233 Variaties op PCR 239 Kwantitatieve PCR Recombinant DNA-technologie 241 244 Template DNA 235 Ontwerp de primers 235 Aanmaak van de mastermix 237 PCR-reactie238 Analyse op agarosegel 239 Nested PCR Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR) 239 240 Basisprincipe 244 Vectoren245 Aanmaak van recombinante vectoren 247 Transformatie-transfectie van vectoren 251 Selectie van getransformeerde cellen 253 Selectie van getransfecteerde cellen 258 Te volgen strategie 260 Enkele toepassingen van recombinant DNA-technologie 260 INHOUD Book- Labo 2.indb 9 IX 25/09/14 12:31 Experimentele Vaardigheden Boek II: Biochemische vaardigheden © Academia Press Mutagenese262 Oligonucleotide mismatch mutagenese – site-directed mutagenese 5’ add-on mutagenese 262 264 RACE265 3’ RACE 5’ RACE 265 265 Maken van een genetische bank 266 Genomische bank cDNA bank ANNEX 267 268 269 Aminozuren 270 Nucleotiden 273 Apolaire zijgroepen 270 Polaire, ongeladen zijgroepen 271 Polaire, geladen zijgroepen 272 Peptidebinding273 Basen273 Baseparing274 Bibliografie275 TREFWOORDEN281 X Book- Labo 2.indb 10 INHOUD 25/09/14 12:31
© Copyright 2024 ExpyDoc
