PCR technieken. Op zoek naar twee resisteniegenen

PCR technieken. Op zoek naar twee
resisteniegenen van Solanum
Tuberosum, 6 rassen.
______________________________________________________________
Klas 11A/B/C periode biologie, Rudolf Steinercollege, Haarlem januari 2014.
SAMENVATTING
Bij planten van de familie Solanum is bekend dat zij beschikken over zogenaamde
resistentiegenen tegen Phytophtora Infestans. Deze genen die in hedendaagse cultivars van
aardappelen lijken te zijn verdwenen, zijn nog volop aanwezig in wilde aardappelplanten en
planten van de nachtschadefamilie.
In dit practicum, uitgevoerd door klas11 van het Rudolf Steiner College, Haarlem, worden zes
aardappelrassen getest op de aanwezigheid van twee resistentiegenen. Daarnaast worden deze
uitkomsten vergeleken met de claims van de leverancier van de (poot)aardappelen. Door
bederf van de in de vriezer geconserveerde bladeren van Solanum, bleken bederf een
verstorende factor van belang. Opvallend was dat de verse groenten soms wel response gaven.
INLEIDING
In dit practicum wordt onderzocht of de in
de zes rassen (Doré, Mona Lisa, Mozart,
Texla, Irene en Bio-1 de Resistentiegenen
R1 en R3a aanwezig zijn.
Het resistentie gen R3a is terug te vinden
in de ncbi-database m.b.v URL:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AY8
49382.1 . Resistentiegen R1 wordt
genoemd in een voor scholen ontwikkeld
practicum door de WUR, Wageningen.
Helaas vermeldde men niet de herkomst
van de gebruikte primers.
De leerlingen zijn in dit practicum op zoek
naar de aanwezigheid van deze twee
genen.
METHODEN EN TECHNIEKEN
In dit practicum werd gebruik gemaakt van
de Phire-Plant PCR-mix, code F130.
Hierbij werden 2-3 mm2 grootte samples
van het bladmateriaal van de aardappels in
tabel 1.0 en gecrushd met een losse Finntip in een oplossing van 20 uL DilutionBuffer. Nadat deze buffer min 1 minuut
had ingewerkt, werden deze gevortexted en
bij 15000 rpm gecentrifugeerd.
Van deze samples is 0,6 uL overgenomen
in een nieuw 0.2ml ep waarin
achtereenvolgens is toegevoegd: 8 uL
Dnase-vrij water, 10 uL PCR-buffer
(dNTP's, MgCl2), 0.6 ul DNA-Taqpolymerase en 0,6 uL primeroplossing A
en B (Zie tabel 2.0)
Na opnieuw vortexen en centrifugeren
werden de samples in de PCR-machine
gedaan (Techne Cyclo-gene 9600) en
gerund volgens het protocol opgesteld in
tabel 3.0.
Hierna werd van elk monster 15 uL
genomen en onder toevoeging van 6 uL
loading dye (R631) geladen in een 2%
agarose gel onder toevoeging van 0.6 uL
EtBr opdat het DNA met UV-licht te
detecteren is.
Als controle voor de werkzaamheid is ook
een sample genomen van Afrikaan, onder
toevoeging van de door Phire-Plant
geleverde control-primer die voor
amplificatie zorgt van het chloroplast
DNA.
Aardappelras/
Plantensoort
Doré
Irene
Mona Lisa
Mozart
Texla
Bio-I (Albert Heyn)
Rode Paprika
Tomaat
Resistent volgens
leverancier
nvt
nvt
Tabel 1.0. Gebruikte aardappelrassen en plantensoorten.
Locus
R1WURF
Locus
R1-A
Primer
CAACCCTGGCATGCCACG
Tm*
56.9
R1WURR
R3aF
R1-B
R3-A
CACTCGTGACATATCCTCACT
TGGAAGTAGTAGTGCCGACAA
52.9
54.6
56
R3aR
R3-B
GGAGGACCAACTGCCATAGAA
55.3
Control1
C-A
Control1
C-B
chloroplast
DNA
chloroplast
DNA
Tm
Alleles
??
size
Genbankno
??
1
288 bp
AY849382.1
56
1
288 bp
AY849382.1
AGTTCGAGCCTGATTATCCC
62
1
297 bp
GCATGCCGCCAGCGTTCATC
62
1
297 bp
Tabel 2.0, Primers gebruikt in dit practicum
PCR programma 20:
fase 1:
15 min 98 oC
fase 2:
30 sec 98 oC
30 sec 51 oC (Volgens literatuur)
60 sec 72 oC
herhaal hierna nog 39 X
fase 3:
5 min op 72 oC
Tabel 3.0, PCR-instellingen
nummer
Namen
letter
1e test
2e test
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Marieke/ Simme
Dries / Paul
Lucas/ Hessel
Luka / Iris
Ragna / Veerle
Fleur / Hannah de G
Joy / Nienke
Christian / Jente
Gioja / Gianluca
Koen / Helge
Marjet / Tessa
Irina / Hannah
Suzan / Marie
A
B
C
D
E
F
G
H
K
L
M
N
P
Mona L R1
Doré R1
Doré R1
Irene R3
Irene R1
Doré R3
Mozart R1
Texla R1
Mona L. R3
Texla R1
Mozart R1
Bio R1
Tomaat R1
Mozart R1
Irene R1
Doré R3
Mozart R3
Mona L R3
Irene R3
Mona L. R1
Texla R3
Mozart R3
Texla R3
Doré R3
Tomaat R3
Tomaat R3
Tabel 4.0 Groepen leerlingen en hun plant-keuzen + resultaten
Gen aanw.
1e test
Gen aanw.
2e test
Claim?
RESULTATEN
De resultaten zijn gegroepeerd rond de runs van de electroforese. Hierbij is gebruik gemaakt
van de lettercodering van de leerlingen. Voor de controle is een extra dubbele serie
meegenomen waarbij de begeleidend docent een duplobepaling heeft uitgevoerd op de beide
primers t.a.v.Irene, Mona Lisa, Mozart, Texla, Bio-1 en de planten "rode paprika" en Afrikaan
(controle). Deze controle is ná het practicum uitgevoerd met hetzelfde (rest) bladmateriaal als
dat de leerlingen hebben gebruikt.
1e run , 1e/2e rij (controle-reeks)
lane
Resultaat
1
3
control
Irene
afrikaan
R1
Mona Lisa
R1
nop
nop
nop
lane
10
control
Resultaat
2
11
Irene
4
ruler
12
afrikaan
R3a
Mona Lisa
R3a
nop
ca 300bp
nop
5
7
8
9
17
18
Mozart R1
Texla R1
Bio-1 R1
Rode
Paprika R1
nop
nop
nop
nop
13
ruler
6
14
15
16
Mozart R3a
Texla R3a
Bio-1 R3a
Rode
Paprika R3a
nop
nop
ca 300 bp
ca 300 bp
Tabel 5.0
2e run , 1e/2e rij Leerlingresultaten
lane
1
2
3
Mona R1
Mozart R1
Doré R1
Wie
A1
A2
Resultaat
nop
nop
lane
10
4
6
7
8
9
Irene R1
Doré R1
Doré R3
Irene R3
Mozart R3
B1
B2
C1
C2
D1
D2
nop
nop
nop
nop
nop
nop
11
ruler
5
12
Irene R1
Mona R3
Doré R3
Wie
E1
E2
Resultaat
300 bp
nop
13
ruler
14
15
16
17
18
Irene R1
Mozart R1
Texla R1
Texla R3
?
F1
F2
G1
H2
H1
A3
nop
nop
nop
nop
nop
nop
Tabel 6.0
3e run , 1e/2e rij Leerlingresultaten
lane
Wie
Resultaat
1
2
3
Mona R3
Mozart R3
K1
300 bp
4
ruler
5
6
7
8
9
Texla R1
Texla R3
Mozart R1
Doré R3
Bio R1
K2
L1
L2
M1
M2
N1
300 bp
nop
nop
nop
300 bp
nop
lane
10
11
12
Tomaat R3
Tomaat R1
Tomaat R3
Wie
N2
P1
P2
Resultaat
300 bp
nop
nop
13
14
15
16
17
ruler
Tabel 7.0
FOTO-MATERIAAL AGAROSE-GEL
Controle 1:
Controle 2:
Uit deze resultaten blijkt dat alleen Bio-1-R3a een reactie geeft en Rode Paprika., Ook Irene
R3 laat nog een vaag bandje zien dat op de foto nauwelijks waarneembaar is, maar op de gel
wel.
18
Run 1 en 2: Groepen A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2
Run 1 en 1: Groepen E2, E1 F1, F2, G1, H2, H1, A3 (let opafwijkende volgorde door
verkeerd laden)
Run 3 en 4: Groepen K1, K2, L1, L2, M1, M2, N1
Response op K1, K2, M2(vaag), allen ca 300bp.
Run 3 en 4: Groepen N, P
Response op N2,ca 300bp.
OVERZICHT RESULTATEN
Onderstaande tabel toont de verzamelde resultaten van de geteste aardappelrassen en enkele
planten.
Plant/Ras
R1 aanwezig
R3a aanwezig
Resistentie
Doré
Afwezig (afwijkend) Aanwezig (vaag)
Vrij gevoelig
Irene
Aanwezig
Aanwezig (confirm) matig vatbaar
(afwijkend)
Mona Lisa
Afwezig (confirm)
Aanwezig (confirm) redelijk resistent
Mozart
Afwezig (afwijkend) Aanwezig (confirm) weinig vatbaar
Texla
Afwezig (afwijkend) Afwezig (afwijkend) volledig resistent
Bio-1
Afwezig
Aanwezig
onbekend
Tomaat
Afwezig (confirm)
Aanwezig (confirm) nvt
Rode paprika
Afwezig
Aanwezig
nvt
Tabel 8.0. Totaal overzicht resultaten
Eerder in juli 2013 deed ik dezelfde proef als jullie met exact dezelfde spullen en
protocollen…
Alleen was het bladmateriaal wel vers van het land!
en de tweede ronde:
Voor alle duidelijkheid: Control betekent dat een primer gebruikt is die een stukje DNA
versterkt dat in ALLE planten aanwezig is. Je test hiermee de validiteit van je procedures,
chemicalien en protocollen. Als die het doen, weet je dat de proefuitvoering geen bron kan
zijn van afwijkende resultaten.
Gegevens van de leverancier: Zaadhandel vd Wal:
https://www.zaadhandelvanderwal.nl/nl/shop/pootaardappelen
DORE
Artikelnummer: 7012
Geelschillige aardappel, vroeg afrijpend. Rondovaal van vorm. Middelmatig kooktype en vrij phythophtora
gevoelig.
IRENE
Artikelnummer: 7085
Roodschillige aardappel, laat tot zeer laat afrijpend. Rond van vorm. Zeer los kooktype en matig vatbaar voor
phythophtora. Prima bewaaraardappel.
MONA LISA
Artikelnummer: 7048
Monalisa is een geelschillige consumptie aardappel met zuiver geel vlees. Is vast in de kook en heeft een hele
fijne smaak. Bovendien verkleurt Mona Lisa niet na het koken. Is een middelvroegras dat in juni al een goede
opbrengst geeft. De knollen zijn langovaal en uniform van vorm en vlakogig. Hoge opbrengst met een redelijke
resistentie van phythophtora in de knol.
MOZART
Artikelnummer: 7066
Goede opbrengst, goede schurftresistentie, weinig blauwgevoelig, goede kookkwaliteit, goede bewaarbaarheid.
Weinig vatbaar voor phythopftora in zowel loof als knol.
TEXLA AM volledig resistent phytophtora
Artikelnummer: 7081
Roodschillige aardappel, laat afrijpend. Rond van vorm. Middelmatig kooktype. Volledig resistent tegen
phythophtora. Niet geschikt voor kleigrond en niet zwaar bemesten. Prima bewaaraardappel.
CONCLUSIE
Op basis van deze experimenten die nu gehouden zijn valt snel op dat alleen de 'verse'
groenten een betere response geven. Blijkbaar zijn de aardappelbladeren die in de vriezer
lagen bij -17 graden toch deels kapot gemaakt door het vriesproces.
De biologische aardappel lijkt over het R3a gen te beschikken. Het R1 gen is afwezig.
Uit resultaten van hetzelfde onderzoek eerder in 2013, blijken de aardappels te verschillen in
response op deze test. Uit die test bleek dat van algemene geldigheid (nog) geen sprake was.
Er was geen overeenstemming tussen de geclaimde resistentie en de gedetecteerde
aanwezigheid van resistentiegenen.
Voorts zullen ook mogelijk pipetteerfouten zijn voorgekomen, naast vergeten primers.
Vooralsnog lijkt de vriesschade de grootste boosdoener. Volgende experimenten dus alleen
met vers materiaal!
Bijlage 1. Protocollen
1.
Het maken van de gel:
1.
25 ml 10X TBE buffer
2.
Voeg toe tot 250 ml met auqadest
3.
Hiervan 80 ml genomen voor de gel. Toevoegen 1,6 gr agarose (2%)
4.
45 sec magnetron -> swirl -> 45sec magn. -> swirl-> 30 sec magn.
5.
Cool down
6.
6 uL EtBr erbij (vanuit 1% flesje)
8.
Als de zaak gestold is: Overgieten met de rest van de buffer.
9.
Totaal zit erin de bak 300-350 ml TBE buffer met dezelfde concentratie
3.
DILUTED: Per solanum-materiaal:
1.
0.2 epje
2.
20 uL Dilutionbuffer
3.
Crush 2 mm2 met pipetpunt.
4.
vortex kort 10 sec
5.
centrifuge 30 sec
6.
Laat even staan 2 min.
7.
Neem 0.6 uL supernatant.
8.
0.2 epje
9.
10 uL PCR buffer
10.
0.6 uL primermengsel
11.
0.5 uL Polymerase
12.
voeg die 0.5 uL supernatant toe.
13.
Vul met water aan tot 20 uL
13.
vortex en centrifugeer beide kort ca 20 sec.
13.
Laat 30 min staan.
4.
5.
DNA 50 bp Ladder:
1.
Neem 0.2 ml epje
2.
Voeg 3.0 uL DNA-ladder toe
3.
Voeg 3.0 uL Loading dye toe #R0631
4.
Voeg nog 12 ml H2O toe. Samen 18 uL Is meer dan genoeg voor één gel.
6.
1.
Gel electroforese
Nadat de PCR klaar is, wordt van de epjes 1 tm 8 15 uL genomen en toevoegen 5 uL
loading dye. Vortex en centrifuge kort.
2.
Laden van 15 uL van elk monster in de gel:
Voorstel: 1e run
lane
3.
4.
1
control+
afrikaan
2
TEXLA
R3a
3
TEXLA
R1
4
ruler
5
Mozart
R3a
6
Mozart
R1
7
Doré
R3a
o
ruler 2: #R0631 + 50 bp ladder.
o
25 Ul primer: dit is de primersterkte die Phireplant aanraadt
eerste 10 min op 50 Volt
Daarnaa op 100 Volt tbv betere scheiding.
Bijlage 2 : RESULTATEN juli 2013
8
Doré
R1
9
control
TEXLA
RONDE 1
Uit de eerste run blijkt dat alle primers reageren.
De foto van de gel laat duidelijk zijn dat de R1 primer's en de R3a primers het beide doen. De
R1primers zijn afkomstig van een practicum voor scholen. Men vermeldde daar het gebruik
van deze primers. De R3a-primers zijn zelf ontworpen aan de hand van een -late-blight-genopgezocht in de ncbi-database.
Figuur 1.0 DNA-gel (2%) van drie aardappelrassen getest op resistentiegenen R1 en R3a.
Enkele opmerkingen bij deze gel:
1.
Lane1: Afrikaan control. Hier is de control-primer gebruikt van de kit van Phireplant.
Resultaat zeer goed en matchend met de data op de kit-informatie. Ik weet inmiddels
na vier keer gebruiken dat het DNA van Afrikaantjes zeer goed reageren op deze
primers.
2.
Lane2/Lane 3: Beide wordt hier het aardappelras Texla getest op aanwezigheid van
R3a en R1 genen. In beide gevallen een (vaag) bandje.
3.
Lane 5,6: Aardappelras Mozart eveneens getest op R3a en R1: Ook beide positief.
4.
Lane 7,8: Aardappelras Doré laat een heldere band zien voor R3a en een heel vaag
bandje vér boven de 1300 bp (cirkel).
5.
In lane 8 is ook de nodige smear te zien.
6.
Mozart getest op de control-primer van Phire-plant: geeft twee bandjes. Eén geschat
rond de 300 en de ander ca 280-250.
RONDE 2
In deze ronde zijn de aardappels Mona Lisa en Irene getest. Daarnaast is ook (uit
nieuwsgierigheid) gekeken of de R1 en R3a primers ook resultaat geven bij Tomaat.
2e run
lane
1
Irene
R3a
2
Irene
R1
3
Mona Lisa
R3a
4
Mona Lisa
R1
5
ruler
6
Tomaat
R3a
7
Tomaat
R1
8
Irene
Control
9
MonaLisa
Control
Lane1: Reageert wel
Lane 2: niet
Lane 3: wel
Lane 4: niet
Lane 6: wel????
Lane 7: Niet
Lane 8: wel
Lane 9: wel.
1.
2.
3.
4.
De controlprimers werken dus ook op de twee aardappelrassen Irene en MonaLisa
Bij Tomaat is blijkbaar ook een R3a gen aanwezig. Bijzonder.
Het R1-gen lijkt bij Irene afwezig!
Het R1gen is bij MonaLisa ook afwezig.
Samenvattend:
We hebben blad van:
a)
Texla
(een laat ras dat volledig resistent wordt genoemd)
b)
Mona Lisa
(een laat ras dat resistent genoemd wordt tegen phytophtera)
c)
Mozart
(een laat ras dat resistent genoemd wordt tegen phytophtera)
d)
Doré
(een vroeg aardappel ras dat phytophtera gevoelig is)
e)
Irene
(een laat ras dat matig vatbaar is voor phytophtera)
Ras
Resistent vermeld
R3a gen
R1 gen
Texla
volledig
Ja
twijfel
Mona Lisa
redelijk
Ja
Nee
Mozart
redelijk
Ja
Ja
Doré
niet
Ja
Ja
Irene
niet
Ja
Nee

Download Report