PCR technieken. Op zoek naar twee resisteniegenen van Solanum Tuberosum, 6 rassen. ______________________________________________________________ Klas 11A/B/C periode biologie, Rudolf Steinercollege, Haarlem januari 2014. SAMENVATTING Bij planten van de familie Solanum is bekend dat zij beschikken over zogenaamde resistentiegenen tegen Phytophtora Infestans. Deze genen die in hedendaagse cultivars van aardappelen lijken te zijn verdwenen, zijn nog volop aanwezig in wilde aardappelplanten en planten van de nachtschadefamilie. In dit practicum, uitgevoerd door klas11 van het Rudolf Steiner College, Haarlem, worden zes aardappelrassen getest op de aanwezigheid van twee resistentiegenen. Daarnaast worden deze uitkomsten vergeleken met de claims van de leverancier van de (poot)aardappelen. Door bederf van de in de vriezer geconserveerde bladeren van Solanum, bleken bederf een verstorende factor van belang. Opvallend was dat de verse groenten soms wel response gaven. INLEIDING In dit practicum wordt onderzocht of de in de zes rassen (Doré, Mona Lisa, Mozart, Texla, Irene en Bio-1 de Resistentiegenen R1 en R3a aanwezig zijn. Het resistentie gen R3a is terug te vinden in de ncbi-database m.b.v URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AY8 49382.1 . Resistentiegen R1 wordt genoemd in een voor scholen ontwikkeld practicum door de WUR, Wageningen. Helaas vermeldde men niet de herkomst van de gebruikte primers. De leerlingen zijn in dit practicum op zoek naar de aanwezigheid van deze twee genen. METHODEN EN TECHNIEKEN In dit practicum werd gebruik gemaakt van de Phire-Plant PCR-mix, code F130. Hierbij werden 2-3 mm2 grootte samples van het bladmateriaal van de aardappels in tabel 1.0 en gecrushd met een losse Finntip in een oplossing van 20 uL DilutionBuffer. Nadat deze buffer min 1 minuut had ingewerkt, werden deze gevortexted en bij 15000 rpm gecentrifugeerd. Van deze samples is 0,6 uL overgenomen in een nieuw 0.2ml ep waarin achtereenvolgens is toegevoegd: 8 uL Dnase-vrij water, 10 uL PCR-buffer (dNTP's, MgCl2), 0.6 ul DNA-Taqpolymerase en 0,6 uL primeroplossing A en B (Zie tabel 2.0) Na opnieuw vortexen en centrifugeren werden de samples in de PCR-machine gedaan (Techne Cyclo-gene 9600) en gerund volgens het protocol opgesteld in tabel 3.0. Hierna werd van elk monster 15 uL genomen en onder toevoeging van 6 uL loading dye (R631) geladen in een 2% agarose gel onder toevoeging van 0.6 uL EtBr opdat het DNA met UV-licht te detecteren is. Als controle voor de werkzaamheid is ook een sample genomen van Afrikaan, onder toevoeging van de door Phire-Plant geleverde control-primer die voor amplificatie zorgt van het chloroplast DNA. Aardappelras/ Plantensoort Doré Irene Mona Lisa Mozart Texla Bio-I (Albert Heyn) Rode Paprika Tomaat Resistent volgens leverancier nvt nvt Tabel 1.0. Gebruikte aardappelrassen en plantensoorten. Locus R1WURF Locus R1-A Primer CAACCCTGGCATGCCACG Tm* 56.9 R1WURR R3aF R1-B R3-A CACTCGTGACATATCCTCACT TGGAAGTAGTAGTGCCGACAA 52.9 54.6 56 R3aR R3-B GGAGGACCAACTGCCATAGAA 55.3 Control1 C-A Control1 C-B chloroplast DNA chloroplast DNA Tm Alleles ?? size Genbankno ?? 1 288 bp AY849382.1 56 1 288 bp AY849382.1 AGTTCGAGCCTGATTATCCC 62 1 297 bp GCATGCCGCCAGCGTTCATC 62 1 297 bp Tabel 2.0, Primers gebruikt in dit practicum PCR programma 20: fase 1: 15 min 98 oC fase 2: 30 sec 98 oC 30 sec 51 oC (Volgens literatuur) 60 sec 72 oC herhaal hierna nog 39 X fase 3: 5 min op 72 oC Tabel 3.0, PCR-instellingen nummer Namen letter 1e test 2e test 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Marieke/ Simme Dries / Paul Lucas/ Hessel Luka / Iris Ragna / Veerle Fleur / Hannah de G Joy / Nienke Christian / Jente Gioja / Gianluca Koen / Helge Marjet / Tessa Irina / Hannah Suzan / Marie A B C D E F G H K L M N P Mona L R1 Doré R1 Doré R1 Irene R3 Irene R1 Doré R3 Mozart R1 Texla R1 Mona L. R3 Texla R1 Mozart R1 Bio R1 Tomaat R1 Mozart R1 Irene R1 Doré R3 Mozart R3 Mona L R3 Irene R3 Mona L. R1 Texla R3 Mozart R3 Texla R3 Doré R3 Tomaat R3 Tomaat R3 Tabel 4.0 Groepen leerlingen en hun plant-keuzen + resultaten Gen aanw. 1e test Gen aanw. 2e test Claim? RESULTATEN De resultaten zijn gegroepeerd rond de runs van de electroforese. Hierbij is gebruik gemaakt van de lettercodering van de leerlingen. Voor de controle is een extra dubbele serie meegenomen waarbij de begeleidend docent een duplobepaling heeft uitgevoerd op de beide primers t.a.v.Irene, Mona Lisa, Mozart, Texla, Bio-1 en de planten "rode paprika" en Afrikaan (controle). Deze controle is ná het practicum uitgevoerd met hetzelfde (rest) bladmateriaal als dat de leerlingen hebben gebruikt. 1e run , 1e/2e rij (controle-reeks) lane Resultaat 1 3 control Irene afrikaan R1 Mona Lisa R1 nop nop nop lane 10 control Resultaat 2 11 Irene 4 ruler 12 afrikaan R3a Mona Lisa R3a nop ca 300bp nop 5 7 8 9 17 18 Mozart R1 Texla R1 Bio-1 R1 Rode Paprika R1 nop nop nop nop 13 ruler 6 14 15 16 Mozart R3a Texla R3a Bio-1 R3a Rode Paprika R3a nop nop ca 300 bp ca 300 bp Tabel 5.0 2e run , 1e/2e rij Leerlingresultaten lane 1 2 3 Mona R1 Mozart R1 Doré R1 Wie A1 A2 Resultaat nop nop lane 10 4 6 7 8 9 Irene R1 Doré R1 Doré R3 Irene R3 Mozart R3 B1 B2 C1 C2 D1 D2 nop nop nop nop nop nop 11 ruler 5 12 Irene R1 Mona R3 Doré R3 Wie E1 E2 Resultaat 300 bp nop 13 ruler 14 15 16 17 18 Irene R1 Mozart R1 Texla R1 Texla R3 ? F1 F2 G1 H2 H1 A3 nop nop nop nop nop nop Tabel 6.0 3e run , 1e/2e rij Leerlingresultaten lane Wie Resultaat 1 2 3 Mona R3 Mozart R3 K1 300 bp 4 ruler 5 6 7 8 9 Texla R1 Texla R3 Mozart R1 Doré R3 Bio R1 K2 L1 L2 M1 M2 N1 300 bp nop nop nop 300 bp nop lane 10 11 12 Tomaat R3 Tomaat R1 Tomaat R3 Wie N2 P1 P2 Resultaat 300 bp nop nop 13 14 15 16 17 ruler Tabel 7.0 FOTO-MATERIAAL AGAROSE-GEL Controle 1: Controle 2: Uit deze resultaten blijkt dat alleen Bio-1-R3a een reactie geeft en Rode Paprika., Ook Irene R3 laat nog een vaag bandje zien dat op de foto nauwelijks waarneembaar is, maar op de gel wel. 18 Run 1 en 2: Groepen A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2 Run 1 en 1: Groepen E2, E1 F1, F2, G1, H2, H1, A3 (let opafwijkende volgorde door verkeerd laden) Run 3 en 4: Groepen K1, K2, L1, L2, M1, M2, N1 Response op K1, K2, M2(vaag), allen ca 300bp. Run 3 en 4: Groepen N, P Response op N2,ca 300bp. OVERZICHT RESULTATEN Onderstaande tabel toont de verzamelde resultaten van de geteste aardappelrassen en enkele planten. Plant/Ras R1 aanwezig R3a aanwezig Resistentie Doré Afwezig (afwijkend) Aanwezig (vaag) Vrij gevoelig Irene Aanwezig Aanwezig (confirm) matig vatbaar (afwijkend) Mona Lisa Afwezig (confirm) Aanwezig (confirm) redelijk resistent Mozart Afwezig (afwijkend) Aanwezig (confirm) weinig vatbaar Texla Afwezig (afwijkend) Afwezig (afwijkend) volledig resistent Bio-1 Afwezig Aanwezig onbekend Tomaat Afwezig (confirm) Aanwezig (confirm) nvt Rode paprika Afwezig Aanwezig nvt Tabel 8.0. Totaal overzicht resultaten Eerder in juli 2013 deed ik dezelfde proef als jullie met exact dezelfde spullen en protocollen… Alleen was het bladmateriaal wel vers van het land! en de tweede ronde: Voor alle duidelijkheid: Control betekent dat een primer gebruikt is die een stukje DNA versterkt dat in ALLE planten aanwezig is. Je test hiermee de validiteit van je procedures, chemicalien en protocollen. Als die het doen, weet je dat de proefuitvoering geen bron kan zijn van afwijkende resultaten. Gegevens van de leverancier: Zaadhandel vd Wal: https://www.zaadhandelvanderwal.nl/nl/shop/pootaardappelen DORE Artikelnummer: 7012 Geelschillige aardappel, vroeg afrijpend. Rondovaal van vorm. Middelmatig kooktype en vrij phythophtora gevoelig. IRENE Artikelnummer: 7085 Roodschillige aardappel, laat tot zeer laat afrijpend. Rond van vorm. Zeer los kooktype en matig vatbaar voor phythophtora. Prima bewaaraardappel. MONA LISA Artikelnummer: 7048 Monalisa is een geelschillige consumptie aardappel met zuiver geel vlees. Is vast in de kook en heeft een hele fijne smaak. Bovendien verkleurt Mona Lisa niet na het koken. Is een middelvroegras dat in juni al een goede opbrengst geeft. De knollen zijn langovaal en uniform van vorm en vlakogig. Hoge opbrengst met een redelijke resistentie van phythophtora in de knol. MOZART Artikelnummer: 7066 Goede opbrengst, goede schurftresistentie, weinig blauwgevoelig, goede kookkwaliteit, goede bewaarbaarheid. Weinig vatbaar voor phythopftora in zowel loof als knol. TEXLA AM volledig resistent phytophtora Artikelnummer: 7081 Roodschillige aardappel, laat afrijpend. Rond van vorm. Middelmatig kooktype. Volledig resistent tegen phythophtora. Niet geschikt voor kleigrond en niet zwaar bemesten. Prima bewaaraardappel. CONCLUSIE Op basis van deze experimenten die nu gehouden zijn valt snel op dat alleen de 'verse' groenten een betere response geven. Blijkbaar zijn de aardappelbladeren die in de vriezer lagen bij -17 graden toch deels kapot gemaakt door het vriesproces. De biologische aardappel lijkt over het R3a gen te beschikken. Het R1 gen is afwezig. Uit resultaten van hetzelfde onderzoek eerder in 2013, blijken de aardappels te verschillen in response op deze test. Uit die test bleek dat van algemene geldigheid (nog) geen sprake was. Er was geen overeenstemming tussen de geclaimde resistentie en de gedetecteerde aanwezigheid van resistentiegenen. Voorts zullen ook mogelijk pipetteerfouten zijn voorgekomen, naast vergeten primers. Vooralsnog lijkt de vriesschade de grootste boosdoener. Volgende experimenten dus alleen met vers materiaal! Bijlage 1. Protocollen 1. Het maken van de gel: 1. 25 ml 10X TBE buffer 2. Voeg toe tot 250 ml met auqadest 3. Hiervan 80 ml genomen voor de gel. Toevoegen 1,6 gr agarose (2%) 4. 45 sec magnetron -> swirl -> 45sec magn. -> swirl-> 30 sec magn. 5. Cool down 6. 6 uL EtBr erbij (vanuit 1% flesje) 8. Als de zaak gestold is: Overgieten met de rest van de buffer. 9. Totaal zit erin de bak 300-350 ml TBE buffer met dezelfde concentratie 3. DILUTED: Per solanum-materiaal: 1. 0.2 epje 2. 20 uL Dilutionbuffer 3. Crush 2 mm2 met pipetpunt. 4. vortex kort 10 sec 5. centrifuge 30 sec 6. Laat even staan 2 min. 7. Neem 0.6 uL supernatant. 8. 0.2 epje 9. 10 uL PCR buffer 10. 0.6 uL primermengsel 11. 0.5 uL Polymerase 12. voeg die 0.5 uL supernatant toe. 13. Vul met water aan tot 20 uL 13. vortex en centrifugeer beide kort ca 20 sec. 13. Laat 30 min staan. 4. 5. DNA 50 bp Ladder: 1. Neem 0.2 ml epje 2. Voeg 3.0 uL DNA-ladder toe 3. Voeg 3.0 uL Loading dye toe #R0631 4. Voeg nog 12 ml H2O toe. Samen 18 uL Is meer dan genoeg voor één gel. 6. 1. Gel electroforese Nadat de PCR klaar is, wordt van de epjes 1 tm 8 15 uL genomen en toevoegen 5 uL loading dye. Vortex en centrifuge kort. 2. Laden van 15 uL van elk monster in de gel: Voorstel: 1e run lane 3. 4. 1 control+ afrikaan 2 TEXLA R3a 3 TEXLA R1 4 ruler 5 Mozart R3a 6 Mozart R1 7 Doré R3a o ruler 2: #R0631 + 50 bp ladder. o 25 Ul primer: dit is de primersterkte die Phireplant aanraadt eerste 10 min op 50 Volt Daarnaa op 100 Volt tbv betere scheiding. Bijlage 2 : RESULTATEN juli 2013 8 Doré R1 9 control TEXLA RONDE 1 Uit de eerste run blijkt dat alle primers reageren. De foto van de gel laat duidelijk zijn dat de R1 primer's en de R3a primers het beide doen. De R1primers zijn afkomstig van een practicum voor scholen. Men vermeldde daar het gebruik van deze primers. De R3a-primers zijn zelf ontworpen aan de hand van een -late-blight-genopgezocht in de ncbi-database. Figuur 1.0 DNA-gel (2%) van drie aardappelrassen getest op resistentiegenen R1 en R3a. Enkele opmerkingen bij deze gel: 1. Lane1: Afrikaan control. Hier is de control-primer gebruikt van de kit van Phireplant. Resultaat zeer goed en matchend met de data op de kit-informatie. Ik weet inmiddels na vier keer gebruiken dat het DNA van Afrikaantjes zeer goed reageren op deze primers. 2. Lane2/Lane 3: Beide wordt hier het aardappelras Texla getest op aanwezigheid van R3a en R1 genen. In beide gevallen een (vaag) bandje. 3. Lane 5,6: Aardappelras Mozart eveneens getest op R3a en R1: Ook beide positief. 4. Lane 7,8: Aardappelras Doré laat een heldere band zien voor R3a en een heel vaag bandje vér boven de 1300 bp (cirkel). 5. In lane 8 is ook de nodige smear te zien. 6. Mozart getest op de control-primer van Phire-plant: geeft twee bandjes. Eén geschat rond de 300 en de ander ca 280-250. RONDE 2 In deze ronde zijn de aardappels Mona Lisa en Irene getest. Daarnaast is ook (uit nieuwsgierigheid) gekeken of de R1 en R3a primers ook resultaat geven bij Tomaat. 2e run lane 1 Irene R3a 2 Irene R1 3 Mona Lisa R3a 4 Mona Lisa R1 5 ruler 6 Tomaat R3a 7 Tomaat R1 8 Irene Control 9 MonaLisa Control Lane1: Reageert wel Lane 2: niet Lane 3: wel Lane 4: niet Lane 6: wel???? Lane 7: Niet Lane 8: wel Lane 9: wel. 1. 2. 3. 4. De controlprimers werken dus ook op de twee aardappelrassen Irene en MonaLisa Bij Tomaat is blijkbaar ook een R3a gen aanwezig. Bijzonder. Het R1-gen lijkt bij Irene afwezig! Het R1gen is bij MonaLisa ook afwezig. Samenvattend: We hebben blad van: a) Texla (een laat ras dat volledig resistent wordt genoemd) b) Mona Lisa (een laat ras dat resistent genoemd wordt tegen phytophtera) c) Mozart (een laat ras dat resistent genoemd wordt tegen phytophtera) d) Doré (een vroeg aardappel ras dat phytophtera gevoelig is) e) Irene (een laat ras dat matig vatbaar is voor phytophtera) Ras Resistent vermeld R3a gen R1 gen Texla volledig Ja twijfel Mona Lisa redelijk Ja Nee Mozart redelijk Ja Ja Doré niet Ja Ja Irene niet Ja Nee
© Copyright 2024 ExpyDoc