Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen
Academiejaar 2013 - 2014
Karakterisering, pathogeniteit en chemische bestrijding
van Rhizoctonia spp.
Sofie Venneman
Promotor: Prof. dr. ir. Geert Haesaert
Copromotoren: Dr. ir. Kris Audenaert & Dr. Betty Heremans
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van
Master of Science in de biowetenschappen: landbouwkunde
Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen
Academiejaar 2013 - 2014
Karakterisering, pathogeniteit en chemische bestrijding
van Rhizoctonia spp.
Sofie Venneman
Promotor: Prof. dr. ir. Geert Haesaert
Copromotoren: Dr. ir. Kris Audenaert & Dr. Betty Heremans
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van
Master of Science in de biowetenschappen: landbouwkunde
“De auteur en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te
stellen en delen van de scriptie te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt
onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de
verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze
scriptie.”
Woord vooraf
Het schrijven van een thesis is een hele opgave. Ik heb ondervonden dat het heel wat tijd,
energie en vooral geduld vraagt. Gelukkig kon ik gedurende deze periode rekenen op de
steun van enkele mensen. Deze mensen wil ik enorm bedanken want zonder hen was deze
thesis er waarschijnlijk nooit geweest.
Vooreerst wil ik mijn promotor Prof. dr. ir. Geert Haesaert bedanken die me de kans gegeven
heeft dit onderzoek te doen en bij wie ik steeds terecht kon met al mijn vragen. Ook aan
copromotor Dr. Betty Heremans dankuwel voor de begeleiding en het nalezen van mijn
thesis.
Het voorbije jaar was het labo bijna mijn tweede thuis en ook hier kreeg ik veel hulp. Daarom
een woord van dank aan het personeel van de proefhoeve te Bottelare, in het bijzonder Bart
Pycke, Jasper Carrette en Kevin Dewitte. Jullie hebben mij vooral gedurende de moeilijke
eerste maanden veel bijgeleerd en geholpen met het labowerk. Natuurlijk ook een
welgemeende merci aan het personeel in de labo’s op campus Schoonmeersen.
Verder wil ik het bedrijf Syngenta nog bedanken voor het mogelijk maken van dit onderzoek
en het leveren van het product.
Eveneens een bijzonder woord van dank aan de persoon zonder wie het praktisch werk van
deze thesis niet mogelijk was, namelijk Dr. ir. Kris Audenaert. Ondanks zijn drukke agenda
stond hij steeds klaar om mij te begeleiden. Dankzij hem heb ik heel veel zaken bijgeleerd
over moleculaire analyse technieken en plant pathologie, maar ook over microscopie en
statistiek. Al deze kennis zal zeker ook in mijn verdere carrière te pas komen.
Om af te sluiten wil ik natuurlijk ook mijn vrienden en familie bedanken en vooral mijn zus
Jolien. Ik kon steeds op haar rekenen indien ik vragen had of met een probleem zat, ook
stond ze steeds klaar om te luisteren naar mijn gezaag als het even lastig werd.
Sofie Venneman
Melle, juni 2014
Abstract
Rhizoctonia disease is caused by the common soil-borne pathogenic fungi belonging to the
genus Rhizoctonia. This genus represents some of the most economically important plant
pathogenic fungi in agricultural and horticultural crops. The main fungus is Rhizoctonia
solani, which consists of 13 different anastomosis groups (AG), each having its specific host
plants. This implies that the host range of Rhizoctonia spp. is very wide and consists of a
large number of crops, sugar beet and potatoes in particular. However recently, the disease
in cereals is also an emerging problem.
The first part of this study describes the diversity of Rhizoctonia in agricultural crops
throughout Flanders. The main focus was wheat, but also samples from potatoes, sugar beet
and maize were examined. The sequencing results show that only 7.5 % of the isolated fungi
belong to the genus Rhizoctonia.
The second aim was to examine the sensitivity of wheat in relation to the various Rhizoctonia
isolates using germination tests. First, the results show that isolates belonging to the same
anastomosis group sometimes differ significantly in their aggressiveness towards wheat.
Further, isolates 1 and 9 -both AG 4 HG I- have a strong negative influence on the
germination and growth of wheat, which was also the case for the binucleate Rhizoctonia
isolate 14 AG F. However, isolate 6 (AG 4 HG II) and isolates 7 and 11 (both AG 2-1) do not
appear to be aggressive.
Finally, the sensitivity of a selection of isolates to the active substance sedaxane was tested.
This fungicide was tested in three doses, 1, 2 and 4 liters sedaxane per ton of seed. In
general, the seed treatment with sedaxane has a positive effect on various germination
parameters, being germination percentage, number of roots, root length, root infection,
hypocotyl length and hypocotyl infection. This positive effect is most distinct for the
aggressive isolates and for the parameter root damage, which is very important for a good
germination and development.
Concerning the dose of the active substance sedaxane, the usual dose of 2 liters per ton
appears to be most suited.
Keywords : Rhizoctonia solani AG 4 HG I, AG 4 HG II, AG 3, AG 5, AG 1 - 1C, AG 2-1,
AG F, R. oryzae, R. cerealis, anastomosis group, sedaxane
Samenvatting
Rhizoctonia-ziekte wordt veroorzaakt door de vaak voorkomende bodemgebonden
pathogene schimmels die behoren tot het genus Rhizoctonia. Dit genus vertegenwoordigt
een aantal van de economisch belangrijkste plant pathogene schimmels die wereldwijd
verspreid zijn in de intensieve land- en tuinbouwteelt. Het genus Rhizoctonia, met als
belangrijkste vertegenwoordiger
Rhizoctonia
solani,
bestaat
uit
verschillende
anastomosegroepen en elke groep heeft zijn specifieke waardplanten. De
waardplantenreeks van Rhizoctonia spp. is dus zeer breed en bestaat uit een groot aantal
akkerbouwgewassen, zoals vooral aardappelen en suikerbiet. Maar ook in granen duiken er
de laatste jaren steeds meer problemen op met Rhizoctonia.
Het eerste luik van dit onderzoek bestond uit het in kaart brengen van de diversiteit van
Rhizoctonia in landbouwgewassen verspreid over Vlaanderen. Hierbij werd vooral gefocust
op tarwe, maar ook stalen afkomstig van aardappelen, suikerbieten en maïs werden
onderzocht. Hieruit blijkt dat slechts een percentage van 7,5 % van de gesequeneerde
isolaten tot het genus Rhizoctonia behoort en de bodemschimmel dus niet veel aanwezig is.
In het tweede deel werd vervolgens nagegaan wat de gevoeligheid is van tarwe t.o.v. de
verschillende Rhizoctonia isolaten m.b.v. kiemingstesten. Vooreerst kon men uit
bovenstaande proeven afleiden dat isolaten die behoren tot dezelfde anastomosegroep
soms significant van elkaar verschillen. Verder blijken isolaten 1 en 9 -beide AG 4 HG I- een
sterk negatieve invloed te hebben op de kieming en ontwikkeling van tarwe en hetzelfde
geldt voor het binucleate Rhizoctonia isolaat 14, AG F. Isolaat 6 (AG 4 HG II) en isolaten 7
en 11 (beide AG 2 – 1) blijken daarentegen niet agressief te zijn.
Tot slot werd voor een selectie van de isolaten de gevoeligheid aan de actieve stof sedaxane
nagegaan. Deze fungicide werd getest in drie dosissen, namelijk 1,2 en 4 liter sedaxane per
ton zaad. Men kan in het algemeen besluiten dat de zaadontsmetting een positief effect heeft
op de verschillende parameters, namelijk kieming, het aantal wortels, de wortellengte, de
wortelaantasting en de hypocotyllengte en – aantasting. Dit positief effect is het meest
uitgesproken bij de isolaten die agressief zijn op tarwe en voor de parameter
wortelaantasting, wat zeer belangrijk is voor een goede opkomst en ontwikkeling.
Wat de dosis van de actieve stof sedaxane betreft, komt de gangbare dosis 2 liter per ton als
beste naar voor.
Kernwoorden: Rhizoctonia solani, AG 4 HG I, AG 4 HG II, AG 3, AG 5, AG 1 – 1C, AG 2 – 1,
AG F, R. oryzae, R. cerealis, anastomosegroep, sedaxane
Inhoudsopgave
Woord vooraf ............................................................................................................ 5
Abstract ..................................................................................................................... 6
Samenvatting ............................................................................................................ 7
Inhoudsopgave ......................................................................................................... 8
Lijst met figuren ...................................................................................................... 11
Lijst met tabellen .................................................................................................... 12
Inleiding ................................................................................................................... 13
HOOFDSTUK 1: Literatuurstudie .......................................................................... 14
1.
Algemene kenmerken van Rhizoctonia ............................................................. 14
1.1
Rhizoctonia solani ....................................................................................... 15
2.
Taxonomie......................................................................................................... 16
3.
Anastomosegroepen, waardplanten en identificatie .......................................... 17
3.1
Identificatie van R. solani anastomosegroepen ........................................... 20
4.
Ziektecyclus R. solani ........................................................................................ 21
5.
Rhizoctonia-plant interacties ............................................................................. 22
6.
7.
5.1
Penetratiemechanismen schimmel .............................................................. 22
5.2
Afweerreactie plant ...................................................................................... 23
5.3
Symptomen in belangrijkste gewassen ....................................................... 23
5.3.1
Tarwe .................................................................................................... 23
5.3.2
Maïs ...................................................................................................... 24
5.3.3
Bieten .................................................................................................... 25
5.3.4
Aardappelen.......................................................................................... 26
Invloedsfactoren op de aantasting door Rhizoctonia spp. ................................. 27
6.1
Plant en pathogeen ..................................................................................... 27
6.2
Omgevingsfactoren ..................................................................................... 28
6.2.1
Klimaat .................................................................................................. 28
6.2.2
Bodemeigenschappen .......................................................................... 28
Geïntegreerde controle van Rhizoctonia spp. ................................................... 31
7.1
Preventie ..................................................................................................... 31
7.1.1
7.2
Vruchtwisseling ..................................................................................... 31
Biologische bestrijding m.b.v. micro-organismen......................................... 32
7.2.1
Trichoderma spp. en Penicillium spp. ................................................... 32
7.2.2
Arbusculaire mycorrhiza ....................................................................... 33
7.2.3
Pseudomonas bacteriën ....................................................................... 34
7.3
Invloed van organisch materiaal .................................................................. 35
8
7.3.1
Compost................................................................................................ 35
7.3.2
Brassicaceae plantenresten .................................................................. 35
7.3.3
Lignine .................................................................................................. 36
7.4
Resistente rassen ........................................................................................ 36
7.5
Chemische bestrijding ................................................................................. 36
7.5.1
Sedaxane .............................................................................................. 37
HOOFDSTUK 2 : Experimenteel gedeelte: Diversiteit van Rhizoctonia in
landbouwgewassen ................................................................................................ 38
1.
Doelstelling ........................................................................................................ 38
2.
Materiaal en methoden ...................................................................................... 38
2.1
Diversiteit van Rhizoctonia in landbouwgewassen ...................................... 38
2.1.1
Aanleggen collectie isolaten met wortels als startmateriaal .................. 38
2.1.2
Aanleggen collectie isolaten via tandenstokermethode ........................ 39
2.1.3
DAPI-kleuring ........................................................................................ 40
2.1.4
PCR analyse van de rDNA-ITS regio .................................................... 40
2.1.5
Sequenering van de ITS-rDNA regio .................................................... 41
2.2 In vitro bepaling van de pathogeniteit van de Rhizoctonia isolaten op
tarwezaden ........................................................................................................... 41
2.4
In vitro bepaling van de gevoeligheid aan de werkzame stof sedaxane ...... 42
2.5
Statistische verwerking van de in vitro testen .............................................. 43
HOOFDSTUK 3 : Resultaten en bespreking ......................................................... 44
1.
Diversiteit van Rhizoctonia in landbouwgewassen ............................................ 44
1.1
Aanleggen collectie isolaten ........................................................................ 44
1.2
DAPI-kleuring .............................................................................................. 44
1.3
Sequenering van de ITS-rDNA regio ........................................................... 45
1.4
Besluit diversiteit van Rhizoctonia in landbouwgewassen ........................... 47
2. In vitro bepaling van de pathogeniteit van de Rhizoctonia isolaten op tarwezaden
................................................................................................................................. 48
2.1
Niet-parametrische correlaties ..................................................................... 49
2.2
Kieming ....................................................................................................... 49
2.3
Wortelaantal ................................................................................................ 50
2.4
Wortellengte ................................................................................................ 50
2.5
Wortelscore ................................................................................................. 50
2.6
Hypocotyllengte ........................................................................................... 52
2.7
Hypocotylscore ............................................................................................ 52
2.8
Besluit pathogeniteit Rhizoctonia isolaten op tarwezaden ........................... 52
3. In vitro bepaling van de pathogeniteit van de Rhizoctonia oryzae isolaten op
maïszaden ................................................................................................................ 54
9
4.
In vitro bepaling van de gevoeligheid aan de werkzame stof sedaxane ............ 54
4.1
Effect van de dosis sedaxane binnen dezelfde soort................................... 55
4.2
Significante verschillen tussen verschillende groepen ................................. 65
4.2.1
Niet-parametrische correlaties .............................................................. 65
4.2.2
Kieming ................................................................................................. 65
4.2.3
Wortelaantal, wortellengte en hypocotyllengte ...................................... 66
4.2.4
Wortel- en hypocotylscore .................................................................... 66
4.3
Besluit gevoeligheid aan werkzame stof sedaxane ..................................... 66
Discussie ................................................................................................................. 69
Algemeen besluit .................................................................................................... 70
Referentielijst .......................................................................................................... 72
Bijlage 1 ................................................................................................................... 81
Bijlage 2 ................................................................................................................... 84
10
Lijst met figuren
Figuur 1: Myceliumstructuur Rhizoctonia solani (Deketelaere, 2012)....................................15
Figuur 2: Algemene ziektecyclus R. solani: adhesie, penetratie, ..........................................22
Figuur 3: Rhizoctonia aantasting in tarwe (Schneebeli & Davies, 2014) ...............................23
Figuur 4: Scherpe oogvlekken door Rhizoctonia cerealis (Visuals unlimited) ........................24
Figuur 5: Scheur in biet, gevuld met mycelium Rhizoctonia ..................................................25
Figuur 6: Lakschurft aardappel .............................................................................................26
Figuur 7: Ziektedriehoek die de relatie weergeeft tussen plant, pathogeen en
omgevingsfactoren.. .............................................................................................................27
Figuur 8: Wortelgroei bij 15, 30, 50 en 75 % vochtigheid (Gill et al., 2000). ..........................29
Figuur 9: De aanwezigheid van R. solani bij verschillende bodemdichtheden (Harris et al.,
2003) ....................................................................................................................................30
Figuur 10: Inhibitie van het metabolisme van de schimmel door sedaxane. ..........................37
Figuur 11: Schematisch overzicht experimenteel gedeelte ...................................................38
Figuur 12: Rechte vertakkingen zichtbaar onder dissectiemicroscoop ..................................39
Figuur 13: Tandenstokermethode .........................................................................................40
Figuur 14: Opstelling agressiviteitstest .................................................................................41
Figuur 15: Binucleate Rhizoctonia isolaten ...........................................................................44
Figuur 16: Multinucleate Rhizoctonia isolaten .......................................................................45
Figuur 17: Geen Rhizoctonia: sporenvormende schimmels ..................................................45
Figuur 18: Bandenpatroon na amplificatie met ITS4-ITS5 primers ........................................45
Figuur 19: Het belang van Rhizoctonia en andere bodemschimmels....................................47
Figuur 20: Resultaat agressiviteitstest na 7 dagen. ..............................................................48
Figuur 21: Kiemingspercentage en significante verschillen tussen de isolaten.. ...................49
Figuur 22: A. Wortelaantal B. Wortellengte C. Wortelscore D. Hoge en lage aantasting
wortel. ..................................................................................................................................51
Figuur 23: A. Hypocotyllengte B. Hypocotylscore C. Hoge en lage aantasting hypocotyl. ....53
Figuur 24: Grafische voorstelling van de onderzochte parameters kieming, aantal wortels,
wortellengte en –aantasting en hypocotyllengte en – aantasting voor AG 4 HG I. ................57
Figuur 25: Grafische voorstelling van de onderzochte parameters kieming, aantal wortels,
wortellengte en –aantasting en hypocotyllengte en – aantasting voor AG 4 HG II. ...............58
Figuur 26: Grafische voorstelling van de onderzochte parameters kieming, aantal wortels,
wortellengte en –aantasting en hypocotyllengte en – aantasting voor AG 1 – 1C.. ...............59
Figuur 27: Grafische voorstelling van de onderzochte parameters kieming, aantal wortels,
wortellengte en –aantasting en hypocotyllengte en – aantasting voor AG 5. ........................60
Figuur 28: Grafische voorstelling van de onderzochte parameters kieming, aantal wortels,
wortellengte en –aantasting en hypocotyllengte en – aantasting voor AG 2 – 1....................61
Figuur 29: Grafische voorstelling van de onderzochte parameters kieming, aantal wortels,
wortellengte en –aantasting en hypocotyllengte en – aantasting voor Rhizoctonia oryzae. . 62
Figuur 30: Grafische voorstelling van de onderzochte parameters kieming, aantal wortels,
wortellengte en –aantasting en hypocotyllengte en – aantasting voor AG F. ........................63
Figuur 31: Grafische voorstelling van de onderzochte parameters kieming, aantal wortels,
wortellengte en –aantasting en hypocotyllengte en – aantasting voor AG 3.. .......................64
Figuur 32: Kiemingspercentage ............................................................................................65
Figuur 33: A. Wortelaantal B. Wortellengte C. Wortelscore D. Hoge en lage aantasting
wortel. ..................................................................................................................................67
Figuur 34: A. Hypocotyllengte B. Hypocotylscore C. Hoge en lage aantasting hypocotyl. .....68
11
Lijst met tabellen
Tabel 1: Classificatie van Rhizoctonia- species op basis van aantal kernen (Larsson, 2007)
.............................................................................................................................................16
Tabel 2: Anastomosegroepen en subgroepen met waardplanten van R. solani (Gonzàlez
Garcia et al., 2006) ...............................................................................................................18
Tabel 3: Anastomosegroepen en subgroepen met waardplanten van binucleate Rhizoctonia
isolaten (Ceratobasidium) (Pannecoucque, 2009) ................................................................19
Tabel 4: Classificatie van enkele micro-organismen effectief tegen Rhizoctonia (ncbi, 2014)
.............................................................................................................................................32
Tabel 5: Samenstelling Vibrance Gold ..................................................................................42
Tabel 6: Verzamelde collectie Rhizoctonia isolaten ..............................................................46
Tabel 7: Selectie isolaten voor het testen van de gevoeligheid aan het product sedaxane ...54
12
Inleiding
Rhizoctonia-ziekte wordt veroorzaakt door de vaak voorkomende bodemgebonden
pathogene schimmels die behoren tot het genus Rhizoctonia. Dit genus vertegenwoordigt
een aantal van de economisch belangrijkste plant pathogene schimmels die wereldwijd
verspreid zijn in de intensieve land- en tuinbouwteelt. Het genus Rhizoctonia, met als
belangrijkste vertegenwoordiger
Rhizoctonia
solani,
bestaat
uit
verschillende
anastomosegroepen en elke groep heeft zijn specifieke waardplanten. De
waardplantenreeks van Rhizoctonia spp. is dus zeer breed en bestaat uit een groot aantal
akkerbouwgewassen, zoals vooral aardappelen en suikerbiet. Maar ook in granen duiken er
de laatste jaren steeds meer problemen op met Rhizoctonia. De schade wordt vooral
veroorzaakt aan ondergrondse plantendelen en leidt tot kiemplantensterfte, wortelbrand en
en wortelrot. Soms worden ook de bladeren en bladscheden aangetast o.a. bij rijst.
De controle van Rhizoctonia spp. is erg moeilijk aangezien de grondgebonden schimmel erg
divers is, vele waardplanten heeft, in staat is om scleroten te produceren en saprofytisch te
overleven op gewasresten. Er zijn tal van biologische bestrijdingsmiddelen gekend, dit zowel
onder de vorm van natuurlijke groeibevorderende producten als onder de vorm van microorganismen (Trichoderma en Penicillium spp., Pseudomonas bacteriën,…), maar bij hevige
aantasting kan enkel met een fungicidenbehandelingen de infectie en uitbreiding van deze
plant pathogeen tegengegaan worden.
Deze thesis kadert binnen een groter project van het bedrijf Syngenta. Zij hebben namelijk
een nieuwe werkzame stof ontwikkeld, sedaxane, dat speciaal voor zaadontsmetting werd
ontworpen. Het is een breed werkend fungicide dat kan worden ingezet tegen bodem- en
zaad overdraagbare schimmelziekten, waaronder dus ook Rhizoctonia.
Het eerste luik van dit onderzoek bestaat uit het in kaart brengen van de diversiteit van
Rhizoctonia in landbouwgewassen verspreid over Vlaanderen. Hierbij wordt vooral gefocust
op tarwe, maar ook stalen afkomstig van aardappelen, suikerbieten en maïs worden
onderzocht gezien deze gewassen vaak in rotatie mat tarwe verbouwd worden . Zo kan een
beeld geschetst worden van de in Vlaanderen aanwezige soorten en kan overgegaan
worden tot een effectieve bestrijding.
In het tweede deel wordt vervolgens nagegaan wat de gevoeligheid is van tarwe t.o.v. de
verschillende Rhizoctonia isolaten m.b.v. kiemingstesten. Dit wordt eerst met onbehandeld
zaad getest en vervolgens ook met tarwezaad dat behandeld is met de nieuwe werkzame
stof sedaxane. Op deze manier kan men nagaan of het toepassen van dit middel zorgt voor
een hogere opbrengst door een verbetering van de kwaliteit van de wortels, een betere
opkomst en stresstolerantie.
13
HOOFDSTUK 1: Literatuurstudie
1. Algemene kenmerken van Rhizoctonia
Rhizoctonia-ziekte wordt veroorzaakt door de vaak voorkomende bodemgebonden
pathogene schimmels die behoren tot het genus Rhizoctonia. De teleomorfe vormen
behoren tot het fylum van de Basidiomycota (klasse Agaricomycetes, orde Polyporales en
familie Corticiaceae) en vertegenwoordigt een aantal van de economisch belangrijkste plant
pathogene schimmels die wereldwijd verspreid zijn in de intensieve land- en tuinbouwteelt.
Het genus Rhizoctonia wordt beschouwd als een heterogene verzameling van filamenteuze
schimmels die geen aseksuele sporen produceren en in hun anamorfe vorm wel een aantal
kenmerken gemeenschappelijk hebben (Gonzàlez Garcia et al., 2006). Ze veroorzaken
voornamelijk kiemplantensterfte, wortelbrand en blad- en wortelrot bij een groot aantal
gewassen. De waardplantenreeks van Rhizoctonia spp. is breed en bestaat uit een groot
aantal akkerbouwgewassen (granen, katoen, suikerbiet, aardappel), nagenoeg alle groenten,
verscheidene sierplanten, enkele fruitsoorten (aardbei, meloen), grassen en verschillende
boomsoorten (Sneh et al., 1996).
In 1815 werd deze bodemgebonden plantpathogeen voor het eerst door De Candolle
onderzocht. Hij classificeerde enkele schimmels onder de naam Rhizoctonia en baseerde
zich hiervoor slechts op twee factoren, enerzijds de productie van scleroten met dezelfde
textuur en anderzijds de associatie van mycelium met de wortels van levende planten. Het
gebrek aan andere classificatieparameters zorgde voor veel verwarring en leidde tot een
grote en ongeordende verzameling van weinig met elkaar gerelateerde schimmels (Moore,
1987).
Decennia lang werden schimmels geclassificeerd onder het genus Rhizoctonia enkel
gebaseerd op vegetatieve kenmerken, zoals het bezit van bruingepigmenteerde hyfen,
typische rechthoekige aftakkingen van het mycelium en de afwezigheid van aseksuele
sporen. Maar naast deze vegetatieve kenmerken zijn er ook andere kenmerken die een
betere basis vormen voor classificatie, zoals bijvoorbeeld de aanwezigheid van nauw
gesepteerde, gezwollen hyfen die samengetrokken zijn ter hoogte van het septum, sclerotia
in schimmelculturen, snelle hyfale groei en eventueel aanwezige complexe gesegmenteerde
organen. Mede door deze kenmerken en door het ontstaan van nieuwe
classificatiemethodes en technieken (zie puntje 3.1) werden de ongeveer 120 schimmels die
oorspronkelijk tot het geslacht Rhizoctonia behoorden verminderd tot 37 (Andersen en
Stalpers, 1994) of 49 (Roberts,1999), afhankelijk van de auteur (Gonzàlez Garcia et al.,
2006).
14
1.1
Rhizoctonia solani
Rhizoctonia solani is de anamorfe of ongeslachtelijke vorm van Thanatephorus cucumeris.
Deze is binnen het genus Rhizoctonia veruit de belangrijkste plant pathogene soort en om
die reden ook de meest bestudeerde (Sneh et al., 1991). De schimmel wordt teruggevonden
in bodems verspreid over de hele wereld en wordt gezien als een agressieve plant
pathogeen die in staat is zeer veel waardplanten te infecteren. R. solani veroorzaakt smeul
bij kiemplanten, laesievlekken op wortels en zaden, wortelrot, stengelrot en hypocotylrot.
Alhoewel R. solani een bodemschimmel is, kan het ook bladlaesies veroorzaken door de
kieming van basidiosporen op het bladoppervlak (Kucharek, 2000).
Figuur 1 geeft de myceliumstructuur van R. solani weer. Het jonge mycelium is vegetatief en
kleurloos, maar bij veroudering kleurt het geel tot lichtbruin door de afzetting van melanine.
Het secundair mycelium bestaat uit gesepteerde hyfen die een hoek van 90 ° vormen, deze
hoek is typisch voor R. solani. Nabij de knooppunten worden septa gevormd en zijn de hyfen
iets vernauwd. De uitwisseling van cytoplasma, mitochondria en nucleoli tussen de
compartimenten gebeurt door een septale porie in de dwarswanden. Daarnaast bevat het
mycelium van R. solani ook meerkernige cellen. Meestal hebben de hyfen een diameter
groter dan 5 μm en beschikken ze over een grote groeisnelheid. Onder bepaalde
omstandigheden vormt de schimmel ook monilioïde (brede, korte) cellen en scleroten
(overlevingsstructuren), er worden echter nooit conidiën gevormd (Sneh et al., 1991). De
seksuele vorm van R. solani (Thanatephorus cucumeris) met de vorming van geslachtelijke
sporen (basidiosporen) komt slechts onder uitzonderlijke omstandigheden voor. Een hoge
vochtigheid blijkt hierbij belangrijk te zijn (Deketelaere, 2012).
Figuur 1: Myceliumstructuur Rhizoctonia solani (Deketelaere, 2012)
15
2. Taxonomie
Zoals reeds eerder vermeld, werden door de jaren heen nieuwe classificatiemethodes en
technieken ontwikkeld die geleid hebben tot een verbeterde en efficiëntere classificatie. Maar
ondanks deze nieuwe methodes en technieken bevindt de classificatie van de Rhizoctonia
soorten zich nog steeds in een ontwikkelingsfase (Gonzàlez Garcia et al., 2006). De oorzaak
van deze moeizame classificatie is het feit dat Rhizoctonia zowel in de vegetatieve
(anamorfe), als in een generatieve (teleomorfe) vorm kan voorkomen. Er zijn ook een aantal
Rhizoctonia schimmels waarvan de anamorfe vorm gevonden is, maar waarvan de
teleomorfe vorm nog ontbreekt.
In tabel 1 wordt de classificatie van Rhizoctonia species weergegeven op basis van het
aantal celkernen. Bij deze classificatie ontstaan drie belangrijke groepen, namelijk de
mononucleate, de binucleate en multinucleate Rhizoctonia soorten. Tot de mononucleaire
groep behoort Ceratobasidium (anamorf: Ceratorhiza), deze kan echter ook twee kernen
bezitten. Tulasnella (anamorf: Epulorhiza) is binucleaat en Thanatephorus (anamorf:
Rhizoctonia) en Waitea (anamorf: Chrysorhiza) behoren tot de multinucleate Rhizoctonia
soorten (Sharon et al., 2006).
Een recente studie omtrent het fylum van de Basidiomycota toont aan dat de families
Tulasnellaceae en Ceratobasidiaceae behoren tot de orde van de Cantharellales (Matheny
et al., 2007). Eerder werd Waitea geplaatst onder de familie Ceratobasidiaceae, maar de
basidiosporen van Waitea vertonen dezelfde morfologie als de schimmels van de
Coriciaceae familie. Daarom behoort Waitea nu tot de orde van de Corticiales.
Tabel 1: Classificatie van Rhizoctonia- species op basis van aantal kernen (Larsson, 2007)
Orde
Familie
Teleomorf
Anamorf
Aantal kernen
Cantharellales
Ceratobasidiaceae
Ceratobasidium
Ceratorhiza
Mono- of binucleaat
Thanatephorus
Rhizoctonia
Multinucleaat
Tulasnellaceae
Tulasnella
Epulorhiza
Binucleaat
Corticiaceae
Waitea
chrysorhiza
Multinucleaat
Corticiales
16
3. Anastomosegroepen, waardplanten en identificatie
Een andere vorm van classificatie is gesteund op anastomosegroepen. Een
anastomosegroep bestaat uit een genetische populatie van nauw aan elkaar verwante
isolaten die onderling anastomose kunnen ondergaan. Anastomose is de versmelting van
twee aan elkaar rakende hyfen van verschillende isolaten en kan enkel voorkomen als de
hyfen tot dezelfde anastomosegroep (AG) behoren. Door te kijken met welk referentie-isolaat
(AG gekend) een onbekende isolaat versmelt, kan classificatie van het onbekende isolaat
plaatsvinden (Carling et al., 2002). Verschillende anastomosegroepen worden nog verder
opgesplitst in subgroepen. Deze subgroepen worden bepaald op basis van pathogeniteit,
nutritionele vereisten, morfologie, frequentie van anastomose, waardplantspecificiteit of
DNA-technieken (Sneh et al., 1991).
In de huidige systematiek wordt R. solani beschreven als een complexe soort die kan
ingedeeld worden in 13 verschillende anastomosegroepen (Carling, 1996). Isolaten van
dezelfde anastomosegroep veroorzaken meestal gelijkaardige symptomen en hebben ook
vaak een vergelijkbare waardplantenreeks. Zo worden isolaten van AG 2 geassocieerd met
kankers bij biet en maïs, zwartpoten bij cruciferen en aantasting van gazons. Het is bekend
dat de variant AG 2-2 Rhizoctonia wortel- en bladrot veroorzaakt bij suikerbieten (Herr,
1996). In Duitsland en andere Europese landen met intensieve suikerbietenteelt wordt vooral
de subgroep AG 2-2IIIB als grootste oorzaak voor wortel- en bladrot bij suikerbieten
aangeduid (Büttner et al., 2002). De isolaten van AG 3 veroorzaken bij aardappelen
misvormde knollen, een tekort aan knoldragende stengels, lakschurft en een verhoogd
aandeel van te kleine of te grote knollen (Gonzàlez Garcia et al., 2006). Talrijke genetische
studies werden op AG 4 uitgevoerd. Gebaseerd op rDNA restrictie analyse bestaat AG 4
mogelijks uit drie groepen (H-I, H-II, H-III) (Stevens Johnk & Jones, 2001). In tabel 2 worden
de verschillende anastomosegroepen met corresponderende waardplanten van R. solani
weergegeven.
De binucleate Rhizoctonia isolaten werden voordien ingedeeld in zeven ‘Ceratobasidium
anastomose groepen’ (CAG 1 – CAG 7) (Burpee et al., 1980). Maar nu worden deze 7
CAG’s meegerekend in het AG systeem bestaande uit 16 anastomosegroepen (AG A – AG I,
AG K, AG L, AG O – AG S), dat ontwikkeld werd in Japan (Sharon et al., 2008). Deze
verschillende anastomosegroepen van de binucleate Rhizoctonia (Ceratobasidium) worden
in tabel 3 weergegeven.
17
Tabel 2: Anastomosegroepen en subgroepen met waardplanten van R. solani (Gonzàlez Garcia et al.,
2006)
Anastomose groep/ Subgroep
Waardplanten
AG 1 - IA
Rijst, maïs, sorghum, bonen, sojabonen, gras
AG 1 - IB
AG 1 - IC
Bonen, rijst, sojabonen, houtachtige leguminosen, sla,
kool
Boekweit, wortel, sojabonen, vlas
AG 2 - 1
Kruisbloemigen, aardbei, tulp
AG 2 - 2 IIIB
AG 2 - 2 IV
Rijst, siergras, gember,
Chrysanthemum
Suikerbiet, gras
AG 3
Aardappel, tomaat, tabak, aubergine
AG 4 (HGI, HGII and HGIII)
AG 5
Tomaat, erwt, aardappel, sojabonen, ui, katoen,
bonen
Aardappel, gras, bonen, sojabonen
AG 6 (HGI en GV)
Niet-pathogeen
AG 7
Sojabonen
AG 8
Poaceae
AG 9 (TP en TX)
Aardappel, kruisbloemigen
AG 10
Niet-pathogeen
AG 11
Tarwe
AG 12
Bloemkool, radijs
AG 13
Niet-pathogeen
AG BI
Niet- pathogeen
gras,
maïs,
suikerbiet,
18
Tabel 3: Anastomosegroepen en subgroepen met waardplanten van binucleate Rhizoctonia isolaten
(Ceratobasidium) (Pannecoucque, 2009)
Anastomose Groep/ Subgroep
Waardplant
AG - A (CAG 2)
AG - Ba
Aardbei, suikerbiet, erwt, tomaat, meloen,
zonnebloem, komkommer, sla, spinazie, grondnoot,
sojaboon, boon, aardappel, roos
Rijst, sorghum
AG - Bb
Rijst, sorghum
AG - Bo
Rijst
AG - C
Niet-pathogeen
AG - D (CAG 1)
AG - H
Granen, turf gras, suikerbiet, erwt, ajuin, aardappel,
katoen, boon, sojaboon
Boon, erwt, radijs, ajuin, sla, tomaat, groene boon,
sojaboon, grondnoot, suikerbiet
Aardbei, boon, erwt, radijs, ajuin, sla, tomaat,
grondnoot
Aardbei, suikerbiet, boon, erwt, tomaat, meloen,
zonnebloem, grondnoot, roos
Bodem
AG - I
Aardbei, boon
AG - K
Aardbei, boon
AG - L
Bodem
AG - O
Bodem
AG - P
Thee, roos, azalea
AG - Q
Turf gras
AG - R (CAG 5)
Boon, erwt, radijs, ajuin, sla, tomaat, groene boon,
sojaboon, grondnoot, azalea
Azalea
AG - E (CAG 3 en CAG 6)
AG - F (CAG 4)
AG - G
AG - S (CAG 7
19
3.1
Identificatie van R. solani anastomosegroepen
Zoals reeds eerder vermeld kan de bepaling van de anastomosegroep gebeuren door te
kijken met welk referentie-isolaat (AG gekend) een onbekend isolaat versmelt. Dit is nog
steeds een accurate en veel gebruikte methode. Het uitvoeren van al deze verschillende
anastomosereacties ter identificatie is echter zeer tijdrovend en vergt ook de vaardigheid in
het herkennen van een compatibele fusie (Cubeta & Vilgalys, 1997). Om deze redenen
werden diverse andere technieken ontwikkeld. Enkele methoden die gebruikt worden voor de
classificatie van Rhizoctonia spp. zijn analyse van de pectine degraderende isozymen,
pectine zymogrammen, het profiel met betrekking tot de vluchtige vetzuren, elektroforetische
karyotyping, DNA-DNA hybridisatie, AFLP (amplified length polymorphism), enzovoort
(Sharon, 2006). Van al deze technieken is de moleculaire analyse van de ITS (internal
transcribed spacer) regio van het rDNA (ribosomaal DNA) momenteel de meest gebruikte.
Dit is te verklaren door het feit dat deze sequentie aanwezig is in een groot aantal kopieën
en kan vermenigvuldigd worden met behulp van universele primers. Verder heeft de ITS
regio een vrij kleine grootte (ongeveer 700 basenparen) en wordt deze gekenmerkt door een
hoge interspecifieke variatie, maar lage intraspecifieke variatie (Kuninga et al., 1997). Voor
R. solani is aangetoond dat isolaten binnen eenzelfde subgroep een hoge homologie
vertonen (> 96 %); binnen eenzelfde anastomosegroep kan de homologie variëren van 66 tot
100 %. Isolaten behorende tot een verschillende AG vertonen 55 - 95 % gelijkheid. Analyse
van de ITS regio laat dus toe om isolaten tot op anastomosegroep en -subgroep te
identificeren (Feliner & Rossello, 2007; Kuninga et al., 1997).
20
4. Ziektecyclus R. solani
Aangezien Rhizoctonia solani binnen het genus Rhizoctonia veruit de belangrijkste en ook
de meest bestudeerde soort is, wordt hieronder het infectieproces van R. solani besproken.
Op figuur 2 wordt deze algemene ziektecyclus weergegeven. Gedurende het infectieproces
van R. solani worden verschillende fasen onderscheiden, namelijk adhesie, penetratie,
kolonisatie en waardplantreactie (González García et al., 2006).
Rhizoctonia kan zich zowel geslachtelijk als ongeslachtelijk voortplanten. Wanneer de
omgevingsvoorwaarden optimaal zijn, plant de schimmel zich op een aseksuele, vegetatieve
manier voort. Hierbij is het overlevend mycelium het primair inoculum en vormt dit nieuwe
infecterende hyfen. Deze hyfen worden aangetrokken door de afgescheiden exudaten van
de waardplant en groeien zo naar hun gastheer toe. Wanneer de hyfen vervolgens in contact
komen met het uitwendig oppervlak van een geschikte waardplant, treedt herkenning op en
volgt de adhesiereactie. In eerst instantie groeien de hyfen over het plantoppervlak, er
ontstaat een overvloedige vertakking van de schimmel en infectiestructuren worden
gevormd. Deze infectiestructuren bestaan uit korte gezwollen hyfen, de appressoria. In een
volgend stadium platten de gezwollen hyfen terug af, hechten ze zich sterk aan het
oppervlak en groeien ze gericht langs de anticlinale wand van de epidermiscellen
(Deketelaere, 2012). Hierna worden meerdere T-vormige hyfale vertakkingen gevormd die
het zogenaamd infectiekussen gaan vormen. De volgende stap is de penetratie. Deze
gebeurt zelden via natuurlijke openingen zoals wondjes of stomata (González García et al.,
2006), maar gebeurt meestal via de appressoria die onder het infectiekussen een infectiepin
vormen. Hiermee kan de schimmel de cuticula en de epidermale celwand van het nog intacte
plantenweefsel penetreren (Keijer, 1996). Bij het mechanisch binnendringen van gezond
plantenweefsel zijn cellulolytische en pectinolytische enzymen betrokken, die ook een rol
spelen bij de latere weefselafbraak (Marcus et al., 1986; Weinhold & Motta, 1973).
Vervolgens start R. solani met de invasie en het koloniseren van het weefselmateriaal,
waardoor uiteindelijk de symptomen ontstaan (Keijer, 1996). De symptomen en het belang
van Rhizoctonia in de belangrijkste gewassen wordt onder puntje 5.3 verder besproken.
Afhankelijk van de mogelijkheid tot secretie van extracellulaire enzymen die celwanden
kunnen afbreken, gebeurt de verdere groei intercellulair (tussen de cellen) of intracellulair
(doorheen de cellen) (Gvosdeva et al., 2006).
Tijdens het groeiseizoen kunnen ook basidiosporen gevormd worden. Dit is de seksuele,
generatieve voorplantingsvorm van de schimmel en zorgt voor een verspreiding over grote
afstanden via de wind. De basidiosporen worden enkel gevormd bij voldoende warme
temperaturen (25-30 °C) en matig vochtige bodemcondities. Deze vorm van seksuele
voortplanting is dus in gematigde streken van weinig belang (Koike et al., 2007).
Overwintering gebeurt bij R. solani als dikwandig mycelium, via scleroten of saprofytisch
binnen het waardplantweefsel. Deze overlevingsstructuren zijn bij R. solani vrij klein (1-3
mm) en kunnen in de bodem en op plantenresten tot 18 maanden overleven zonder
geschikte waardplant (Keijer, 1996). De melaninerijke scleroten worden bij veroudering van
21
het mycelium op het einde van het groeiseizoen gevormd en blijven achter in de bodem
tijdens de oogst. Het voorziet de schimmel, samen met het overgebleven vegetatief
mycelium, van primair inoculum voor de infectie van nieuwe gastheerplanten in het volgende
groeiseizoen (Scholte, 1989).
Figuur 2: Algemene ziektecyclus R. solani: adhesie, penetratie,
kolonisatie en waardplantreactie (Agrios, 2005)
5. Rhizoctonia-plant interacties
5.1
Penetratiemechanismen schimmel
Onder puntje vier werd de levenscyclus van Rhizoctonia besproken. Hieruit blijkt dat de
schimmel zelden via natuurlijke openingen zoals wondjes of stomata de plant binnendringt,
maar dit meestal doet moet behulp van appressoria die onder het infectiekussen een
infectiepin vormen (González García et al., 2006). Dit betekent dat om tot een geslaagde
infectie te komen de schimmel de cuticula en de epidermale celwand van het nog intacte
plantenweefsel moet penetreren. Hiervoor zijn zowel afbraakenzymen als mechanische
kracht nodig. Zo produceert Rhizoctonia cellulolytische en pectinolytische enzymen voor de
enzymatische degradatie van cellullose en pectine (Marcus et al., 1986; Weinhold & Motta,
1973). Het succes van de penetratie met behulp van deze enzymen is ook afhankelijk van de
plantensoort, het ras, ontwikkelingsstadium van de plant en omgevingsfactoren daar deze
een invloed hebben op de toestand van de cuticula (Cole & Hoch, 1991). De tweede barrière
die de schimmel moet passeren is de celwand. Deze bestaat uit koolhydraten zoals
cellulose, pectine en glucaan, eiwitten en fenolische derivaten. Al deze componenten die
moeten afgebroken worden spelen dus ook een rol in de penetratie (Hardham et al., 2007).
22
5.2
Afweerreactie plant
Om zichzelf te beschermen gaat de plant een passieve barrière opbouwen zoals de cuticula
en celwand. Indien de pathogeen in staat is deze basale afweer te doorbreken, reageert de
plant met een hele reeks andere afweerreacties van het actief immuunsysteem. Dit actief
immuunsysteem, het zogenaamde gen-om gen-systeem, komt tot uiting na de herkenning
van de pathogeen door de plant. Tot deze afweerreacties behoren o.a. de
overgevoeligheidsreactie, versterking van de celwand, afzetting van callose of fenolische
componenten en de productie van fytoalexinen (Ferreira et al., 2007). Na de herkenning van
Rhizoctonia begint de plant dus met deze afweerreacties, hierdoor ontwikkelen de planten
beter en hebben een beter wortelstelsel met meer wortelharen. Dit zorgt ervoor dat
aantasting door Rhizoctonia, maar ook andere bodemziekten zoals Pythium en Sclerotinia
beperkt wordt.
5.3
Symptomen in belangrijkste gewassen
5.3.1 Tarwe
Aantasting van Rhizoctonia solani in tarwe leidt pleksgewijs tot een onregelmatige opkomst,
dit is zichtbaar als kale plekken in het veld die ontstaan in een vroeg groeistadium (figuur 3).
Deze aangetaste plekken kunnen variëren in diametergrootte, dit van enkele centimeters tot
enkele meters.
R. solani kan in de eerste plaats optreden als kiemschimmel. De ziekteoverdracht gebeurt
via het zaaizaad in de zaadhuid en embryo of via de bodem. Kiemschimmels infecteren de
plant tijdens de kieming en veroorzaken grote schade naarmate de kieming langer duurt.
Door een correcte zaaizaadontsmetting toe te passen kan R. solani als kiemschimmel vrijwel
volledig bestreden worden (Haesaert, 2013).
R. solani kan ook optreden als voetziekte, hierbij wordt het wortelstelsel aangetast. De
schimmel bevindt zich vooral in de bovenste lagen van de bodem en infecteert alleen
zaailingen via de wortelpunt snel na het ontkiemen. Oudere planten hebben een meer
ontwikkeld wortelstelsel en epidermis, wat de penetratie van de schimmeldraden in de wortel
bemoeilijkt. Op de worteluiteinden ontstaan smalle bruine vlekken en wanneer de planten de
kiemingsperiode overleven, kunnen pleksgewijs zones ontstaan waar de planten gekenmerkt
worden door dwerggroei, legering of wit-aarigheid (MacNish, 2005).
Figuur 3: Rhizoctonia aantasting in tarwe (Schneebeli & Davies, 2014)
23
Rhizoctonia cerealis is de veroorzaker van de scherpe oogvlekkenziekte. De vlekken
veroorzaakt door R. cerealis kenmerken zich door een scherp begrensde donkere rand en
een wit centrum. Deze vlekken komen hoger op de stengel voor (30 cm boven de grond) en
vaak is meer dan één vlek per stengel aanwezig (figuur 4). In het heldere deel van deze
vlekken kunnen ook sclerotiën voorkomen.
Rhizoctonia cerealis wordt vooral aangetroffen op lichtere klei-, dal- en zandgronden, maar
ook op zwaardere gronden kan de scherpe oogvlekkenziekte toeslaan, vooral in een droog
voorjaar. Bij ernstige aantasting kan vervroegde afrijping en legering optreden (Haesaert,
2013).
Figuur 4: Scherpe oogvlekken door Rhizoctonia cerealis (Visuals unlimited)
5.3.2 Maïs
Rhizoctonia wordt door maïs in stand gehouden en kan zich zo ook vermeerderen. Hierdoor
verhoogt de kans op en de mate van schade door Rhizoctonia. Vooral in suikerbieten die
men in rotatie met maïs teelt, kan dit leiden tot grote problemen. Bij maïs resulteert een
aantasting in de eerste plaats in zaad- en wortelrot. Aangetaste planten hebben een minder
goed ontwikkeld wortelstelsel en vertonen vaak legering. Door aantasting van het
wortelstelsel vermindert ook de opnamecapaciteit van de plant, waardoor het gewas
achterblijft in groei en kleinere kolven levert.
Op de stengel zijn soms vlekken zichtbaar die vergelijkbaar zijn met die van de scherpe
oogvlekkenziekte in granen. Deze symptomen leiden tot een slechte opkomst, het
pleksgewijs achterblijven in groei, fijnere stengels en opbrengstverliezen. De
opbrengstderving als gevolg van Rhizoctonia aantasting staat in relatie tot de oppervlakte en
de aantastingsgraad, ook moet men rekening houden met de extra kosten voor herzaai.
24
5.3.3 Bieten
Rhizoctonia solani veroorzaakt grote problemen in de bietenteelt en bij zware aantasting
kunnen zelfs gehele percelen verloren gaan. De rotte bieten hebben een laag suikergehalte,
zorgen voor problemen bij de bewaring en verwerking en hebben dus een sterke
inkomstdaling voor de teler tot gevolg.
Het zijn vooral de jonge bietenplantjes die zeer gevoelig zijn voor infectie met R. solani.
Wanneer aantasting zich voordoet bij het kiemplantje, net voor of na het boven komen,
spreekt men van ‘damping-off’ of omvalziekte. Dit kan leiden tot een sterk verlaagde
opkomst.
Ook later in het groeiseizoen kan aantasting door Rhizoctonia optreden, deze schade is
evenwel kleiner dan bij kiemplanten wegval. Op het veld is de aantasting meestal het eerst
zichtbaar vlak onder het grondoppervlak. Mogelijke aantastingsvormen zijn wortelrot, bruinrot
en bladlaesies. In het geval van wortelrot verliezen de wortels hun functionaliteit en wordt het
assimilatentransport naar de bovenliggende plantendelen verstoord. Dit geeft aanleiding tot
vergeling of afsterving. Ook kan de wortel scheuren vertonen ter hoogte van het
grondoppervlak die gevuld kunnen zijn met bruin mycelium (figuur 5).
Bij bruinrot verschijnen er lichte tot donkerbruine ingezonken vlekken op de stengel of
wortels. Dit heeft een negatieve invloed op het groeipotentieel en de uiteindelijke opbrengst.
Het onderste gedeelte van de bladstengels kan ook aangetast zijn door Rhizoctonia.
Dikwijls zijn dan zwarte plekken zichtbaar. Dit treedt vaak op nadat bladeren in aanraking
met de grond zijn gekomen (Schneider, 2008).
Figuur 5: Scheur in biet, gevuld met mycelium Rhizoctonia
25
5.3.4 Aardappelen
Bij aardappelen is lakschurft als gevolg van aantasting van Rhizoctonia het bekendste
symptoom. Op de knollen is de korstvormige bruinzwarte ruststructuur van de schimmel
zichtbaar. Deze ontstaan als een verdichting van de schimmeldraden die zich snel uitbreiden
en zwart worden. Meestal komen afzonderlijke scleroten voor, maar soms kan een knol of
een gedeelte ervan door een zwarte korst omgeven zijn (figuur 6).
Figuur 6: Lakschurft aardappel
Naast aantasting van de knollen vertonen ook de jonge scheuten, stengels en stolonen
symptomen.
De jonge scheuten worden vanuit de scleroten of rechtstreeks vanuit de grond aangetast.
Deze aantasting is herkenbaar aan de ingezonken licht- tot donkerbruin gekleurde laesies
die aanwezig zijn op de ondergrondse stengeldelen. Bij een ernstige aantasting wordt de
scheut geheel omringd door laesies en gaat het bovengelegen deel afsterven. Dit geeft
aanleiding tot een onregelmatige opkomst.
Aantasting van de stengel gaat gepaard met een onregelmatige opkomst, het rollen en
"knijpen" van de topbladeren en vervroegde afsterving. De afvoer van koolhydraten naar de
stolonen wordt belemmerd en bovengrondse knollen worden gevormd.
Aantasting van de stolonen heeft een verminderd knolgetal tot gevolg. Een ander gevolg is
dat door een groot aantal vertakkingen van de aangetaste stolonen krielnesten ontstaan aan
of juist onder het grondoppervlak (Veerman, 2003).
26
6. Invloedsfactoren op de aantasting door Rhizoctonia spp.
Rhizoctonia aantastingen komen de laatste jaren wereldwijd steeds vaker voor (Ohkura et
al., 2009). De oorzaak hiervan wordt gezocht bij een aantal factoren die de aantasting van
Rhizoctonia uitlokken of verergeren. Hierbij spelen drie factoren een rol. Ten eerste is er de
interactie tussen de schimmel en de plant. Maar enkel dit contact is onvoldoende, indien de
omgevingsvoorwaarden ongunstig zijn, zal geen infectie plaatsvinden. De interactie tussen
deze drie componenten, namelijk de plant, ziekteverwekker en omgevingsfactoren kunnen
worden voorgesteld met behulp van de ziektedriehoek (figuur 7). Elke zijde stelt één van de
componenten voor en de lengte is gecorreleerd met de impact van de component. De
oppervlakte van de driehoek stelt de ziektedensiteit voor. Wanneer de invloed van één van
de componenten nul is, bijvoorbeeld als de plant resistent is, de pathogeen niet virulent
genoeg of de condities niet gunstig voor de groei en verspreiding van de pathogeen, zal er
geen ziekte optreden (Haesaert, 2012).
Figuur 7: Ziektedriehoek die de relatie weergeeft tussen plant, pathogeen en omgevingsfactoren. Hoe
groter de zijden van de driehoek, hoe groter de oppervlakte die de ziektedensiteit weergeeft.
6.1
Plant en pathogeen
Zoals reeds eerder vermeld, bestaat het genus Rhizoctonia uit verschillende anastomose
groepen die nog verder worden opgesplitst in subgroepen. Isolaten van dezelfde
anastomose groep veroorzaken meestal gelijkaardige symptomen en hebben ook vaak een
vergelijkbare waardplantenreeks. Afhankelijk van de aanwezigheid van de juiste waardplant
zal er dus infectie optreden of niet. Binnen de plantensoort speelt ook het genotype een
belangrijke rol in de graad van infectie. Een bepaald ras kan namelijk meer of minder
resistent of tolerant zijn, men kiest dus best een ras in functie van de infectiedruk. Het
gebruik van genetisch tolerante rassen tegen Rhizoctonia wordt verder besproken bij de
geïntegreerde controle van Rhizoctonia spp..
Men kan dus stellen dat er sprake is van een grote genetische diversiteit van Rhizoctonia
isolaten afkomstig van verschillende regio’s, wat van invloed is op de groei en verspreiding
van het pathogeen. De adaptatie, agressiviteit en reactie ten opzichte van fungiciden worden
onder andere door deze genetische- en chemotypische diversiteit bepaald. Ook zouden
27
extrachromosomale elementen zoals de dubbelstrengige RNA-structuren (dsRNA) een rol
spelen in de graad van pathogeniciteit van de schimmel. Verschillende anastomosegroepen
van R. solani bevatten namelijk deze extrachromosomale elementen zoals dsRNA in het
cytoplasma (Bharathan et al., 2005). Het verband met de pathogeniciteit is echter vrij
complex en tot op heden werd nog geen significante correlatie gevonden met eventuele
virulentie (Bharathan, 1989).
6.2
Omgevingsfactoren
6.2.1 Klimaat
Het klimaat, meer bepaald de temperatuur en relatieve vochtigheid, is een erg belangrijke
parameter, deze kan de ideale omstandigheden creëren voor de ontwikkeling en groei van
pathogenen. In de afgelopen eeuw hebben we het klimaat zien veranderen door menselijke
activiteiten, wat geleid heeft tot een toename van de temperatuur en de CO2-concentratie.
Het is gekend dat deze veranderingen een groot effect hebben op de bovengrondse
processen in de plant. Maar ook op de ondergrondse microbiële activiteit hebben de
temperatuur en CO2-concentratie een belangrijke invloed. Aangezien hierover heel wat
minder is geweten, maakt dit onderwerp deel uit van vele onderzoeksprojecten (Sadowsky &
Schortemeyer, 1997). De gevolgen van klimaatverandering kunnen ziektes doen toenemen,
afnemen of geen effect hebben. Deze veranderingen kunnen dus zowel positief, negatief als
neutraal zijn. Maar de impact van klimaatverandering blijft moeilijk te voorspellen (Ghini et
al., 2008).
Er is echter wel al voldoende aangetoond dat een stijging van de bodemtemperatuur en een
verhoging van de atmosferische CO2-concentratie de ontwikkeling van Rhizoctonia stimuleert
(Kobayashi et al., 2006). In het onderzoek van Kataria en Grover (1987) bleek de activiteit
van de schimmel te stijgen bij een toenemende bodemtemperatuur. Bij in vitro-testen bleek
de myceliumgroei van R. solani een maximum te bereiken bij een bodemtemperatuur van
30 °C, bij temperaturen lager dan 15 °C en hoger dan 40 °C was er geen schimmelgroei
meer merkbaar. De stijging van de schimmelactiviteit bij hogere temperaturen werd verder
ook aangetoond door Smiley en Uddin (1993). Zij stelden vast dat de groei en aantasting van
R. oryzae groter was bij hogere temperaturen.
6.2.2 Bodemeigenschappen
Rhizoctonia is een bodemgebonden schimmel, het spreekt dus voor zich dat het streven
naar een gezonde bodem zeer belangrijk is in de strijd tegen Rhizoctonia. Zo merkt men dat
op bepaalde percelen de schimmel wel aanwezig is, maar de gewassen niet worden
aangetast. Men spreekt in dit geval van een ziekte-werende bodem (Postma & Schilder,
2005). Een versterking van de ziekte werende eigenschappen van een bodem kan de ziekte
limiteren, maar de achterliggende mechanismen van dit fenomeen zijn nog niet helemaal
bekend. Naast fysische en chemische bodemfactoren spelen ook biologische eigenschappen
zoals concurrentiële micro- organismen (zie 7.2) een belangrijke rol in de onderdrukkende
werking op schimmelziekten. Hierboven werd reeds de bodemtemperatuur aangehaald,
28
maar ook bodem pH, textuur, structuur en bodembewerking hebben een grote invloed op de
aantasting (Höper & Alabouvette, 1996).
6.2.2.1
pH
Onderzoek heeft aangetoond dat verschillende isolaten van R. solani bij een pH gaande van
4 tot 8 in staat waren te groeien. De maximale groei werd waargenomen bij een pH van 7 en
de laagste groei bij een pH van 4. Ook werden er meer scleroten gevormd bij een hogere pH
dan bij een lage pH, maar algemeen kon besloten worden dat er een grote variatie was in
optimale pH voor de verschillende isolaten (Goswami et al., 2011). Een vergelijkbaar
resultaat werd onder andere ook gevonden door Chang (1985) die een optimale
myceliumgroei en vorming van scleroten vaststelde van R. solani AG-1 bij een pH van 7.
Ook Sharma en Chowdhury (1984) vonden dat de aantasting van R. solani hoger was bij een
pH van 7,4-8,5 dan bij neutrale pH. Bij hogere pH waarden dan 8 wordt de groei van
Rhizoctonia geremd (Chet & Baker, 1980). Dit is waarschijnlijk te wijten aan een hoog
Ca-gehalte in de bodem. Calcium zorgt voor een betere en luchtigere bodemstructuur, een
betere waterhuishouding en gaat verslemping tegen, daarnaast is het ook een voedingsstof
voor de plant. Dit alles leidt tot een gezondere bodem waardoor de ontwikkeling van andere
organismen wordt bevorderd en deze gaan concurreren met Rhizoctonia.
6.2.2.2
Bodemtextuur en -structuur
Over het algemeen komt Rhizoctonia meer voor op lichte gronden zoals zandgrond dan op
de klei- en leemhoudende gronden (Haesaert, 2013). Zandige bodems warmen doorgaans
sneller op en zijn droger dan klei- en leembodems door hun lager waterbindend vermogen,
dit ligt aan de basis van het verschil in aantasting. In het onderzoek van Gill et al. (2000)
werd voor verschillende vochtigheidsniveaus, namelijk 15, 30, 50 en 75 %, onder andere de
aantasting en verspreiding van R. solani AG-8 onderzocht. Hieruit bleek dat de reductie van
de wortelgroei na inoculatie met de schimmel afnam bij toenemende vochtigheid (figuur 8).
Figuur 8: Wortelgroei bij 15, 30, 50 en 75 % vochtigheid. De reductie van de wortelgroei na inoculatie met
de schimmel neemt af bij toenemende vochtigheid (Gill et al., 2000).
De afname van aantasting bij een stijgende vochtigheidsgraad kan onder andere verklaard
worden door een toename van microbiële activiteit, wat een negatief effect heeft op de groei
29
van de schimmel (zie verder). Ook de bodemstructuur speelt een rol, een slechte structuur
en slechte drainage bevorderen Rhizoctonia-aantasting. Echter ook op bodems met een
goede bodemstructuur kan de schimmel problemen veroorzaken (Buddemeyer & Märländer,
2004). In onderzoek van Harris et al. (2003) werd aangetoond dat de hoeveelheid van de
schimmelhyfen in de bodem afhankelijk is van de bodemdichtheid. Aanvankelijk stijgt de
hoeveelheid schimmelhyfen tot een bodemdichtheid van 1,4 mg m-3, vervolgens gaat het
aantal hyfen geleidelijk dalen. De schimmeldraden kunnen zich in een compactere bodem
minder goed uitbreiden dan in een lichte bodem met lage densiteit (figuur 9).
Figuur 9: De aanwezigheid van R. solani bij verschillende bodemdichtheden. Aanvankelijk stijgt de
-3
hoeveelheid schimmelhyfen tot een bodemdichtheid van 1,4 mg m , vervolgens gaat het aantal hyfen
geleidelijk dalen. (Harris et al., 2003)
6.2.2.3
Bodembewerking
De laatste jaren is er meer aandacht voor het toepassen van een niet-kerende
grondbewerking omdat dit de structuur, het organisch stof gehalte en het waterbindend
vermogen van de bodem ten goede komt en bovendien erosie beperkt (Holland, 2004).
Welke invloed dit systeem heeft op de ontwikkeling van ziekten en plagen is echter niet
éénduidig (Bockus & Shroyer, 1998). In het geval van Rhizoctonia zal een kerende
bodembewerking door middel van ploegen de graad van aantasting reduceren (Rovira,
1986). Door de kerende bewerking worden de schimmeldraden verstoord en worden ze
geremd in groei en ontwikkeling bij het drogen van de bodem na ploegen (Paulitz et al.,
2002). In een experiment waarbij gedurende drie seizoenen de aantasting door Rhizoctonia
bij een niet-kerende grondbewerking werd vergeleken met een kerende bewerking, kon
gemiddeld een reductie van 83 % vastgesteld worden bij de kerende grondbewerking t.o.v.
de niet-kerende bewerking, wat duidelijk het belang van ploegen weergeeft (Macnish, 1985).
30
7. Geïntegreerde controle van Rhizoctonia spp.
De controle van ziektes veroorzaakt door Rhizoctonia spp. is erg moeilijk aangezien de
grondgebonden schimmel erg divers is, vele waardplanten heeft en in staat is om scleroten
te produceren en saprofytisch te overleven op gewasresten (Ohkura, 2009). Met
fungicidenbehandelingen kan de infectie en de uitbreiding van deze plant pathogeen tegen
gegaan worden. Vaak zijn deze behandelingen onvoldoende effectief, daarom zijn ook
verschillende zaadfirma’s bezig met de ontwikkeling van R. solani resistente rassen. De inzet
van deze resistente rassen moet gecombineerd worden met preventie en biologische
bestrijdingsmiddelen.
7.1
Preventie
Om Rhizoctonia-ziekte tegen te gaan is preventie een zeer belangrijk punt waar elke
landbouwer de nodige aandacht aan moet besteden. R. solani wordt verspreid via regen of
irrigatiewater, via gereedschap dat gecontamineerde grond met zich meedraagt of via
besmet zaaigoed (Disco, 2010). De preventie voor Rhizoctonia houdt een goede drainage en
bodemstructuur in. Men dient hygiënisch te werken, wat wil zeggen dat besmette
gewasresten goed worden ingewerkt en gecontamineerd gereedschap wordt gereinigd.
Verder is schoon zaaizaad een vereiste alsook het niet te vroeg of diep zaaien en in een
grond die voldoende droog is. Tot slot is een ruime vruchtwisseling zonder andere
waardplanten erg belangrijk (Buizer et al., 2006).
7.1.1 Vruchtwisseling
Zoals ook bij vele andere schimmels wordt het ziekteverloop en de omvang van de schade
grotendeels bepaald door de infectiedruk vanuit de grond. Door het toepassen van een ruime
vruchtwisseling wordt het inoculum in de grond verminderd. De keuze van de gewassen die
in de rotatie worden opgenomen is afhankelijk van de Rhizoctonia soort en AG die aanwezig
is. Rhizoctonia bestaat uit verschillende anastomosegroepen die elk hun specifieke
waardplantenreeks hebben. Het is dus belangrijk dat hier in de vruchtwisseling rekening mee
gehouden wordt. Algemeen bevordert een rotatie van suikerbiet, maïs, gras en
vollegrondsgroenten de R. solani populatie in de bodem. Klassieke granen, gele mosterd of
bladrammenas in de rotatie verminderen de problemen (zie ook verder) (Haesaert, 2013).
Een goede rotatie kan dus helpen om de ziekte te onderdrukken en leidt bovendien ook tot
een meer gezonde bodem (Schillinger & Paulitz, 2006). De laatste jaren duiken echter
gevallen op van kruisaantasting waarbij ook de niet-waardplanten worden aangetast. Zo
merkte men in New York op dat bij het kweken van groenten de rotatie met maïs niet
effectief meer was om Rhizoctonia te onderdrukken (Ohkura et al.,2009).
Andere auteurs benadrukken de mogelijkheid om via monocultuur een specifieke
antagonistische populatie op te bouwen. Een afname van de ziekte door R. solani werd
reeds aangetoond in monoculturen van tarwe, suikerbieten, aardappelen en bloemkool
(Anees et al., 2010; Postma et al., 2010; Sneh et al., 1996; Weller et al., 2002).
31
7.2
Biologische bestrijding m.b.v. micro-organismen
Omwille van de toenemende problemen bij het toepassen van een chemische
bestrijding, zoals het optreden van resistentie, het kleiner aantal beschikbare werkzame
stoffen en de druk op het milieu, groeit de interesse in biologische bestrijdingsmiddelen
(Heydari & Pessarakli, 2010; Whipps & Davies, 2000). Biologische bestrijding is het
bestrijden van plagen en ziekten met biologische methoden of natuurlijke vijanden van
de plaag of ziekte (Gerhardson, 2002). Tegen Rhizoctonia spp. zijn in verschillende
cultuurgewassen tal van micro-organismen gekend die effectief zijn tegen het
pathogeen, anderen hebben dan weer het vermogen om de resistentie van de plant te
verhogen (Raaimakers et al., 2009). Hieronder worden enkele van deze bacteriën en
schimmels besproken, hun classificatie is in tabel 4 weergegeven.
Tabel 4: Classificatie van enkele micro-organismen effectief tegen Rhizoctonia (ncbi, 2014)
Rijk
Stam
Klasse
Orde
Familie
Geslacht
Soort
Fungi
Ascomycota
Sordariomycetes
Hypocreales
Hypocreaceae
Trichoderma
Trichoderma
harzianum
Fungi
Ascomycota
Eurotiomycetes
Eurotiales
Aspergillaceae
Penicillium
Meerdere
Fungi
Glomeromycota
Glomeromycetes
Glomerales
Glomeraceae
Meerdere
Meerdere
Bacteria
Proteobacteria
Gammaproteobacteria
Pseudomonadales
Pseudomonadaceae
Pseudomonas
Pseudomonas
fluorescens
7.2.1 Trichoderma spp. en Penicillium spp.
Trichoderma spp. zijn nuttige, vrijlevende bodemschimmels behorende tot het fylum van de
Ascomycota die op bijna alle grondsoorten en substraten kunnen voorkomen. De meest
toegepaste Trichoderma-soort is Trichoderma harzianum, er zijn echter nog andere
specifieke parasieten van R. solani zoals Trichoderma hamatum (Harman et al., 2004). Deze
schimmels zijn vooral bekend om hun groeibevorderende effecten. Trichoderma maakt fosfor
en andere nutriënten beter oplosbaar, verhoogt de efficiëntie van het stikstofgebruik en
stimuleert de wortelontwikkeling (Harman, 2006). Hierdoor gaat minder energie verloren in
de afweer tegen ziekteverwekkende schimmels en blijft meer energie over voor o.a.
plantengroei.
Trichoderma spp. hinderen ook direct de pathogeengroei door mycoparasitisme, ze gaan
zich dus voeden met het mycelium van het pathogeen. Deze parasitering door Trichoderma
spp. bestaat uit een aantal stappen. De eerste stap is chemotropisme, dit is de gerichte groei
naar het pathogeen op basis van een chemische gradiënt. Hierna komt herkenning en twee
tot drie dagen na inoculatie volgt de aanhechting en wikkeling rondom de hyfen. Vervolgens
worden celwand degraderende enzymen geproduceerd waaronder chitinasen, glucanasen,
proteasen en cellulasen en na voldoende afbraak kan Trichoderma de gastheer penetreren
(Steyaert et al., 2003). De nutriënten van de antagonist kunnen nu geëxtraheerd en
aangewend worden voor eigen groei (Dos Reis Almeida et al., 2007).
32
Ook zijn bepaalde schimmels in staat om antibiotica te produceren, zo is de aanmaak van
onder andere gliotoxine en peptaibolen door verschillende Trichoderma soorten een
onderdeel van hun antifungale werking (Howell, 2003; Kubicek et al., 2007).
Commerciële inocula van Trichoderma zijn reeds op de markt beschikbaar voor de
bestrijding van R. solani, zoals bijvoorbeeld TRIANUM-P van Koppert B.V. (Mechelen,
België).
Net zoals Trichoderma spp. zijn Penicillium spp. mycoparasieten en kunnen een aantal
soorten een antagonistische activiteit uitoefenen op Rhizoctonia. Dikwijls kunnen deze
soorten microscopisch waargenomen worden op het mycelium van Rhizoctonia.
In sommige gevallen is de werking van deze schimmels gesteund op de productie van
toxische metabolieten en spreekt men van necrotische mycoparasitisme (Anderson et al.,
1988).
7.2.2 Arbusculaire mycorrhiza
Arbusculaire mycorrhiza schimmels (AMF) zijn endogene schimmels die behoren tot het
fylum van de Glomeromycora. Ze zijn genoemd naar de sterk vertakte intracellulaire,
boomvormige schimmelstructuren (arbuscules) die ze vormen binnen hun gastheer. Voor
landbouwgewassen zijn de arbusculaire mycorrhiza’s zeer relevant, meer dan 80 % van alle
plantensoorten kan een symbiose aangaan met deze schimmels. De meeste mycorrhiza
schimmels zijn voor hun energie en koolstof afhankelijk van deze symbiose met de plant,
want ze hebben weinig of geen mogelijkheid om op dood organisch materiaal te groeien. De
arbuscules die gevormd worden in de cellen van de binnenste wortelcortex vormen de
uitwisselingsplaatsen, waar de mycorrhiza zich voeden met de assimilaten aangemaakt door
de planten (Hodge, 2000). In ruil voor deze voedingsstoffen verhogen AMF de absorptie
(vooral van fosfor) en de tolerantie van de plant ten aanzien van zware metalen, waterstress,
bepaalde pathogene schimmels (vooral bodempathogenen) en nematoden (Blaszkowski,
2003).
De biocontrole van AMF bestaat uit een competitie voor infectieplaatsen en fotosynthetische
producten waardoor de wortelschade door pathogenen ingeperkt wordt. Verder resulteert
kolonisatie door AMF in een hogere resistentie van planten via een aantal fysische en
fysiologische processen, waaronder het verhogen van de celwanddikte of veranderingen in
de opbouw van de microbiële gemeenschappen in de mycorrhizosfeer.
Het toedienen van AMF blijkt inderdaad een remmend effect te hebben op de infectie door
Rhizoctonia. In het onderzoek van Yao et al. (2002) werden aardappelen van het ras
Goldrush geïnoculeerd met Glomus etunicatum en na drie weken werden de planten in
contact gebracht met R. solani. In vergelijking met de planten die niet met AMF werden
geïnoculeerd was een reductie in aantasting waar te nemen van 60,2 tot 71,2 %.
33
7.2.3 Pseudomonas bacteriën
Het genus Pseudomonas is één van de meest veelbelovende groepen van de
rhizosfeerbewoners die reeds bewezen heeft een positief effect te hebben op het vlak van
ziekte-onderdrukking van Rhizoctonia spp. (O’ Sullivan & O’ Gara, 1992). De interesse naar
de inzet van dit genus in de biologische bestrijding van bodempathogenen is erg groot en dit
omwille van zijn positieve kenmerken. Zo worden de Pseudomonas bacteriën gekenmerkt
door een snelle in vitro groei, goede kolonisatie van plantenwortels, snelle
vermenigvuldiging, gebruik van wortelexudaten als voedselbron, productie van een breed
spectrum aan bioactieve metabolieten, agressieve competitie met andere micro-organismen
en snelle adaptatie aan omgevingsstress (Weller, 2007).
De biologische bestrijding door bacteriën is gesteund op vijf mechanismen. De eerste
methode die de biologische bestrijders hanteren in de onderdrukking van het pathogeen is
competitie. Door de competitie voor belangrijke nutriënten zoals koolstof, stikstof en ijzer,
kan het pathogeen niet genoeg nutriënten opnemen waardoor deze onderdrukt wordt. Zo
produceren fluorescerende Pseudomonas bijvoorbeeld sideroforen, dit is een ijzerbindend
ligand dat zorgt voor een zeer efficiënte opname van ijzer (Haas & Defago, 2005).
Net zoals Trichoderma en Penicillium spp. zijn Pseudomonas ook in staat om aan
mycoparasitisme te doen.
Een volgend belangrijk mechanisme in de biologische bestrijding door micro-organismen is
de productie van antibiotica. Zo produceren Pseudomonas spp. o.a. fenazine derivaten,
waterstofcyanide en pyrrolnitrine (Raaijmakers et al., 2006). Een voorbeeld hiervan is de
productie van phenazine-1-carboxamide (PCN) en fenazine-1-carboxylzuur (PCA) door
Pseudomonas CMR12a dat werd geïsoleerd uit de rhizosfeer van cocoyam in Kameroen en
gebruikt wordt in de biologische bestrijding van Pythium myriotylum (Perneel et al., 2007).
Een andere methode is inductie van systemische resistentie. Dit fenomeen is reeds
waargenomen in rijst en tomaten (P. fluorescens en P. aeruginosa) en ook in sojaboon
(P. aureofaciens) (Nandakumar et al, 2001; Siddiqui & Shaukat, 2002; Jung et al., 2007).
Tot slot kunnen ze ook bio-emulgatoren produceren als bestrijding van pathogenen. Bioemulgatoren of biosurfactants zijn oppervlakte-actieve stoffen die de eigenschappen van een
vloeistof in de buurt van grensvlakken veranderen en ze bezitten zowel een hydrofiel als een
lipofiel gedeelte. Ze zorgen ervoor dat bacteriën zich beter op of naar het plantoppervlak
kunnen bewegen, dat bepaalde componenten beter beschikbaar zijn als substraat voor de
bacteriën en door hun amfipatische eigenschappen is er meer interactie met membranen. In
vitro werd reeds de antagonistische werking van enkele cyclische lipopeptiden zoals
viscosinamide en tensine tegen R. solani aangetoond (Nielsen et al., 1999; Nielsen et al.,
2000). Ook Pseudomonas CMR12a produceert biosurfactants, namelijk de cyclische
lipopeptiden motiline en sissiline.
34
7.3
Invloed van organisch materiaal
Omwille van de reeds eerder genoemde toenemende problemen bij het toepassen van een
chemische bestrijding en de druk op het milieu werd gezocht naar alternatieven zoals het
gebruik van organische materialen (Abbasi et al., 2006). Het toepassen van organisch
materiaal zou zorgen voor een reductie van voorkomen en agressiviteit van bodemgebonden
ziektes (Subbarao & Hubbard, 1999). Verschillende factoren zoals type plantenmateriaal,
tijdstip en manier van toedienen en overige biologische, chemische en fysische factoren
hebben echter wel een sterke invloed op de efficiëntie van het toegevoegde organische
materiaal (Lazarovits et al., 2005). Compost, Brassicaceae plantenresten en lignine zijn drie
vormen van organisch materiaal die worden ingezet in de bestrijding tegen Rhizoctonia en
om het nutriëntentgehalte van de bodem op peil te houden.
7.3.1 Compost
Compost wordt verkregen wanneer vers organisch materiaal via aërobe microbiële
afbraakprocessen wordt omgezet tot een gehomogeniseerd product. Dit product bevat een
hoog gehalte aan organische stof en organisch gebonden stikstof. Door de hoge
temperaturen die tijdens het composteringsproces bereikt worden en de stabiele microbiële
populatie kunnen aanwezige pathogenen worden afgedood. Compost is echter een heel
heterogeen product door het verschil in startmateriaal, composteringsmethode en leeftijd van
de compost. Hierdoor kan het effect van compost op Rhizoctonia sterk verschillen van
situatie tot situatie (Tuitert et al., 1998). Zo bleek uit het onderzoek van Hoitink & Boehm
(1999) dat slechts in 20 % van de gevallen compost een invloed had op de onderdrukking
van R. solani en dat compost gemaakt van lignocellulose-rijk materiaal met een hoger
aandeel aan Trichoderma spp. het grootste positief effect had. De effectiviteit van de
compost hangt dan ook in grote mate af van de aanwezigheid van micro-organismen die een
antagonistische werking hebben op de pathogene organismen (Scheuerell & Mahaffee,
2005).
7.3.2 Brassicaceae plantenresten
De groenbemesters gele mosterd (Sinapis alba L.) en bladrammenas (Raphanus sativus L.)
worden vaak ingezet in de bestrijding van Rhizoctonia. Ze behoren tot de familie van de
kruisbloemigen, de Brassicaceae, en bezitten heel wat landbouwkundige voordelen. Zo
zorgen ze voor een stijging van de hoeveelheid organisch materiaal in de bodem, een daling
van het stikstofverlies in de winter en een verbetering van de bodemstructuur (Snapp et al.,
2007). Deze kruisbloemigen worden ingezet ter onderdrukking van Rhizoctonia omdat ze
glucosinolaten bevatten. Dit zijn belangrijke zwavelhoudende secundaire metabolieten die
door enzymen kunnen worden gehydrolyseerd tot isothiocyanaten. Het zijn voornamelijk
deze isothiocyanaten die zorgen voor de fungicide eigenschappen. R. solani is vatbaar voor
deze stof, maar de gevoeligheid is zeer afhankelijk van onder andere de anastomosegroep
en verschijningsvorm van de schimmel. Het proces waarbij specifieke plantensoorten die
duidelijk gedefinieerde toxische moleculen bevatten die schadelijke schimmels in de bodem
kunnen aantasten wordt biofumigatie genoemd. De exacte werkingswijze van deze
glucosinolaten en hun degradatieproducten ten aanzien van de onderdrukking van R. solani
is echter nog niet volledig opgehelderd (Lamers et al., 2004).
35
7.3.3 Lignine
Lignine is de meest voorkomende organische component in planten na cellulose. Het is een
heteropolymeer dat wordt gevormd via oxidatieve copolymerisatie van de fenolische
monomeren p-coumaryl, coniferyl en sinapyl (Thevenot et al., 2010). Lignine is in planten
chemisch verbonden met cellulose en hemicellulose, wat zorgt voor de stevigheid van de
celwand en bescherming tegen cellulose afbrekende organismen. Enkele schimmels met
ligno cellulose afbrekende eigenschappen kunnen zorgen dat de cellulose ter beschikking
komt. Deze schimmels zijn basidiomyceten en worden ook wel witrotschimmels genoemd.
Butler & Day (1998) vonden dat de lignine degraderende enzymen geproduceerd door deze
schimmels ook melanine konden afbreken. Melanine wordt teruggevonden in de celwand
van de hyfen en in de scleroten van Rhizoctonia, het zorgt onder andere voor bescherming
tegen uitdroging en straling, maar ook voor de druk die opgebouwd wordt in de appressoria
(Butler et al., 2005). Het belangrijkste enzym in de afbraak van melanine is mangaan
peroxidase en dit zorgt er dus voor dat melanine in scleroten wordt afgebroken en deze zo
meer vatbaar worden voor biotische en abiotische stress. Van Beneden et al. (2010) toonden
aan dat scleroten in grond aangerijkt met lignine meer vatbaar waren voor parasitisme door
Trichoderma spp.. Ook bleek dat de incorporatie van Kraft Pine Lignine, een zijproduct van
de papierindustrie, in de bodem een reducerend effect had op de scleroten van R. solani.
Deze waarnemingen gingen gepaard met een activiteitsstijging van het enzym mangaan
peroxidase. Om melanine afbraak te stimuleren, zou men deze witrotters (bijvoorbeeld
oesterzwam of bruine eikenzwam) kunnen toedienen aan de bodem, maar aangezien zij
vaak reeds in hoge aantallen aanwezig zijn in de bodem, is inoculatie meestal overbodig.
7.4
Resistente rassen
Een groot deel van de beheersing van Rhizoctonia in de bietenteelt komt van de inzet van
resistente rassen. Deze werden in 2001 in Europa geïntroduceerd en het totale aandeel van
de Rhizoctonia en Rhizomanie resistente rassen bereikte in 2007 al een aandeel van ruim
18 %. Door het inzetten van deze rassen wordt getracht de verdere uitbreiding van R. solani
in te perken en de opbrengst te stabiliseren (Büttner et al., 2002). Deze tolerantie zorgt
echter niet voor een volledige immuniteit, maar de kolonisatie van het wortelweefsel is
minder dan bij een gevoelig ras.
Indien de infectiedruk laag is, moet het gebruik van deze tolerante rassen vermeden worden,
Er bestaat namelijk een omgekeerde relatie tussen het resistentieniveau en het
opbrengstpotentieel, hoe resistenter het ras, hoe lager de opbrengst.
Ook in de aardappel-, maïs- en graanteelt worden verschillen in gevoeligheid gevonden
tussen verschillende rassen met betrekking tot stengelaantasting en opbrengstderving, maar
deze rasverschillen zijn heel wat minder duidelijk (Postma et al., 2004).
7.5
Chemische bestrijding
Indien bovenstaande methoden niet voldoende zijn om Rhizoctonia aantasting tegen te
gaan, moet men overgaan tot een chemische bestrijding. Vroeger werd vaak
bodemontsmetting toegepast, deze methode is echter niet zo efficiënt door de snelle
36
herbesmetting van de grond. Voor 2006 werd frequent het bodemontsmettingsmiddel met
breed werkingsspectrum methylbromide gebruikt, maar dit middel werd, net zoals zijn
alternatief product 1,3-dichloorpropeen, verboden.
Vooral in de aardappelteelt zijn er werkzame stoffen die worden ingezet als
pootgoedontsmetting. Zo heb je formuleringen gebaseerd op flutolanil, dat wordt ingezet
tegen R. solani bij aardappelen maar ook tegen R. cerealis bij granen. Het verhindert vooral
de schimmelgroei en penetratie vanuit de infectiekussentjes. Ook pencycuron, azoxystrobine
en mepronil worden als droogontsmetting ingezet tegen R. solani bij aardappelpootgoed.
7.5.1 Sedaxane
Sedaxane is een nieuwe werkzame stof ontworpen voor zaadontsmetting door Syngenta.
Het is een breed werkend fungicide dat kan worden ingezet tegen bodem- en zaad
overdraagbare schimmelziekten zoals Rhizoctonia solani, Ustilago en Tilletia species,
Microdochium nivale en Typhula incarnata. Dit fungicide behoort tot de groep van de
succinaat dehydrogenase inhibitoren. Deze inhiberen het metabolisme van de schimmel
door binding met het succinaat dehydrogenase enzym waardoor de cellulaire respiratie en
energieproductie worden geremd (figuur 10). Het toepassen van dit middel zorgt voor een
verbetering van de kwaliteit van de wortels, een betere opkomst en stresstolerantie, wat leidt
tot een hogere opbrengst (Syngenta, 2011).
In het onderzoek van Goll et al. (2014) werd reeds de gevoeligheid van verschillende
Rhizoctonia isolaten voor dit fungicide getest. Hieruit bleek dat alle isolaten gevoelig waren
voor Sedaxane en er geen significant verschil was tussen de verschillende isolaten
afkomstig van verschillende landen.
Figuur 10: Inhibitie van het metabolisme van de schimmel door sedaxane. Door binding met het succinaat
dehydrogenase enzym wordt de Krebs cyclus en daarmee ook de cellulaire respiratie en energieproductie
geremd.
In deze thesis wordt de efficiëntie van dit product nagegaan door behandelde tarwezaden op
medium te laten kiemen. Hieraan wordt inoculum toegevoegd van de verzamelde
Rhizoctonia isolaten.
37
HOOFDSTUK 2 : Experimenteel gedeelte: Diversiteit
van Rhizoctonia in landbouwgewassen
1. Doelstelling
Het genus Rhizoctonia bestaat zoals eerder gezegd uit een heterogene verzameling van
schimmels die verschillende eigenschappen gemeen hebben maar genetisch tot
verschillende groepen (AG) behoren. Het eerste deel van deze thesis bestaat uit het in kaart
brengen van de diversiteit van Rhizoctonia in landbouwgewassen verspreid over
Vlaanderen. Zo kan een beeld geschetst worden van de in Vlaanderen aanwezige soorten
en kan overgegaan worden tot een effectieve bestrijding. In het tweede deel wordt de
pathogeniteit van de verzamelde Rhizoctonia isolaten op niet behandelde tarwezaden getest.
Vervolgens wordt voor een selectie van de isolaten de gevoeligheid aan de werkzame stof
sedaxane nagegaan. Figuur 11 geeft de verschillende stappen van dit onderzoek weer.
Figuur 11: Schematisch overzicht experimenteel gedeelte
2. Materiaal en methoden
2.1
Diversiteit van Rhizoctonia in landbouwgewassen
2.1.1 Aanleggen collectie isolaten met wortels als startmateriaal
Gedurende de oogstperiode van het jaar 2013 werden verspreid over Vlaanderen stalen
genomen in verschillende landbouwgewassen. De nadruk werd gelegd op wintertarwe, maar
ook in andere traditionele granen zoals gerst en triticale werden stalen genomen. Verder
werden nog stalen van maïs en in mindere mate bieten en aardappelen onderzocht. Een
overzicht van de locaties, de voorvrucht en bodemsoort worden weergegeven in bijlage 1.
Bij deze staalnames werd gericht te werk gegaan en gezocht naar plaatsen in het perceel
waar er aantasting van Rhizoctonia zou kunnen zijn. Om een representatief staal te
bekomen werden er voor de granen verspreid over het veld 20 wortels uitgetrokken, voor
maïs en bieten waren dit er 10. In het geval van de aardappelen werd op de geoogste
knollen in de schuur op zoek gegaan naar symptomen van Rhizoctonia.
38
Van elke wortelstaal werden acht wortelstukken van ongeveer 1 cm afgesneden. In een
verticale flow werden deze eerst gedesinfecteerd in 1 % bleekwater om oppervlakkige
schimmels en bacteriën af te doden. Vervolgens werden ze twee maal afgespoeld in steriel
water en op wateragar medium gelegd. Aan dit arm medium werd ook telkens 800 µl van 1 M
NaOH toegevoegd om de groei van andere schimmels tegen te gaan en die van Rhizoctonia
te bevorderen. Na een incubatieperiode van 2 tot 4 dagen bij kamertemperatuur in een
donkere omgeving werden de platen onderzocht op mogelijke Rhizoctonia-kolonies. De
schimmels waarvan het mycelium een groei vertoonde dat vergelijkbaar was met die van een
referentie isolaat werden met behulp van een ponsbuis nogmaals overgezet op wateragar.
Via een dissectiemicroscoop konden de rechte vertakkingen waargenomen worden (figuur
12), wat het zoeken naar Rhizoctonia-achtige kolonies vergemakkelijkte. Tot slot werden
deze na een incubatieperiode van opnieuw 2 tot 4 dagen bij kamertemperatuur overgezet op
het rijk medium potato dextrose agar (PDA), waar ook het antibioticum chlooramfenicol (100
mg/l) werd aan toegevoegd. Om isolaten te bekomen die 100 % zuiver zijn, werd getracht
één enkele hyfe over te zetten van wateragar naar PDA. Deze hyfe werd onder de
microscoop aangeprikt en met een steriele pasteurpipet overgezet. Indien mogelijk kon dit
ook met een ponsbuisje gebeuren. De zuivere isolaten werden vervolgens bewaard bij 5 °C.
Figuur 12: Rechte vertakkingen zichtbaar onder dissectiemicroscoop
2.1.2 Aanleggen collectie isolaten via tandenstokermethode
Een tweede set isolaten werd via de tandenstokermethode aangelegd zoals beschreven
door Paulitz & Schroeder (2005). Hierbij gebruikt men bodemstalen als startmateriaal i.p.v.
wortels zoals hierboven beschreven. Een deel van deze bodemstalen werd verkregen op
hetzelfde moment van de eerste staalnames, het overige gedeelte werd kort na de winter
verzameld op nieuwe percelen. Deze bodemstalen werden op dezelfde manier als de wortels
verkregen, namelijk door gericht te zoeken naar plaatsen waar aantasting door Rhizoctonia
mogelijk was. Deze stalen werden tot slot samengebracht tot een representatief mengstaal.
Per mengstaal werden twee tandenstokers gedurende 48 uur in de aarde geïncubeerd.
Vervolgens werden de tandenstokers overgeplaatst op wateragar medium met carbenicilline
(50 mg/l) en streptomicine (50 mg/l) (zie figuur 13). De stappen die hierop volgen zijn
dezelfde zoals onder 2.1.1 beschreven.
39
Figuur 13: Tandenstokermethode
2.1.3 DAPI-kleuring
De eerste stap in de identificatie is het onderscheiden van de tweekernige Rhizoctonia
isolaten van de meerkernige R. solani isolaten. Eerst werd een stockoplossing gemaakt van
1 mg 4,6-diamino-2 fenyl indole, dihydrochloride (DAPI; Sigma-Aldrich) per ml
dimethylformamide. Vervolgens werd jong mycelium afkomstig van de zuivere isolaten in een
3:1 ethanol:azijnzuuroplossing gebracht gedurende ten minste tien minuten. Na afspoeling
met gedestilleerd water werden de cellen in een verdunning van de stockoplossing (10 µg
stockoplossing per ml gedestilleerd water) gebracht gedurende tien minuten en opnieuw
afgespoeld met gedestilleerd water. Tot slot werden de cellen in 25 % glyceroloplossing
gebracht. Na deze kleuring kon het aantal kernen geteld worden met een Olympus BX51
microscoop. De preparaten kunnen via deze methode gedurende een lange tijd bewaard
worden. Indien lange bewaring niet nodig was, werd een druppel DAPI aan een concentratie
van 10 µl per ml rechtstreeks op het preparaat gebracht en bekeken onder de microscoop.
Resultaten van deze kleuring worden in hoofdstuk 4 onder 1.2 weergegeven.
2.1.4 PCR analyse van de rDNA-ITS regio
Mycelium afkomstig van de bekomen zuivere isolaten werd overgezet op vloeibaar PDB en
gedurende een week geïncubeerd bij kamertemperatuur in een donkere omgeving.
Vervolgens werden de schimmels met behulp van een steriele pincet en pipet in
eppendorfbuisjes overgebracht en gecentrifugeerd gedurende 10 minuten. Nadien kon de
waterige fase afgepipetteerd worden. Na spoelen met gedestilleerd water en opnieuw
centrifugeren gedurende 10 minuten werden de eppendorfbuisjes gedurende ten minste 30
minuten in de vriezer bewaard bij - 80°C. Vervolgens werd het materiaal gevriesdroogd en
kon het gedurende langere tijd bewaard worden bij kamertemperatuur.
Verdere extractiestappen werden uitgevoerd met behulp van een commerciële DNA-extractie
kit (Invisorb Spin Plant Mini Kit, Stratec molecular). Primers ITS4 en ITS5 werden gebruikt
voor de amplificatie van de nucleaire rDNA-ITS regio. Voor de PCR reactie werd gewerkt
met een hoeveelheid van 2 µl genomisch DNA (50 ng/µl) verkregen uit deze extractie
waaraan 23 µl PCR-mix werd toegevoegd. Deze mix bestaat uit 5 µl 5x GoTaq PCR buffer,
1,25 µl dNTPs (5mM), 1 µl van elke primer (5 µM), 0,12 GoTaq polymerase (5u/µl) en 14,63
µl steriel zuiver water. De PCR reactie start met de initiële denaturatiestap van 5 min bij 94
40
°C, gevolgd door 40 cycli van 45 sec bij 94 °C, 30 sec bij 52 °C en 90 sec bij 72 °C om af te
sluiten met de finale extensie stap van 6 min bij 72 °C.
2.1.5 Sequenering van de ITS-rDNA regio
Primers ITS4 en ITS5 werden in de PCR reactie dus gebruikt voor de amplificatie van de
ITS-regio, meer bepaald de nucleaire ribosomale 18S-5.8S-28S gen cluster (White et al.,
1990). De PCR producten werden geanalyseerd via elektroforese (120 V, 40 min) op een 1,5
% agarose gel in 1x TAE buffer. Indien men na de PCR bandjes ziet op de gel, dan kan men
besluiten dat de PCR reactie geslaagd is. Om de overschotten van primers en dNTP’s te
verwijderen na de PCR reactie werd op de PCR-producten een purificatie uitgevoerd, hierna
konden deze gevriesdroogd worden en opgestuurd naar Macrogen te Korea waar de
eigenlijke sequenering werd uitgevoerd. Resultaten van deze sequenering worden onder 1.3
weergegeven.
2.2
In vitro bepaling van de pathogeniteit van de Rhizoctonia isolaten op
tarwezaden
Om de pathogeniteit van de verzamelde Rhizoctonia isolaten na te gaan werden in vitro
pathogeniteitstesten opgezet. Hierbij werd nagegaan wat het effect is van de schimmel op de
kieming van niet behandelde tarwezaden. De zaden werden eerst gesteriliseerd in 1 %
bleekwater, dan in 70 % ethanol en vervolgens afgespoeld met steriel gedemineraliseerd
water. Per herhaling werden 8 van deze zaden op een gelijke afstand gelegd op Gamborg
B5 medium in vierkanten petriplaten van 12 cm op 12 cm. Tussen twee zaden werd een
ponsje van actief groeiend mycelium geplaatst als inoculum. Deze opstelling wordt in figuur
14 weergegeven. Na een incubatie van 62 uur bij kamertemperatuur waren de zaden
gekiemd en kon de plaat worden rechtgezet om een correcte verdere groei te garanderen.
Verder werd de onderste helft van de petriplaat afgedekt met aluminiumfolie zodat de wortels
in het donker konden groeien. Na zeven dagen incubatie werden de ziektesymptomen van
de zaailingen gescoord. Kieming van de zaden (0 of 1), het aantal wortels, lengte en
aantasting van de wortels, lengte en aantasting van de hypocotyl (0 tot 4) werden hierbij
opgemeten.
Figuur 14: Opstelling agressiviteitstest
41
2.3
In vitro bepaling van de pathogeniteit van de Rhizoctonia oryzae
isolaten op maïszaden
In tabel 6 onder 1.3 ‘sequenering van de ITS-rDNA regio’ worden de gesequeneerde
Rhizoctonia isolaten weergegeven. Uit deze sequenering bleken twee isolaten (isolaat 10 en
12) Rhizoctonia oryzae te zijn. Aangezien deze voornamelijk maïs als waardplant heeft, leek
het interessant om bovenstaande agressiviteitstest voor deze twee isolaten ook met
maïszaden uit te voeren. De zaden waren afkomstig van de proefhoeve te Bottelare en
waren van de variëteit Messago (AVEVE). Deze zaden waren reeds behandeld met Mesurol,
gebaseerd op de werkzame stof methiocarb (carbamaten), dit is een belangrijk product tegen
vogels en fritvliegschade in maïs. Door de zaden goed te spoelen met water kon deze laag
ontsmetting verwijderd worden.
De opstelling van de proef is volledig hetzelfde als voor de tarwezaden, maar hier werden
per plaatje slechts zes zaden uitgelegd i.p.v. acht. Dit wegens de grotere vorm van de
maïszaden. Isolaat 10 en 12 werden als inoculum toegevoegd en ook een controlereeks
werd in deze proef opgenomen. De scoring van de parameters verliep ook analoog aan de
hierboven beschreven werkwijze.
2.4
In vitro bepaling van de gevoeligheid aan de werkzame stof sedaxane
Voor een selectie van de verzamelde isolaten werd ook de gevoeligheid voor de chemische
actieve stof sedaxane nagegaan. Op deze manier kan men zien of dit middel zorgt voor een
hogere opbrengst door een verbetering van de kwaliteit van de wortels en een betere
opkomst. De zaden werden gecoat met het product Vibrance Gold, dat 4,7 % W/W sedaxane
bevat. De verdere samenstelling van dit product wordt in tabel 5 weergegeven. De
behandeling werd herhaald voor drie verschillende concentraties, namelijk 1 liter per ton,
2 l/ton en 4 l/ton. Aan de hand van het duizendkorrelgewicht van de tarwezaden kon de
benodigde hoeveelheid van het product berekend worden. De verdere opstelling en scoring
van deze proef verliep op dezelfde wijze zoals hierboven beschreven voor de
agressiviteitstest.
Tabel 5: Samenstelling Vibrance Gold
Chemische naam
Concentratie
Sedaxane
Fludioxonil
Difenoconazool
Propane-1,2-diol
Poly(oxy-1,2-ethanediyl),alfa-9-octadecenylomega-hydrocy-,(Z)-
4,7 % W/W
2,3 % W/W
2,3 % W/W
5 - 10 % W/W
5 - 10 % W/W
42
2.5
Statistische verwerking van de in vitro testen
Vervolgens werd de volledige dataset van beide in vitro testen verwerkt met het statistisch
programma IBM SPSS Statistics 20. Om na te gaan of er verschillen waren in agressiviteit
tussen de verschillende isolaten kan gebruik gemaakt worden van een ANOVA test.
Aangezien de resultaten van de testen schattingen en scores zijn en hier dus niet aan de
voorwaarden voor een ANOVA voldaan is, moet men overgaan naar het niet-parametrische
alternatief, namelijk een Kruskal Wallis test (P<0,05). Deze Kruskal Wallis test geeft weer of
er significante verschillen zijn, indien dit het geval is moeten de verschillende groepen twee
aan twee vergeleken worden met een Mann-Whitney U test. Door de grootte van de
uitgevoerde proeven was dit echter niet mogelijk en werd om de significante verschillen
tussen de groepen na te gaan toch gebruik gemaakt van de parametrische post hoc Tukey
test. Om het effect van de zaadbehandeling na te gaan wordt binnen één anastomosegroep
gekeken naar de verschillen tussen de dosissen. Deze testen zijn kleiner van omvang en
hierbij kon men wel de Mann-Whitney U test gebruiken (P<0,05).
43
HOOFDSTUK 3 : Resultaten en bespreking
1. Diversiteit van Rhizoctonia in landbouwgewassen
1.1
Aanleggen collectie isolaten
Een overzicht van alle verzamelde stalen met hun locatie, voorvrucht en bodemsoort wordt in
bijlage 1 weergegeven. Hierbij wordt onderscheid gemaakt tussen de stalen die zijn
onderzocht via de wortelmethode, via de tandenstokermethode of beide methoden. Na
opzuivering en selectie van de stalen werden zuivere isolaten bekomen die verder
onderzocht werden via DAPI-kleuring, PCR en sequenering.
Parallel met de testen van de bekomen isolaten afkomstig van op het veld werd ook gewerkt
met enkele referentie isolaten afkomstig van de schimmelcollectie van Universiteit Gent,
MUCL te Louvain-la-Neuve en de proefhoeve te Bottelare.
1.2
DAPI-kleuring
Na uitvoering van de kleuring zoals beschreven in hoofdstuk 2, 2.1.3 ‘DAPI-kleuring’, konden
duidelijk de kernen waargenomen worden. Zo was het mogelijk een onderscheid te maken
tussen tweekernige (figuur 15) en meerkernige (figuur 16) Rhizoctonia isolaten. Maar bij
deze stap konden ook de isolaten die niet behoorden tot het genus Rhizoctonia gedetecteerd
worden (figuur 17).
Figuur 15: Binucleate Rhizoctonia isolaten
44
Figuur 16: Multinucleate Rhizoctonia isolaten
Figuur 17: Geen Rhizoctonia: sporenvormende schimmels
1.3
Sequenering van de ITS-rDNA regio
Om te controleren of de PCR reactie geslaagd was, werd steeds 2 µl DNA op gel gezet en
een elektroforese uitgevoerd. Na amplificatie met de ITS4-ITS5 primers worden amplicons
van de ITS regio (nucleaire ribosomale 18S-5.8S-28S gen cluster) bekomen met een grootte
van ongeveer 700 basenparen, deze grootte kan men verifiëren a.d.h.v. de DNA ladder. In
onderstaande figuur is het resultaat van de elektroforese weergegeven voor enkele isolaten
bekomen via de wortelmethode.
Figuur 18: Bandenpatroon na amplificatie met ITS4-ITS5 primers
45
Vervolgens werden de PCR producten gezuiverd en gesequeneerd. In tabel 6 worden de
isolaten weergegeven die na de sequenering van het genus Rhizoctonia bleken te zijn en die
verder gebruikt werden in het tweede deel van dit onderzoek (enkel isolaat 23, R. oryzae,
werd wegens tijdsgebrek niet meer opgenomen in de proeven). De resultaten van de
sequenering van alle overige stalen worden in bijlage 2 weergegeven. Isolaten 15 t.e.m. 21
zijn stalen afkomstig van aardappelen van het bedrijf Agripom te Tielt. De overige isolaten
waarvoor geen voorvrucht en bodemtype weergegeven is zijn referenties.
Tabel 6: Verzamelde collectie Rhizoctonia isolaten
Isolaat
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
Gewas
/
Sla
Wintertarwe
Aardappel
Sla
Sla
/
/
/
Wintertarwe
Wintertarwe
Wintertarwe
Aardappel
Maïs
Aardappel
Aardappel
Aardappel
Aardappel
Aardappel
Aardappel
Aardappel
/
Wintertarwe
Locatie
Bottelare
Unief
Poperinge
Bottelare
Unief
Unief
Bottelare
Bottelare
Bottelare
Bottelare
Bottelare
Bottelare
Bottelare
Tongeren
Flaucourt
Flaucourt
Geer
Dongelberg
Ablaincourt
Gembloux
Dongelberg
Ref
Merchtem
Voorvrucht
/
/
Maïs
Eiwitgewassen
/
/
/
/
/
Maïs
Maïs
Maïs
Eiwitgewassen
Suikerbiet
/
/
/
/
/
/
/
/
Aardappel
Bodemtype
/
/
Zandleem
Zandleem
/
/
/
/
/
Zandleem
Zandleem
Zandleem
Zandleem
Leem
/
/
/
/
/
/
/
/
Leem
Resultaat sequenering
Rhizoctonia solani: AG 4 HGI
Rhizoctonia solani: AG1-1C
Rhizoctonia solani: AG 4 HGI
Rhizoctonia solani: AG 3
Rhizoctonia solani: AG 5
Rhizoctonia solani: AG 4 HG II
Rhizoctonia solani: AG 2-1
Rhizoctonia solani: AG 4 HGI
Rhizoctonia solani: AG 4 HGI
Rhizoctonia oryzae
Rhizoctonia solani: AG2-1
Rhizoctonia oryzae
Rhizoctonia solani: AG 3
Binucleate Rhizoctonia: AG F
Rhizoctonia solani: AG 3
Rhizoctonia solani: AG 3
Rhizoctonia solani: AG 3
Rhizoctonia solani: AG 3
Rhizoctonia solani: AG 3
Rhizoctonia solani: AG 3
Rhizoctonia solani: AG 3
Rhizoctonia cerealis
Rhizoctonia oryzae
46
1.4
Besluit diversiteit van Rhizoctonia in landbouwgewassen
In dit onderzoek werden 97 isolaten gesequeneerd, waarvan er 23 tot het genus Rhizoctonia
behoorden. Laten we nu de 8 referentiestalen buiten beschouwing, dan bleek slechts een
aandeel van 16,9 % Rhizoctonia te zijn. Hier zitten ook isolaten bij die afkomstig waren van
aardappelen, een groot deel van deze aangetaste aardappelen zijn geleverd door het bedrijf
Agripom te Tielt. Aangezien dit een vertekend beeld kan geven, wordt nu enkel rekening
gehouden met Rhizoctonia geïsoleerd van granen. Met een geheel van 80 isolaten en 6
Rhizoctonia isolaten komt men nog uit op een percentage van slechts 7,5 %. De 6
Rhizoctonia isolaten werden slechts van vier verschillende locaties bekomen, namelijk
Poperinge, Tongeren, Bottelare en Merchtem. Bovendien werd bij de staalnames gericht op
zoek gegaan naar symptomen. Dit wil zeggen dat de 7,5 % eigenlijk nog steeds een
vertekend beeld geeft ten voordele van Rhizoctonia. Het is bijgevolg duidelijk dat deze
schimmel niet veel aanwezig is in de onderzochte percelen.
Uit de resultaten van de sequeneringen kon men ook afleiden hoe de verdeling van de
andere schimmels in de onderzochte bodems eruitzag (de referentie-isolaten en isolaten
bekomen van aangetaste aardappelen buiten beschouwing gelaten). Het belang van deze
bodemschimmels is in figuur 19 weergegeven.
Aandeel van Rhizoctonia en andere
bodemschimmels
Rhizoctonia 7,5 % Microdochium
8,75 %
Mortierella 7,5 %
Fusarium 8,75 %
Trichoderma 15 %
Pythium 11,25 %
Amanita 6,25 %
Figuur 19: Het belang van Rhizoctonia en andere bodemschimmels
47
2. In vitro bepaling van de pathogeniteit van de Rhizoctonia isolaten
op tarwezaden
Om het algemeen resultaat van de agressiviteitstesten weer te geven worden in figuur 20
enkele aangetaste planten met bijhorende anastomosegroepen weergegeven. In de verdere
bespreking wordt dieper ingegaan op het effect van de Rhizoctonia isolaten op de kieming,
het aantal wortels, de wortellengte en –aantasting en de hypocotyllengte en – aantasting,
maar ook wat de correlatie is tussen de geteste factoren.
Figuur 20: Resultaat agressiviteitstest na 7 dagen. Isolaat 1 (AG 4 HG I) en isolaat 14 (AG F) geven een hoge
aantasting, isolaat 15 (AG 3) middelmatige aantasting en referentie isolaat van Rhizoctonia cerealis (AG D)
vertoont bijna geen symptomen.
48
2.1
Niet-parametrische correlaties
Vooreerst werd nagegaan wat de significante correlaties waren tussen de verschillende
onderzochte factoren. Hieruit blijkt dat de kieming positief gecorreleerd is met het aantal
wortels, de wortel- en hypocotyllengte, maar ook met de wortel- en hypocotylscore. Dit wil
zeggen dat indien de zaden goed kiemen de wortels en hypocotylen goed ontwikkelen, maar
er ook meer kans is op aantasting. Verder is een negatieve correlatie tussen de wortelscore
en wortellengte waargenomen. Dit wil zeggen dat indien de wortel minder aangetast is, deze
verder is uitgegroeid. Deze correlatie was niet terug te vinden tussen de hypocotyllengte en
–score. Tot slot ziet men ook een positieve correlatie tussen de hypocotyl- en wortellengte
en de hypocotyl- en wortelscore, wat wijst op een gelijkaardige graad van aantasting van
wortels en hypocotylen.
2.2
Kieming
In figuur 21 wordt grafisch het kiemingspercentage van de verschillende isolaten
weergegeven met daarboven de significante verschillen tussen de isolaten. Uit deze figuur
valt af te leiden dat er geen noemenswaardige verschillen zijn in kieming. Enkel isolaat 14
(binucleate Rhizoctonia AG F) verschilt met een kiemingspercentage van 70,8 % significant
van de 7 best kiemende isolaten (100 % kieming), waaronder ook de controle. Het
kiemingspercentage is dus niet de beste parameter om agressiviteit aan te tonen.
a
ab
b
Figuur 21: Kiemingspercentage en significante verschillen tussen de isolaten. Enkel isolaat 14 (AG F)
vertoont een significant slechtere kieming dan de beste groep met controle.
49
2.3
Wortelaantal
Op figuur 22.A is voor de verschillende isolaten het wortelaantal weergegeven en de
significante verschillen tussen deze isolaten. Vooreerst ziet men dat isolaten die behoren tot
dezelfde groep (aangeduid met kleurencode) soms significant verschillend zijn. De isolaten
van AG 3 (isolaat 4, 13 en 15-21) behoren bijvoorbeeld tot enkele groepen die significant van
elkaar verschillen, ook isolaat 3 (AG HG I) verschilt steeds significant van de andere isolaten
die tot dezelfde anastomosegroep behoren. Ook is te zien dat de controle niet behoort tot de
groep met het hoogste aantal wortels. Isolaat 1 en 9, beide AG 4 HG I, hebben het minste
aantal wortels en isolaat 6 (AG 4 HG II) het grootste aantal. Ook isolaten 7 en 11, beide AG
2 – 1, hebben een groot aantal wortels. Het binucleate Rhizoctonia isolaat 14, AG F, heeft
een negatieve invloed op het wortelaantal, isolaat 22 (Rhizoctonia cerealis) vertoont deze
negatieve invloed niet.
2.4
Wortellengte
In figuur 22.B is de wortellengte weergegeven. Hier ziet men opnieuw dat isolaten die
behoren tot dezelfde anastomosegroep soms significant van elkaar verschillen en dat de
controle wel goed scoort, maar niet tot de beste groep behoort. Isolaat 1 en 9 blijken op de
wortellengte een groot effect te hebben, ze zijn namelijk ook hier de 2 isolaten met de
grootste negatieve invloed op de wortellengte. Ook het binucleate isolaat 14 vertoont een
kleine wortellengte, terwijl isolaat 22 (Rhizoctonia cerealis) opnieuw geen effect heeft. Tot
slot scoren isolaten 6 en 11 opnieuw heel goed qua wortellengte.
2.5
Wortelscore
Van ieder isolaat wordt de score van aantasting in percentage uitgezet in figuur 22.C. Hier
zien we dezelfde trend terug, isolaat 22 en 6 vertonen zeer weinig aantasting en ook isolaat
11 en 7 tasten de wortels niet erg veel aan. Hier ziet men ook duidelijk dat isolaat 10 en 12,
die beiden Rhizoctonia oryzae zijn en maïs als waardplant hebben, de wortels van tarwe
zeer weinig aantasten. Langs de kant van hoge aantasting zien we opnieuw isolaat 14, maar
ook alle isolaten van anastomosegroep 3, die eigenlijk aardappel als waardplant hebben.
50
Aantasting van de wortels (% score 0-4)
C
j
ij
ghij
hij
fghij
defghij
efghij
cdefghi
cdefgh
cdefg
cdef
bcde
bcd
a
ab
abc
B
f
ef
def
cdef
bcdef
bcde
a
ab
abc
abcd
A
D
Isolaat 15
Isolaat 5
Isolaat 19
Isolaat 14
Isolaat 18
Isolaat 17
Isolaat 9
Isolaat 4
Isolaat 16
Isolaat 8
Isolaat 21
Isolaat 20
Isolaat 13
Isolaat 11
Isolaat 1
Isolaat 7
Isolaat 12
Isolaat 10
Isolaat 2
Isolaat 6
Isolaat 22
Isolaat 3
Controle
AG 5
Score 0
Score 1
Score 2
Score 3
Score 4
51
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Figuur 22: A. Wortelaantal B. Wortellengte C. Wortelscore D. Hoge en lage aantasting wortel. Isolaat 1 en 9 (AG HG I) hebben het minste aantal wortels en de laagste
wortellengte, ook isolaat 14 is voor beide parameters erg agressief. Op vlak van aantasting zijn isolaat 15 en 19 (AG3), 5(AG5) en 14 (AG F) het meest pathogeen.
2.6
Hypocotyllengte
Bij de hypocotyllengte worden vergelijkbare resultaten bekomen als bij wortellengte. De
kortste hypocotyl ziet men bij isolaat 1 en 9 en ook isolaat 14 heeft een negatieve invloed.
Verder hebben de meeste isolaten behorende tot anastomosegroep 3 korte hypocotylen.
Isolaat 3, 11, 6 en 22 hebben geen negatieve invloed op de hypocotyllengte, ze scoren zelfs
significant beter dan de controle. Deze resultaten zijn in figuur 23.A weergegeven.
2.7
Hypocotylscore
De hypocotylscore is weergegeven in figuur 23.B. Isolaten 5, 11, 8 en 9 wijken significant af
van de controle en ook isolaat 1 vertoont wat meer aantasting. Tijdens de proef waren echter
de platen van isolaat 5 niet tijdig rechtop geplaatst, waardoor de wortels naar boven groeiden
en de hypocotyl naar beneden. Hierdoor hadden de hypocotylen niet genoeg ruimte om op
een normale manier te ontwikkelen, waardoor de hypocotyllengte en vooral de
hypocotylscore negatief werden beïnvloed. Het is wel merkwaardig dat isolaat 11 een
negatieve invloed heeft, terwijl dit isolaat bij alle overige parameters positief naar voor kwam.
2.8
Besluit pathogeniteit Rhizoctonia isolaten op tarwezaden
Vooreerst kan men uit bovenstaande proeven afleiden dat isolaten die behoren tot dezelfde
anastomosegroep soms significant van elkaar verschillen (bijvoorbeeld het verschil in
aantasting tussen de verzamelde isolaten van AG 3) en dat de controle wel goed scoort,
maar niet steeds tot de beste groep behoort.
Verder blijken isolaten 1 en 9, beide AG 4 HG I, een sterk negatieve invloed te hebben op de
kieming en ontwikkeling van tarwe aangezien zij voor de verschillende parameters steeds
slecht scoren. Ook het binucleate Rhizoctonia isolaat 14, AG F, heeft een sterk negatieve
invloed. Isolaat 6 (AG 4 HG II) en isolaten 7 en 11 (beide AG 2 – 1) daarentegen blijken niet
agressief te zijn.
Voor het isolaat 22 werd een sterke aantasting verwacht aangezien dit een Rhizoctonia
cerealis isolaat is dat granen als waardplant heeft. Maar deze aantasting werd vreemd
genoeg niet waargenomen, dit isolaat behoorde zelfs meermaals tot de beste groep. Een
verklaring hiervoor kan zijn dat Rhizoctonia cerealis geen wortelpathogeen is, maar de
stengelbasis aantast. Ook is dit isolaat afkomstig uit de collectie van het MUCL, waardoor de
agressiviteit weggevallen zou kunnen zijn.
52
h
gh
fgh
fg
efg
defg
cdefg
bcdef
abcde
a
ab
abc
abcd
A
Aantasting hypocotyl (% score 0-4)
B
Isolaat 5
Isolaat 11
Isolaat 9
Isolaat 8
Isolaat 1
Isolaat 22
Isolaat 21
Isolaat 20
Isolaat 19
Isolaat 18
Isolaat 17
Isolaat 16
Isolaat 15
Isolaat 14
Isolaat 13
Isolaat 12
Isolaat 10
Isolaat 7
Isolaat 6
Isolaat 4
Isolaat 3
Isolaat 2
Controle
d
cd
c
b
ab
Sc
Sc
Sc
Sc
Sc
a
0%
20%
40%
60%
80%
100%
C
53
Figuur 23: A. Hypocotyllengte B. Hypocotylscore C. Hoge en lage aantasting hypocotyl. Isolaat 1, 9 (AG 4 HG I) en 5 (AG5) vertonen ook bij hypocotyl hoge aantasting.
3. In vitro bepaling van de pathogeniteit van de Rhizoctonia oryzae
isolaten op maïszaden
Na de statistische verwerking van de metingen uitgevoerd met maïszaden blijkt dat de
resultaten van de geïnoculeerde platen niet significant verschillen van de controle. Een
verklaring hiervoor kan zijn dat de ziektesymptomen in maïs nog niet zichtbaar zijn na een
week of dat de zaden niet genoeg gespoeld waren en de achtergebleven zaadontsmetting
toch een schimmel onderdrukkend effect had.
4. In vitro bepaling van de gevoeligheid aan de werkzame stof
sedaxane
Per anastomosegroep werd er een representatief isolaat uitgekozen om de verdere testen
met de werkzame stof sedaxane in verschillende dosissen uit te voeren. Jammer genoeg
kon de referentie isolaat Rhizoctonia cerealis niet meegenomen worden in de proeven,
aangezien deze na overzetting op verschillende mediums geen groei meer vertoonde.
In tabel 7 worden de geselecteerde isolaten weergegeven. Per anastomosegroep wordt het
effect bekeken van de vier dosissen (0, 1, 2 en 4 liter per ton) op de kieming, het aantal
wortels, de wortellengte en –aantasting en de hypocotyllengte en – aantasting. Vervolgens
worden net zoals bij de agressiviteitstesten ook de significante verschillen tussen de isolaten
en de correlatie tussen bovenstaande parameters weergegeven.
Tabel 7: Selectie isolaten voor het testen van de gevoeligheid aan het product sedaxane
Isolaat
1
2
5
6
7
10
14
19
Gewas
/
Sla
Sla
Sla
/
Wintertarwe
Maïs
Aardappel
Locatie
Bottelare
Unief
Unief
Unief
Bottelare
Bottelare
Tongeren
Ablaincourt
Voorvrucht
/
/
/
/
/
Maïs
Suikerbiet
/
Bodemtype
/
/
/
/
/
Zandleem
Leem
/
Resultaat sequenering
Rhizoctonia solani: AG 4 HGI
Rhizoctonia solani: AG1-1C
Rhizoctonia solani: AG 5
Rhizoctonia solani: AG 4 HG II
Rhizoctonia solani: AG 2-1
Rhizoctonia oryzae
Binucleate Rhizoctonia: AG F
Rhizoctonia solani: AG 3
54
4.1
Effect van de dosis sedaxane binnen dezelfde soort
De grafische voorstelling en het resultaat van de statistische verwerking van de
geselecteerde isolaten wordt weergegeven in figuren 24 tot 31. In wat hierna volgt wordt per
anastomosegroep een korte bespreking gegeven van deze resultaten.
Uit de agressiviteitstesten (dosis 0) bleek duidelijk dat isolaat 1, meer bepaald AG 4 HG I
met als waardplanten o.a. tomaat, erwt en aardappel, ook tarwe aantastte. Op figuur 24 is te
zien dat indien men een hogere dosis toedient de parameters kieming, aantal wortels,
wortellengte en –aantasting en hypocotyllengte en – aantasting positief beïnvloed worden.
De kieming is niet significant verschillend bij een hogere dosis, het wortelaantal van het
onbehandeld zaad en de behandelde zaden verschilt wel significant. Voor wortel- en
hypocotyllengte geven dosis 2 en dosis 4, die niet significant van elkaar verschillen, de beste
resultaten. Hetzelfde geldt voor wortel- en hypocotylscore. Algemeen kan dus gesteld
worden dat de werkzame stof sedaxane voor dit isolaat een inhiberend effect op de
schimmel heeft.
Hetzelfde kan niet gezegd worden voor AG 4 HG II, die dezelfde waardplantenreeks heeft
als AG 4 HG I. Voor isolaat 6 zijn er namelijk geen significante verschillen waar te nemen
tussen het onbehandelde en het behandelde zaad (figuur 25). Dit was ook te verwachten
aangezien uit de pathogeniteitstesten bleek dat AG 4 HG II niet pathogeen was op tarwe.
Net zoals isolaat 6 bleek isolaat 2, AG 1 – 1C, met als waardplanten o.a. boekweit, wortel,
sojaboon en vlas, geen negatieve invloed te hebben op de kieming en ontwikkeling van
tarwezaden. Over het algemeen ziet men hier dan ook niet echt een positief effect van de
zaadbehandeling (figuur 26). Enkel op vlak van aantasting van de wortels en hypocotyl
scoren dosis 2 en 4 significant beter dan 0 en 1. Hierbij dient ook opgemerkt te worden dat
de dosis 1 liter per ton significant slechtere groei vertoont van wortel en hypocotyl dan de
overige dosissen, waaronder het onbehandelde zaad.
Isolaat 5 had bij de agressiviteitstesten steeds een hoge score voor wortel- en
hypocotylaantasting. AG 5 had dus ook een negatieve invloed op tarwe, die eigenlijk niet tot
de waardplantenreeks behoort. Na behandeling met sedaxane zijn vooral voor deze twee
parameters, namelijk wortel- en hypocotylscore, significante verbeteringen te zien en dit bij
dosissen 2 en 4 liter per ton (figuur 27).
Hetzelfde kan gezegd worden van isolaat 7 (AG 2 – 1) die kruisbloemigen, aardbei en tulp
als waardplanten heeft. Hier is echter ook voor de dosis van 1 liter per ton reeds een
significant positief effect waarneembaar (figuur 28).
55
Rhizoctonia oryzae heeft als waardplant voornamelijk maïs. Uit de pathogeniteitstesten
bleek dan ook duidelijk dat deze groep geen invloed heeft op tarwe. Het ontsmetten van
tarwezaden tegen dit isolaat heeft wel een positieve invloed op de wortels. Het aantal wortels
en de wortellengte nemen toe en de aantasting van de wortels neemt af in vergelijking met
het onbehandelde zaad. Deze positieve waarnemingen zijn echter gering (figuur 29).
Het binucleate isolaat 14 (AG F) kwam bij de pathogeniteitstesten ook naar voor als een vrij
agressief isolaat. In figuur 30 ziet men dan ook voor alle factoren, behalve voor
hypocotylaantasting, een positieve invloed van de zaadbehandeling. Voor de parameters
kieming, wortelaantal, -lengte en hypocotyllengte verschilt het effect van de verschillende
dosissen niet significant. Voor de parameter wortelaantasting komen de dosissen 2 en 4 liter
per ton als beste naar voren.
Tot slot werd als representatief isolaat voor anastomosegroep 3 isolaat 19 getest (figuur 31).
Anastomosegroep 3 heeft voornamelijk aardappel als waardplant, maar tastte bij de
pathogeniteitstesten ook de wortels van tarwe aan. Net zoals bij isolaat 14 zien we voor deze
parameter het beste resultaat wanneer het zaad behandeld is met 2 of 4 liter per ton.
56
AG 4 HG I
a
a
a
a
b
bc
a
a
b
b
b
c
a
a
a
a
b
c
b
b
57
Figuur 24: Grafische voorstelling van de onderzochte parameters kieming, aantal wortels, wortellengte en –aantasting en hypocotyllengte en – aantasting voor AG 4 HG I. Positief effect
sedaxane (dosis 2 en 4 liter per ton) op wortelaantal, -lengte & -score, hypocotyllengte & -score.
AG 4 HG II
58
Figuur 25: Grafische voorstelling van de onderzochte parameters kieming, aantal wortels, wortellengte en –aantasting en hypocotyllengte en – aantasting voor AG 4 HG II. Er zijn geen
significante verschillen waar te nemen tussen het onbehandeld en het behandelde zaad. Dit was ook te verwachten aangezien uit de pathogeniteitstesten bleek dat AG 4 HG II niet
pathogeen was op tarwe.
AG 1 – 1C
a
a
a
a
b
a
ab
b
a
a
a
b
a
a
b
b
a
a
a
a
b
b
b
b
59
Figuur 26: Grafische voorstelling van de onderzochte parameters kieming, aantal wortels, wortellengte en –aantasting en hypocotyllengte en – aantasting voor AG 1 – 1C. Enkel op vlak
van aantasting van de wortels en hypocotyl scoren dosis 2 en 4 liter per ton significant beter dan dosis 0 en 1.
AG 5
a
a
a
a
a
ab
ab
b
a
b
ab
a
b
a
a
b
Aantasting hypocotyl (% score 0-4)
a
a
b
Dosis (L/Ton)
a
4
a
2
a
1
b
0
c
0%
20%
40%
60%
80%
100%
60
Figuur 27: Grafische voorstelling van de onderzochte parameters kieming, aantal wortels, wortellengte en –aantasting en hypocotyllengte en – aantasting voor AG 5. Vooral voor de twee
parameters wortel- en hypocotylscore zijn er significante verbeteringen te zien bij dosissen 2 en 4 liter per ton.
AG 2 – 1
a
a
a
a
a
ab
b
b
a
a
a
a
a
b
b
b
a
a
a
a
a
ab
b
b
61
Figuur 28: Grafische voorstelling van de onderzochte parameters kieming, aantal wortels, wortellengte en –aantasting en hypocotyllengte en – aantasting voor AG 2 – 1. Na behandeling
met de actieve stof sedaxane zijn vooral voor wortel- en hypocotylscore significante verbeteringen te zien en dit reeds bij een dosis van 1 liter per ton.
Rhizoctonia oryzae
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
b
b
b
b
a
a
a
a
a
a
a
b
a
62
Figuur 29: Grafische voorstelling van de onderzochte parameters kieming, aantal wortels, wortellengte en –aantasting en hypocotyllengte en – aantasting voor Rhizoctonia oryzae.
Rhizoctonia oryzae heeft als waardplant voornamelijk maïs. Het ontsmetten van tarwezaden tegen dit isolaat heeft echter wel een positieve invloed op het aantal wortels, de
wortellengte en aantasting van de wortels. Deze positieve waarnemingen zijn echter gering.
AG F
a
ab
b
b
a
b
b
b
a
ab
b
b
a
b
b
b
a
a
a
a
b
a
c
a
63
Figuur 30: Grafische voorstelling van de onderzochte parameters kieming, aantal wortels, wortellengte en –aantasting en hypocotyllengte en – aantasting voor AG F. Voor alle factoren,
behalve voor hypocotylaantasting, is er een positieve invloed van de zaadbehandeling. Voor de parameter wortelaantasting komen de dosissen 2 en 4 liter per ton als beste naar voor,
voor de overige parameters is er geen significant verschil tussen de dosissen.
AG 3
a
a
a
a
b
b
a
a
a
a
a
a
b
b
b
b
a
a
a
a
b
a
c
a
64
Figuur 31: Grafische voorstelling van de onderzochte parameters kieming, aantal wortels, wortellengte en –aantasting en hypocotyllengte en – aantasting voor AG 3. Significant hogere
wortel- en hypocotyllengte bij de behandelde zaden en wortelaantasting is het laagst vanaf een dosis van 2 liter per ton.
4.2
Significante verschillen tussen verschillende groepen
Hierboven werd binnen de anastomosegroepen nagegaan wat het effect was van het
product Vibrance Gold met sedaxane als belangrijkste actieve stof. Om na te gaan of er
tussen de isolaten na behandeling nog steeds grote significante verschillen zijn, gaat men op
dezelfde wijze te werk als bij de agressiviteitstesten. Men kijkt opnieuw naar de kieming, het
aantal wortels, de wortellengte en –aantasting en de hypocotyllengte en – aantasting. Ook
de correlatie tussen de geteste factoren wordt nagegaan.
4.2.1 Niet-parametrische correlaties
Uit de niet-parametrische correlaties blijkt dat de kieming positief gecorreleerd is met het
aantal wortels, de wortellengte, – score en hypocotyllengte, maar niet meer met de
hypocotylscore, wat bij de agressiviteitstesten wel het geval was. Dit wil dus opnieuw zeggen
dat indien de zaden goed kiemen ook de wortels en hypocotylen goed ontwikkelen, maar er
ook meer kans is op aantasting in het geval van de wortels. Verder wordt ook hier weer een
negatieve correlatie tussen de wortelscore en wortellengte waargenomen. Tot slot ziet men
ook een positieve correlatie tussen de hypocotyl- en wortellengte en de hypocotyl- en
wortelscore, wat wijst op een gelijkaardige graad van aantasting van wortels en hypocotylen.
De resultaten van deze niet-parametrische correlaties wijken dus niet veel af van de
resultaten bekomen bij de onbehandelde zaden.
4.2.2 Kieming
In figuur 32 wordt grafisch het kiemingspercentage van de verschillende isolaten
weergegeven. Er zijn geen significante verschillen tussen de isolaten.
Figuur 32: Kiemingspercentage: er zijn geen significante verschillen tussen de isolaten in
verschillende dosissen.
65
4.2.3 Wortelaantal, wortellengte en hypocotyllengte
Op figuur 33.A is voor de verschillende isolaten en verschillende dosissen het wortelaantal
weergegeven en de significante verschillen tussen deze isolaten. Vooreerst ziet men dat de
meeste isolaten tot dezelfde groep behoren. Isolaat 1 dosis 1 l/ton en isolaat 5 2 l/ton doen
het iets slechter dan de overige isolaten, terwijl isolaat 1 dosis 4 l/ton en isolaat 14 dosis
4l/ton beter scoren.
In figuren 33.B en 34.A zijn wortel- en hypocotyllengte weergegeven. Hier ziet men opnieuw
dat isolaat 1 dosis 1 l/ton toch nog wat agressiever is dan de rest.
4.2.4 Wortel- en hypocotylscore
Van ieder isolaat wordt de score van aantasting in percentage uitgezet in figuur 33.C en 34.B
voor respectievelijk wortel en hypocotyl. Ook hier ziet men dat isolaat 1 dosis 1 l/ton de
wortels en hypocotyl het meeste aantast. Wordt de dosis verhoogd naar 2 of 4 liter per ton
zaad, dan wordt de hypocotyl niet meer aangetast, de wortels worden echter wel nog steeds
aangetast maar wel in mindere mate. Ook voor isolaat 2, 14 en 19 is de dosis van 1 l/ton niet
voldoende om aantasting van de wortels tegen te gaan.
4.3
Besluit gevoeligheid aan werkzame stof sedaxane
Men kan in het algemeen besluiten dat de zaadontsmetting met sedaxane een positief effect
heeft op de verschillende parameters, namelijk kieming, het aantal wortels, de wortellengte
en –aantasting en de hypocotyllengte en – aantasting. Dit positief effect is het meest
uitgesproken bij de isolaten die agressief zijn op tarwe. Bij minder agressieve isolaten is er
meestal wel nog een verbetering waar te nemen, maar deze is gering. Vooral op de
parameter wortelaantasting heeft het product een positief effect, wat zeer belangrijk is voor
een goede opkomst en ontwikkeling.
Het zaad werd behandeld met drie verschillende dosissen, namelijk 1, 2 en 4 liter per ton
met 2 liter per ton zaad als gangbare dosis. Dit bleek ook vrij duidelijk uit de proeven. Bij een
dosis van 1 liter per ton waren er vaak nog ziektesymptomen waar te nemen terwijl deze bij 2
en 4 liter per ton niet meer terug te vinden waren. Meestal waren er ook geen significante
verschillen tussen 2 en 4 liter per ton, wat wil zeggen dat de gangbare dosis van 2 liter per
ton inderdaad moet volstaan om de schimmel te onderdrukken.
Na zaadontsmetting zijn de verschillen tussen de isolaten voor de verschillende parameters
veel minder uitgesproken dan bij de agressiviteitstesten. Wat wel opvalt is dat isolaat 1, dat
behoort tot anastomosegroep 4 HG I, ook na behandeling met sedaxane nog steeds veel
meer ziektesymptomen veroorzaakt in vergelijking met de overige isolaten.
66
C
c
b
ab
f
cdef
def
ef
bcdef
abcdef
abc
abcd
abcde
ab
a
B
c
bc
abc
a
ab
A
D
AG F
Dosis 1 l/ton
a
67
Figuur 33: A. Wortelaantal B. Wortellengte C. Wortelscore D. Hoge en lage aantasting wortel. Isolaat 1, dosis 1 liter per ton (AG HG I) heeft het minste aantal wortels en de
laagste wortellengte. Op vlak van aantasting zijn isolaat 1, isolaat 14 (AG F) en 19 (AG3) het meest pathogeen bij een dosis van 1 liter per ton.
d
cd
bcd
abcd
abc
ab
a
A
B
c
b
a
C
R. oryzae
Dosis 4 l/ton
68
Figuur 34: A. Hypocotyllengte B. Hypocotylscore C. Hoge en lage aantasting hypocotyl. Isolaat 1 vertoont ook bij hypocotyl hoge aantasting.
Discussie
Naar het voorkomen van Rhizoctonia in tarwe werd in Vlaanderen nog geen onderzoek
verricht. In de literatuur zijn wel enkele resultaten omtrent het voorkomen van de
verschillende Rhizoctonia soorten in tarwe terug te vinden voor andere landen. Zo bleek uit
onderzoek van Goll et al. (2014) dat bij staalnamen van verschillende Europese bodems
Rhizoctonia solani AG 5 het meeste werd terug gevonden. In Australië en het noordwesten
van de USA is R. solani AG 8 de meest gerapporteerde groep (Smiley & Uddin, 1993). Voor
Texas is dit R. solani AG 4 en voor Zuid-Afrika R. solani AG2-2 en AG 4 (Rush et al., 1994;
Tewoldemedhin et al., 2006).
In het doctoraat van Pannecoucque (2009) werden verschillende Rhizoctonia isolaten
verzameld afkomstig van bloemkool verspreid over Vlaanderen, hierbij was AG 2-1 de meest
voorkomende soort.
De geïsoleerde isolaten van wintertarwe bleken in dit onderzoek AG 4 HGI, Rhizoctonia
oryzae en AG2-1 te zijn. Hier kan echter geen uitspraak gedaan worden over de meest
voorkomende groep in Vlaamse bodems wegens het beperkt aantal gevonden Rhizoctonia
soorten.
Wat betreft de agressiviteit van de verschillende soorten tegenover tarwe, bleek in deze
thesis R. solani AG 4 HG I een sterk negatieve invloed te hebben op de kieming en
ontwikkeling van tarwe. Ook het binucleate R. solani AG F heeft een sterk negatieve invloed.
In onderzoek van Tomaso-Peterson & Trevathan (2007) werd voor 23 Rhizoctonia isolaten,
verzameld van landbouwkundige gewassen en turf gras, o.a. de agressiviteit van de isolaten
op kiemend tarwezaad getest. Hieruit bleek dat zaden geïnoculeerd met het binucleate
Rhizoctonia spp. met 100 % (alle zaden vertonen symptomen na 4 tot 6 weken) de hoogste
infectiegraad hadden, gevolgd door AG 4 (95 en 99 %), wat dus overeenkomstig is met de
gevonden resultaten in dit onderzoek. Hier werd echter voor R. cerealis wel een aantasting
waargenomen van 92 %, waar deze aantasting in deze thesis niet te zien was.
Tot slot werd via kiemingstesten de gevoeligheid aan de werkzame stof sedaxane getest.
Deze gevoeligheid werd ook in het onderzoek van Goll et al. (2014) nagegaan, maar dan
door een fungicide/PDA verdunning te inoculeren met verschillende Rhizoctonia soorten.
Hieruit bleek dat alle isolaten gevoelig waren voor sedaxane met een gemiddelde EC50 van
0,028 p.p.m.. In deze thesis ziet men ook dat de zaden die geïnoculeerd waren met
agressieve isolaten na behandeling met sedaxane significant minder aangetast waren en
beter groeiden dan de onbehandelde zaden. Bij isolaten die niet agressief waren, werd de
schimmel misschien wel geremd in groei, maar dit had geen significant effect op de kieming
van tarwezaden.
69
Algemeen besluit
Dit onderzoek omtrent Rhizoctonia bestond uit drie luiken. Het eerste deel bestond uit het in
kaart brengen van de diversiteit van Rhizoctonia in landbouwgewassen verspreid over
Vlaanderen. De verschillende soorten Rhizoctonia die op het veld werden gevonden zijn
R. solani AG 4 HGI, AG 3, AG 2 – 1, AG F en R. oryzae. Uit de sequeneringen van al de
verzamelde isolaten blijkt dat men met een geheel van 80 verzamelde isolaten, waaronder 6
Rhizoctonia isolaten, slechts uitkomt op een percentage van 7,5 % Rhizoctonia. Uit de
resultaten kwam ook het aandeel van andere bodemschimmels naar voor. Zo werd
Trichoderma (15 %) het meest terug gevonden, gevolgd door Pythium (11,25 %) en
Microdochium en Fusarium (8,75 %). Ook Mortierella (7,5 %) en Amanita (6,25 %) kwamen
vaak voor.
In het tweede deel werd de pathogeniteit van de verzamelde Rhizoctonia isolaten en enkele
referentie isolaten op niet behandelde tarwezaden getest. Meer bepaald het effect van de
Rhizoctonia isolaten op de kieming, het aantal wortels, de wortellengte, de wortelaantasting
en de hypocotyllengte en – aantasting, maar ook wat de correlatie is tussen deze geteste
factoren.
Vooreerst kan men uit bovenstaande proeven afleiden dat isolaten die behoren tot dezelfde
anastomosegroep soms significant van elkaar verschillen en dat de controle wel goed scoort,
maar niet steeds tot de beste groep behoort.
Verder blijken isolaten 1 en 9, beide AG 4 HG I, een sterk negatieve invloed te hebben op de
kieming en ontwikkeling van tarwe en ook het binucleate Rhizoctonia isolaat 14, AG F, heeft
een sterk negatieve invloed. Isolaat 6 (AG 4 HG II) en isolaten 7 en 11 (beide AG 2 – 1)
blijken daarentegen niet agressief te zijn.
Voor het isolaat 22 werd een sterke aantasting verwacht aangezien dit een Rhizoctonia
cerealis isolaat is dat granen als waardplant heeft. Maar deze aantasting werd vreemd
genoeg niet waargenomen, dit isolaat behoorde zelfs meermaals tot de beste groep. Een
verklaring hiervoor kan zijn dat Rhizoctonia cerealis geen wortelpathogeen is, maar de
stengelbasis aantast. Ook is dit isolaat afkomstig uit de collectie van het MUCL, waardoor de
agressiviteit kan weggevallen zijn.
Tot slot werd voor een selectie van de isolaten de gevoeligheid aan de actieve stof sedaxane
nagegaan in drie dosissen, namelijk 1, 2 en 4 liter sedaxane per ton tarwezaad. Men kan in
het algemeen besluiten dat de zaadontsmetting met deze actieve stof een positief effect
heeft op de verschillende parameters, namelijk kieming, het aantal wortels, de wortellengte
en –aantasting en de hypocotyllengte en – aantasting. Dit positief effect is het meest
uitgesproken bij de isolaten die agressief zijn op tarwe. Bij minder agressieve isolaten is er
meestal wel nog een verbetering waar te nemen, maar deze is gering. Vooral op de
parameter wortelaantasting heeft het product een positief effect, wat zeer belangrijk is voor
een goede opkomst en ontwikkeling.
70
Wat de dosis van de actieve stof sedaxane betreft, blijkt dat bij een dosis van 1 liter per ton
nog vaak ziektesymptomen waar te nemen zijn. Bij 2 en 4 liter per ton zijn deze symptomen
niet meer terug te vinden en meestal waren er ook geen significante verschillen tussen 2 en
4 liter per ton. Uit deze thesis blijkt dus dat de gangbare dosis van 2 liter per ton inderdaad
moet volstaan om de schimmel te onderdrukken.
Na zaadontsmetting zijn de verschillen tussen de isolaten voor de verschillende parameters
veel minder uitgesproken dan bij de agressiviteitstesten. Wat wel opvalt is dat isolaat 1, dat
behoort tot anastomosegroep 4 HG I, ook na behandeling met sedaxane nog steeds veel
meer ziektesymptomen veroorzaakt in vergelijking met de overige isolaten.
71
Referentielijst
Abbasi, P.A., Conn, K.L. & Lazarovits, G. (2006). Effect of fish emulsion used as a pre-plant
soil amendment on Verticillium wilt, common scab, and tuber yield of potato. Canadian
Journal of Plant Pathology, 28, pp. 509-518.
Agrios, G.N. (2005). Plant Pathology, Ed fifth edition. Elsevier Academic Press, London, UK.
Andersen, T.F. & Stalpers, J.A. (1994). A check-list of Rhizoctonia epithets. Mycotaxon 51,
pp. 437-457.
Anderson, H.A., Bracewell, J.M., Fraser, A.R., Jones, D., Robertson, G.W. & Russell, J.D.
(1988). 5-Hydroxymaltol and mycophenolic acid, secondary metabolites from Penicillium
echinulatum. Trans. Brit. Mycol. Soc., 91, pp. 649-651.
Anees, M., Tronsmo, A., Edel-Hermann, V., Gautheron, N., Faloya, V. & Steinberg, C.
(2010). Biotic changes in relation to local decrease in soil conductiveness to disease caused
by Rhizctonia solani. European Journal of Phytopathogy, 126, pp. 29 - 41.
Bharathan, N. (1989). Cytoplasmic Hypovirulence in Rhizoctonia solani. Orono, ME, USA:
University of Maine, PhD thesis.
Bharathan, N., Saso, L., Gudipati, S., Bharathan, K., Whited, K. & Anthony, K. (2005).
Double-stranded RNA: distribution and analysis amons isolates of Rhizoctonia solani AG-2 to
-13. Plant Pathology,54, pp. 196-203.
Blaszkowski, J. (2003). Life cycle, significance, and structures of arbuscular mycorrhizae
initiated.
Geraadpleegd
op
5
maart
2014
via
http://www.zor.zut.edu.pl/Glomeromycota/Life%20cycle,%20significance%20and%20properti
es%20of%20AM.html
Bockus, W.W., Shroyer J.P. (1998). The impact of reduced tillage on soilborne plant
pathogens. Annual Review of Phytopathology, 36, pp. 485-500.
Buddemeyer, J. & Märländer, B. (2004). Integrierte Kontrolle der Späten Rübenfäule
(Rhizoctonia solani Kühn) in Auckerrüben – Einfluss von Anbaumaβnahmen und
Fruchtfolgegestaltung sowie Sortenwahl unter besonderer Berücksichtigung des Maises.
Zuckerindustrie , 129, pp. 676-686.
Buizer, B., Sukkel, W., Vlaswinkel, M. Evenhuis, B., Van der Wel, C., van Leeuwen, W., van
Asperen, P., van Balen, D. & Bernaerts, S. (2006). Handleiding beheersing schade door
schimmels, insecten en slakken in de biologische akkerbouw en vollegrondsgroententeelt.
Geraadpleegd op 1 maart via http://edepot.wur.nl/120226.
Burpee, L.L., Sanders, P.L., Cole, H. & Sherwood R.T. (1980). Anastomosis groups amons-g
isolates of Ceratobasidium cornigerum and related fungi. Mycologia, 72, pp. 689-701.
72
Butler, M.J. & Day, A.W. (1998). Destruction of fungal melanins by ligninases of
Phanerochaete chrysosporium and other white rot fungi. International Journal of Plant
Sciences, 159, pp. 989-995.
Butler, M.J., Gardiner, R.B. & Day, A.W. (2005) Degradation of melanin or inhibition of its
synthesis: are these a significant approach as a biological control of phytopathogenic fungi?
Biological Control, 32, pp. 326 – 336.
Büttner,G., Führer Ithurrart, M.E., Buddemeyer, J. (2002). Späte Rübenfäule Rhizoctonia
solani – Verbreitung, wirtschaftliche Bedeutung und integrierte Bekämpfungskonzepte.
Zuckerindustrie, 52, pp. 707–717.
Carling, D.E. (1996). Grouping in Rhizoctonia solani by hyphal anastomosis reaction. In:
Sneh, B., Jabaij-Hare, S., Neate, S. & Dijst, G. Rhizoctonia species: taxonomy, molecular
biology, ecology, pathology and disease control. Kluwer Academic Publishers, pp. 37-47.
Carling, D.E., Kuninaga, S. & Brainard, K.A. (2001). Hyphal anastomosis reactions, rDNAinternal transcribed spacer sequences, and virulence levels among subsets of Rhizoctonia
solani Anastomosis Group-2 (AG-2) and AG-BI. Phytopathology, 92, pp.43-50.
Chang, Y.C. (1985). Effect of temperature, pH and water potential on mycelial growth and
sclerotial formations of Rhizoctonia solani AG-I. J. Agric, Res. China., 34 (4), pp. 454463.
Chet, I. & Baker, R. (1980). Induction of suppressiveness to Rhizoctonia solani in soil.
Phytopathology, 70, pp. 994-998.
Cole, G.T. & Hoch, H.C. (1991). The fungal spore and disease initiation in plants and
animals. Plenum Press, New York.
Cubeta, M.A. & Vilgalys, R. (1997). Population biology of the Rhizoctonia solani complex.
Phytopathology 87, pp. 480-484.
Davis, C & Schneebeli, K. (2014). Wild grass could supply genes to combat wheat root
disease.
Geraadpleegd
op
11
mei
2014
via
http://www.abc.net.au/radionational/programs/scienceshow/wild-grass-could-supply-genesto-combat-wheat-root-disease/5317688
Deketelaere, S. (2012). Screening van biologische fungiciden tegen Rhizoctonia solani in de
bloemkoolteelt [masterproef]. Universiteit Gent, Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen.
Disco,
A.
(2010).
Rhizoctonia.
Geraadpleegd
op
1
maart
2014
via
http://www.relabdenhaan.com/UserData/Documents/ADB7382830CC44C9A0755DCDD3760
B90.pdf
Dos Reis Almeida, FB., Cerqueira, FM., do Nascimento Silva, R., Ulhoa, CJ. & Lima, AL.
(2007). Mycoparasitism studies of Trihochoderma harzianum strains against Rhizoctonia
73
solani: evaluation of coiling and hydrolotic enzyme production. Biotechnology letters, 29,
pp.1189-1193.
Feliner, G.N. & Rossello, J.A. (2007). Better the devil you know? Guidelines for insightful
utilization of rDNA ITS in species-level evolutionary studies in plants. Molecular
Phylogenetics and Evolution, 44, pp. 911-919.
Ferreira, R.B., Monteiro, S., Freitas, R., Santos, C.N., Chen, Z., Batista, L.M., Duarte, J.,
Borges, A. & Teixeira A.R. (2007). The role of plant defence proteins in fungal pathogenesis.
Molecular Plant Pathology, 8, pp. 677-700.
Gerhardson B. (2002). Biological substitutes for pesticides. Review. TRENDS in
Biotechnology, 20, pp. 338-343.
Ghini, R., Hamada, E. & Bettiol, W. (2008). Climate change and plant diseases. Scientia
Agricola, 65, pp. 453-462.
Gill, J.S., Sivasithamparam, K. &Smettem, K.R.J. (2000). Soil moisture affects disease
severity and colonisation of wheat roots by Rhizoctonia solani AG-8. Soil Biology &
Biochemistry 33, pp. 1363-1370.
Goll, M.B., Schade-Schütze, A., Swart, G., Oostendorp, M., Schott, J.J., Jaser, B. &
Felsenstein, F.G. (2014). Survey on the prevalence of Rhizoctonia spp. in European soils
and determination of the baseline sensitivity towards sedaxane. Plant Pathology, 63, pp.
148-154.
González García, V., Portal Onco, M.A. & Rubio Susan, V. (2006). Review Biology and
systematics of the form genus Rhizoctonia. Spanish Journal of Agricultural Research, 4, nr.1,
pp. 55-79.
Goswami, B.K., Rahaman, M.M., Hoque, A.K.M.A., Bhuyan, K. & Mian, I.H. (2011).
Variations in different isolates of Rhizoctonia solani based on temperature and pH.
Bangladesh J. Agric. Res., 36, pp 389-396.
Gvozdeva, E.I., Volotskaya, A.V., Sof in, A.V., Kudryavtseva, N.N., Revina, T.A. & Valueva,
T.A. (2006). Interaction of proteinases secreted by fungal pathogen Rhizoctonia solani witch
natural proteinase inhibitors produced by plants. Appl. Biochem. Microbiol., 42, pp. 502-507.
Haas, D. & Defago, G. (2005). Biological control of soil-borne pathogens by fluorescent
pseudomonas. Nature Reviews Microbiology, 3, pp. 307-319.
Haesaert, G. (2012). Gewasbescherming [syllabus]. University of Ghent, Faculty of
Bioscience Engineering.
Haesaert, G. (2013). Fytofarmacie en toxicologie [syllabus]. University of Ghent, Faculty of
Bioscience Engineering.
74
Hardham, A.R., Jones, D.A. & Takemoto, D. (2007). Cytoskeleton and cell wall function in
penetration resistance. Plant Biology,10, pp. 342-348.
Harman, G.E., Petzoldt, R., Comis, A. & Chen, J. (2004). Interactions between Trichoderma
harzianum strain T22 and maize inbred line Mol 7 and effects of these interactions on
diseases caused by Pythium ultimum and Colletotrichum graminicola. Phytopathology, 94,
pp. 147-153.
Harman G.E. (2006). Overview of mechanisms and uses of Trichoderma spp..
Phytoplathology, 96, pp. 190-194.
Harris, K., Young, I.M., Gilligan, G.A., Otten, W. & Ritz, K. (2003). Effect of bulk density on
the spatial organisation of the fungus Rhizoctonia solani in soil. FEMS Microbiology Ecology,
44, pp. 45-46.
Herr, L.J. (1996). Sugar beet diseases incited by Rhizoctonia spp. Pages 341-350 in: Sneh,
B., Jabaij-Hare, S., Neate, S. & Dijst, G. Rhizoctonia species: taxonomy, molecular biology,
ecology, pathology and disease control. Kluwer Academic Publishers, pp. 37-47.
Heydari A. & Pessarakli M. (2010). A review on biological control of fungal plant pathogens
using microbial antagonists. Journal of Biological Sciences, 10, pp. 273-290.
Hodge, A., (2000). Microbial ecology of the arbuscular mycorrhiza. Fems microbiology
ecology, 32, pp.91-96.
Hoitink, H.A.J. & Boehm, M.J. (1999). Biocontrol within the context of soil microbial
communities: a substrate-dependent phenomenon. Annual Review of Phytopathology, 37, pp
427-446.
Holland, J.M. (2004). The environmental consequences of adopting conservation tillage in
Europe: reviewing the evidence. Agriculture, Ecosystems & Environment, 103, pp. 1-25.
Höper, H. & Alabouvette, C. (1996). Importance of physical and chemical soil properties in
the suppressiveness of soils to plant diseases. European Journal of Soil Biology, 32, pp. 4158.
Howell C.R. (2003). Mechanisms employed by Trichoderma species in the biological control
of plant diseases: the history and evolution of current concepts. Plant Disease, 87, pp. 4-10.
Kataria, H.R. & Grover, R.K. (1987). Influence of soil factors, fertilizers and manures on
pathogenecity of Rhizoctonia solani on Vigna species. Plant and Soil, 103, pp. 57-66.
Jung, W.J., Mabood, F., Kim, T.H. & Smith, D.L. (2007). Induction of pathogenesis-related
proteins during biocontrol of Rhizoctonia solani with Pseudomonas aureofaciens in soybean
(Glycine max L. Merr.) plants. Biocontrol, 52, pp 895-904.
75
Keijer, J. (1996). The initial steps of the infection process in Rhizoctonia solani. In: Sneh, B.,
Jabaji-Hare, S., Neate, S. en Dijst, G. Rhizoctonia species: taxonomy, molecular biology,
ecology, pathology and disease control. Kluwer Academic Publishers, pp.149-162.
Kobayashi, T., Ishiguro, K., Nakajima, T., Kim, H.Y., Okada, M. & Kobayashi, K. (2006).
Effects of elevated atmospheric CO2 concentration on the infection of rice blast and sheath
blight. Phytopathology, 96, pp. 425-431.
Koike, ST., Gladders, P. & Paulus, AO. (2007). Vegetable Diseases, a color handbook.
London: Manson Publishing LtD.
Kubicek C.P., Komoń -Zelazowska M., Sandor E. & Druzhinina I.S. (2007). Facts and
challenges in the understanding of the biosynthesis of peptaibols by Trichoderma. Review.
Chemistry & Biodiversity, 4, pp. 1068-1082.
Kucharek, T. (2000). Rhizoctonia diseases in aboveground plant parts of agronomic and
vegetable crops. Plant Pathology Fact Sheet pp 41. Florida Cooperative Extension Service.
Kuninga, S., Natsuaki, T., Takeuchi, T. & Yokosawa, R. (1997). Sequence variation of the
rDNA ITS regions within and between anastomosis groups in Rhizoctonia solani. Current
Genetics, 32, pp. 237-243.
Lamers, J., Wanten, P. & Blok, W. (2004). Biological soil desinfestation: a safe and effective
approach for controlling soil-borne pests and diseases. Agroindustria, 3, pp. 289-291.
Lazarovits, G., Conn, K.L., Abbasi, P.A. & Tenuta, M. (2005). Understanding the mode of
action of organic soil amendments provides the way for improved management of soil-borne
plant pathogens. Acta Horticulturae, 698, pp. 215-224.
Macnish, G. C. (1985). Methods of reducing Rhizoctonia patch of cereals in Western
Australia. Plant Pathology, 34, pp. 175–181.
Marcus, L., Barash, I., Sneh, B., Koltin, Y. & Finkler, A. (1986). Purification and
characterization of pectolytic enzymes produced by virulent and hypovirulent isolates of
Rhizoctonia solani Kuhn. Physiological and Molecular Plant Pathology, 29, pp. 325-336.
Matheny , P. B. , Wang, Z. , Binder , M., Curtis, J. M., Lim Y. W., Nilsson, R. H., Hughes, K.
W., et al . (2007) . Contributions of rpb2 and tef1 to the phylogeny of mushrooms and allies
(Basidiomycota, Fungi). Molecular Phylogenetics and Evolution, 43, pp. 430 – 451.
Moore, R.T. (1987). The genera of Rhizoctonia-like fungi: Ascorhizoctonia, Ceratorhiza gen.
nov., Epulorhiza gen. nov., Moliniopsis, and Rhizoctonia. Myctotaxon 29, pp. 91-99.
Nandakumar, R., Babu, S., Viswanathan, R., Raguchander, T. & Samiyappan, R. (2001).
Induction of systemic resistance in rice against sheath blight disease by Pseudomonas
fluorescens. Soil Biology & Biochemistry, 33, pp. 603-612.
76
Nielsen T.H., Christophersen C., Anthoni U. & Sorensen J. (1999). Viscosinamide, a new
cyclic depsipeptide with surfactant and antifungal properties produced by Pseudomonas
fluorescens DR54. Journal of Applied Microbiology, 87, pp. 80–90.
Nielsen T.H., Thrane C., Christophersen C., Anthoni U. & Sorensen J. (2000). Structure,
production characteristics and fungal antagonism of tensin - a new antifungal cyclic
lipopeptide from Pseudomonas fluorescens strain 96.578. Journal of Applied Microbiology,
89, pp. 992-1001.
O’Sullivan, D.J. & O’Gara, F. (1992). Traits of fluorescent Pseudomonas spp. Involved in
suppression of plant root pathogens. Microbiological Reviews, 56, pp. 662-676.
Ohkura, M., Abawi, G.S., Smart C.D. & Hodge K.T. (2009). Diversity and aggressiveness of
Rhizoctonia solani and Rhizoctonia-like fungi on vegetables in New York. Plant disease 93:
pp. 615-624.
Pannecoucque J. (2009). Characterization, pathogenicity and biological control of
Rhizoctonia spp. associated with field-grown vegetables. Doctoraat, Faculteit Bioingenieurswetenschappen, Universiteit Gent.
Paulitz, T.C., Smiley R.W. & Cook R.J. (2002). Insights into the prevalence and management
of soilborne cereal pathogens under direct seeding in the Pacific Northwest, USA. Canadian
Journal of Plant Pathology, 24, pp. 416-428.
Perneel M., Heyrman J., Adiobo A., De Maeyer K., Raaijmakers J.M., De Vos P. & Hofte M.
(2007). Characterization of CMR5c and CMR12a, novel fluorescent Pseudomonas strains
from the cocoyam rhizosphere with biocontrol activity. Journal of Applied Microbiology, 103,
pp. 1007–1020.
Postma, J., Hospers, M. & Colon, L. (2004). Rhizoctonia-decline in aardappelen in de
biologische landbouw. Geraadpleegd op 24 maart 2014 via http://edepot.wur.nl/19740.
Postma, J. & Schilder, M.T. (2005). Bodemweerbaarheid tegen Rhizoctonia solani AG 2-1 in
bloemkool. Mededelingenblad van de Koninklijke Nederlandse Plantenziektekundige
Vereniging. Pp. 208-211.
Postma, J., Scheper, R.W.A. & Schilder, M.T. (2010). Effect of successive cauliflower
plantings and Rhizoctonia solani AG 2-1 inoculations on disease suppressiveness of a
suppressive and a conducive soil. Soil Biology and Biochemistry, 42, pp. 804 - 812.
Raaijmakers, J.M., de Bruijn, I. & De Kock, M.J.D. (2006). Cyclic lipopeptide production by
plant-associated Pseudomonas spp.: Diversity, activity, biosynthesis, and regulation.
Molecular Plant-Microbe Interactions, 19, pp. 699 - 710.
77
Raaijmakers, J. M., Paulitz, T. C., Steinberg, C., Alabouvette, C. & Moënne-Loccoz, Y.
(2009). The rhizosphere: a playground and battlefield for soilborne pathogens and beneficial
microorganisms. Plant Soil, 321, pp. 341 - 361.
Roberts, P. (1999). Rhizoctonia-forming fungi: a taxonomic guide. Royal Botanical Gardens,
Kew. 239 pp.
Rovira, A.D. (1986). Influence of crop rotation and tillage on Rhizoctonia bare patch of wheat.
Phytopathology, 76, pp.669-673.
Rush, C.M., Carling, D.E., Harveson, R.M. & Mathieson, J.T. (1994). Prevalence and
pathogenicity of anastomosis groups of Rhizoctonia solani from wheat and sugarbeet in
Texas. Plant Disease, 78, pp. 349-352.
Sadowsky, M. & Schortemeyer, M. (1997). Soil microbial responses to increased
concentrations of atmospheric CO2. Global Change Biology, 3, pp. 217-224.
Scheuerell, S.J. & Mahaffee, W.F. (2005). Microbial recolonization of compost after peak
heating needed for the rapid development of damping-off suppression. Compost Science and
Utilization, 13, pp. 65 - 71.
Schillinger, W.F. & Paulitz, T.C. (2006). Reduction of Rhizoctonia bare patch in wheat with
barley rotations. Plant Disease, 90, pp. 302-306.
Schneider, H. (2008). Rhizoctonia. Geraadpleegd op 22 februari
http://applicaties.irs.nl/ccmsupload/ccmsdoc/5-2-4%20Rhizoctonia.pdf
2014
via
Scholte, K. (1989). Effects of soil-borne Rhizoctonia solani Kühn on yield and quality of ten
potato cultivars. Potato Research, 32, pp. 367-376.
Sharma, K. C. & Chowdhury, B. (1984). Epidemiology of cauliflower within different
soils in Jammu. Indian J. Plant Pathol., 2(1), pp. 78-79.
Sharon, M., Kuninga, S., Hyakumachi, M., Naito, S. & Sneh B. (2008). Classification of
Rhizoctonia spp. using rDNA-ITS sequence analysis supports the genetic basis of the
classical anastomosis grouping. Mycoscience, 49, pp. 93-114.
Sharon, M., Kuninga, S., Hyakumachi, M. & Sneh B. (2006). The advancing identification and
classification of Rhizoctonia spp. Using molecular an biotechnological methods compared
with the classical anastomosis grouping. Mycoscience, 47, pp. 299-316.
Siddiqui, I.A. & Shaukat, S.S. (2002) . Resistance against the damping-off fungus
Rhizoctonia solani systemically induced by the plant-growth-promoting rhizobacteria
Pseudomonas aeruginosa (IE-6S(+)) and P. fluorescens (CHAO). Journal of Phytopathology,
150, pp. 500-506.
78
Smiley, R.W. & Uddin, W. (1993). Influence of soil temperature on Rhizoctonia root rot (R.
solani AG-8 and R. oryzae) of winter wheat. Phytopathology, 83, pp. 777-785.
Snapp, S.S., Date, K.U., Kirk, W., O’Neil, K., Kremen, A. & Bird, G. (2007). Root, shoot
tissues of Brassica juncea and Cereal secale promote potato health. Plant and soil, 294,
pp. 55-72.
Sneh, B., Burpee, L. & Ogoshi, A. (1991). Identification of Rhizoctonia species. The
American Phytopathology Society, St. Paul, Minnesota, USA.
Sneh, B., Jabaji-Hare, S., Neate, S. & Dijst, G. (1996). Rhizoctonia species: taxonomy,
molecular biology, ecology, pathology and disease control. Kluwer Academic Publishers,
pp.149-162.
Stevens Johnk, J., Jones R.K. (2001). Differentiation of three homogeneous groups of
Rhizoctonia solani anastomosis group 4 by analysis of fatty acids. Phytopathology, 91, pp.
821-830.
Steyaert J.M., Ridgway H.J., Elad Y. & Stewart A. (2003). Genetic basis of mycoparasitism: a
mechanism of biological control by species of Trichoderma. Review. New Zealand Journal of
Crop and Horticultural Science, 31, pp. 281-291.
Subbarao, K.V. & Hubbard, J.C. (1999). Evaluation of broccoli residue incorporation into field
soil for Verticillium wilt control in cauliflower. Plant Disease, 83, pp. 124-129.
Syngenta (2011). Sedaxane. Cereals, technical information. Geraadpleegd op 24 maart 2014
via http://syngenta.signal-mail.com/FINAL-Tech%20Info-Cereals-7711.pdf.
Tewoldemedhin, Y.T., Lamprecht, S.C., McLeod, A. & Mazzola, M. (2006). Characterization
of Rhizoctonia spp. recovered from crop plants used in rotational cropping systems in the
Western Cape Province of South Africa. Plant disease, 90, pp. 1399-1406.
Thevenot, M., Dignac, M.F., Rumpel, C. (2010). Fate of lignins in soils: A review. Soil Biology
and Biochemistry, 42, pp. 1200 - 1211.
Tomaso-Peterson, M. & Trevathan, L. E. (2007). Characterization of Rhizoctonia-like fungi
isolated from agronomic crops and turfgrasses in Mississippi. Plant Disease, 91, pp. 260265.
Tuitert, G., Szczecht, M. & Bollen, G.J. (1998). Suppression of Rhizoctonia solani in potting
mixtures amended with compost made from organic household waste. Phytopathology, 88,
pp. 764-773.
79
Van Beneden, S., Roobroeck, D., Franca, S.C., De Neve, S., Boeckx, P. & Hofte, M. (2010)
Microbial populations involved in the suppression of Rhizoctonia solani AG1-1B by lignin
incorporation in soil. Soil Biology and Biochemistry, 42, pp. 1268 - 1274.
Veerman, A. (2003). Teelthandleiding zetmeelaardappelen, ziekten en
Geraadpleegd
op
22
februari
2014
http://www.kennisakker.nl/kenniscentrum/handleidingen/teelthandleidingzetmeelaardappelen-ziekten-en-plagen
plagen.
via
Weinhold A.R. & Motta, J. (1973). Initial host responses in cotton to infection by Rhizoctonia
solani. Phytopathology, 63, pp. 157-162.
Weller D.M. (2007). Pseudomonas biocontrol agents of soilborne pathogens: looking back
over 30 years. Phytopathology, 97, pp. 250-256.
Weller, D.M., Raaijmakers, J.M., Gardener, B.B.M. & Thomashow, L.S. (2002). Microbial
populations responsible for specific soil suppressiveness to plant pathogens. Annual Review
of Phytopathology, 40, pp. 309 - 348.
Whipps J.M. & Davies K.G. (2000). Success in biological control of plant pathogens and
nematodes by microorganisms. In Gurr G. & Wratten S., eds, Biological control: measures of
success. Kluwer Academic Publisher, Dordrecht, The Netherlands, pp. 231-270.
Yao, M., Tweddell, R. & Désilets, H. (2002). Effect of two vesicular-arbuscular mycorrhizal
fungi on the growth of micropropagated potato plantlets and on the extent of disease caused
by Rhizoctonia solani. Mycorrhiza, 12, pp. 235-242.
80
Bijlage 1
Overzicht staalnames
Wortelmethode (in geval van aardappel en biet: aangetast stuk)
Tandenstokermethode
Beide methodes
Plaats
Ablaincourt (FR)
Alveringem
Beveren
Bocholt
Bottelare
Dendermonde
Dongelberg, WaalsBrabant
Duffel
Contactpersoon Gewas
Brecht Verlae
Aardappel
/
Haver
Aardappel
/
Maïs
Aardappel
/
Maïs
Aardappel
Haesaert Geert
Triticale
Wintertarwe
Wintertarwe
Maïs
Maïs
Wintertarwe
Eiwitgewassen
Aardappel
Wintertarwe
Suikerbiet
Van Laere Geert Maïs
Brecht Verlae
Aardappel
Bioboer
Busschots
Eeklo
Evergem
/
Roegiers
Mathias
Flaucourt (FR)
Geel
Brecht Verlae
Van De Ven
Gert
Geer (Luik)
Gembloux (Namen)
Brecht Verlae
Brecht Verlae
Gontrode
Galle Koen
Ghistelinck Dirk
Venneman
Hendrik
Grembergen
Hoogstade
Hoogstraten
/
Vermeulen Dirk
Verheyen Jef
Huldenberg
Vanacker
Walter
Vercruysse
Kortrijk
Voorvrucht
/
/
Kolen
Maïs
Wintertarwe
Maïs
Maïs
Aardappelen
/
/
Aardappelen
Wintertarwe
Maïs
Maïs
Eiwitgewassen
Maïs
Zomergerst
Grasklaver
/
Haver
Bodemsoort
/
Zandleem
Zandleem
Klei
Klei
Zand
Zand
Zandleem
Zandleem
Zandleem
Zandleem
Zandleem
Zandleem
Zandleem
Zandleem
Zandleem
Zandleem
Leem
/
Zandleem
Aardappel
Maïs
Wintertarwe
Maïs
Maïs
Zandleem
Zand
Zand
Maïs
Aardappel
Maïs
Maïs
/
Gras
Zand
/
Zand
Maïs
Maïs
Aardappel
Aardappel
Aardappel
Aardappel
Wintertarwe
Wintertarwe
Wintertarwe
Wintertarwe
Maïs
Maïs
Maïs
/
/
/
Maïs
Aardappelen
Wintertarwe
Zand
Zand
Zand
/
/
/
Zandleem
Zand
Zand
Grasklaver
Suikerbiet
Suikerbiet
Maïs
Maïs
Maïs
Suikerbiet
Leem
Zandleem
Zand
Zand
Zand
81
Zand
Zandleem
Wintertarwe
Maïs
Wintertarwe
Maïs
Maïs
Maïs
Suikerbiet
Wintertarwe
Gerst
Zandleem
Lapscheure
Lennik
Lembeke
Ignace
Dupon Geert
Speeckaert Filip
Goethals
Kristof
Lierde
Vindevoghel Luc
Meetkerke
Vanloocke
Walter
Venneman
Hendrik
Melle
Merchtem
Van Haute Jolien
Merkem
Verstraete
Severine
Van Damme
Noël
Moerkerke
Moorsel
Nokere
Noorderwijk
Nukerke
Pervijze
Poperinge
/
/
Verwimp Bavo
Lefevre Cedric
Depoorter
Frederik
Vermeulen
Patrick
Ravels
/
Ronse
Bouche François
Rumbeke-Beitem
Boone Kristof
Schriek
Sint-Kwintens-Lennik
Sint-Lievens-Esse
/
Bauwens Peter
Sint-Lievens-Houtem
Sint-Magriete
De Beck Bart
/
Gerst
Wintertarwe
Maïs
Maïs
Maïs
Maïs
Maïs
Maïs
Klei
Zandleem
Zandleem
Zand
Maïs
Gras
Wintertarwe
Maïs
Wintertarwe
Aardappel
Aardappel
Korrelmaïs
Wintertarwe
Zand
Zand
Leem
Leem
Klei
Wintertarwe
Aardappel
Zand
Wintertarwe
Maïs
Wintertarwe
Wintertarwe
Wintertarwe
Aardappel
Zand
Maïs
Aardappel
Maïs
Leem
Leem
Klei
Maïs
Maïs
Zandleem
Voederbiet
Prei
Prei
Triticale
Wintertarwe
Wintertarwe
Maïs
Korrelmaïs
Korrelmaïs
Zandleem
Zandleem
Zandleem
Aardappel
Suikerbiet
Zandleem
Klei
Wintertarwe
Kuilmaïs
Zandleem
Wintertarwe
Maïs
Suikerbiet
Maïs
Aardappel
Wintertarwe
Wintertarwe
Wintertarwe
Maïs
Suikerbiet
Tarwe
Gerst
Maïs
Aardappel
Suikermaïs
Rode biet
Boon
Schorseneer
Maïs
Suikerbiet
Wintertarwe
Aardappel
Gras
Suikerbiet
Suikerbiet
Maïs
Wintertarwe
Wintertarwe
Wortelen
Wortelen
Zandleem
Zandleem
Zandleem
Zand
Zand
Leem
Leem
Leem
Leem
Leem
Zandleem
Zandleem
Broccoli
Rogge
Haver
Haver
Haver
Zandleem
Zand
Zand
Zand
Zand
Maïs
Wintertarwe
Aardappel
Triticale
Aardappel
Grasklaver
Zandleem
Leem
Zandleem
Leem
Zandleem
82
Sint-Martens-Lennik
/
Steenhuize
Hendrickx
Mathieu
Dermaut Jozef
Caufman Dieter
Tiegem
Tongeren
Waarschoot
Wetteren
Zaffelare
Zevekote
Van Hecke
Frank
Van Hecke Wim
Devreeze Dirk
Gerst
Maïs
Maïs
Wintertarwe
Wintertarwe
Wintertarwe
Maïs
Maïs
Voederbiet
Maïs
Maïs
Maïs
Wintertarwe
Zandleem
Zandleem
Zandleem
Suikerbiet
Cichorei
Suikerbiet
Maïs
Boon
Maïs
Zandleem
Leem
Leem
Leem
Leem
Zandleem
83
Bijlage 2
Resultaten sequenering
Isolaat
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Gewas
Tarwe
Tarwe
Tarwe
Tarwe
Tarwe
Triticale
Tarwe
Tarwe
Gerst
Tarwe
Tarwe
Tarwe
Tarwe
14
Tarwe
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
Tarwe
Gerst
Tarwe
Tarwe
Tarwe
Tarwe
Tarwe
Tarwe
Tarwe
Tarwe
/
/
/
/
/
/
/
Maïs
Aardappel
Aardappel
Aardappel
Aardappel
Aardappel
Aardappel
Aardappel
/
Wintertarwe
Aardappel
Aardappel
Triticale
45
Wintertarwe
Locatie
Melle
Tiegem
Huldenberg
Hoogstade
Hoogstade
Bottelare
Gontrode
Pervijze
Lapscheure
Melle
Tiegem
Tongeren
Sint-LievensEsse
Sint-LievensEsse
Lennik
Kortrijk
Gontrode
Poperinge
Gontrode
Poperinge
Gontrode
Tiegem
Lierde
Gontrode
Bottelare
Unief
Unief
Unief
Bottelare
Bottelare
Bottelare
Tongeren
Flaucourt
Flaucourt
Geer
Dongelberg
Ablaincourt
Gembloux
Dongelberg
Ref
Poperinge
Bottelare
Bottelare
Sint-LievensHoutem
Bottelare
Voorvrucht
Aardappel
Suikerbiet
Suikerbiet
Suikerbiet
Suikerbiet
Aardappel
Maïs
Suikerbiet
Maïs
Aardappel
Suikerbiet
Cichorei
Bodemtype
Zand
Zandleem
Zandleem
Zandleem
Zandleem
Zandleem
Zandleem
Klei
Klei
Zand
Zandleem
Leem
Leem
Resultaat sequenering
Uncultured fungus
Microdochium bolleyi
Neonectria sp.
Lewia infectoria
Neonectria radicicola
Microdochium bolleyi
Neonectria radicicola
Lewia sp.
Uncultured Lewia
Alternaria rosae
Microdochium bolleyi
Uncultured fungus
Microdochium bolleyi
Leem
Microdochium bolleyi
Maïs
Kuilmaïs
Aardappelen
Maïs
Maïs
Suikerbiet
korrelmaïs
Maïs
/
/
/
/
/
/
/
Suikerbiet
/
/
/
/
/
/
/
/
Maïs
Eiwitgewassen
Eiwitgewassen
Grasklaver
Zandleem
Zandleem
Zandleem
Zandleem
Zand
Zandleem
Zandleem
Zandleem
Leem
Zandleem
/
/
/
/
/
/
/
Leem
/
/
/
/
/
/
/
/
Zandleem
Zandleem
Zandleem
Leem
/
Lewia infectoria
Ilyonectria radicicola
Fusarium culmorum
Microdochium bolleyi
Ilyonectria radicicola
Neonectria radicicola
Microdochium bolleyi
Pleosporales sp.
Dictyosporium sp.
Rhizoctonia solani: AG 4 HGI
Rhizoctonia solani: AG1-1C
Rhizoctonia solani: AG 5
Rhizoctonia solani: AG 4 HG II
Rhizoctonia solani: AG 2-1
Rhizoctonia solani: AG 4 HGI
Rhizoctonia solani: AG 4 HGI
Binucleate Rhizoctonia: AG F
Rhizoctonia solani: AG 3
Rhizoctonia solani: AG 3
Rhizoctonia solani: AG 3
Rhizoctonia solani: AG 3
Rhizoctonia solani: AG 3
Rhizoctonia solani: AG 3
Rhizoctonia solani: AG 3
Rhizoctonia cerealis
Rhizoctonia solani: AG 4 HGI
Uncultured fungus
Pythium ultimum
Fusarium sp.
Maïs
Zandleem
Phytium ultimum
Maïs
84
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
Eiwitgewas
Haver
Wintertarwe
Wintertarwe
Aardappel
Wintertarwe
Biet
Aardappel
Maïs
Aardappel
Wintertarwe
Aardappel
Wintertarwe
Wintertarwe
Gerst
Wintertarwe
Wintertarwe
Wintertarwe
Gerst
Aardappel
Wintertarwe
Wintertarwe
Wintertarwe
Wintertarwe
Biet
Aardappel
Maïs
Aardappel
Wintertarwe
Wintertarwe
Maïs
Wintertarwe
Wintertarwe
Wintertarwe
Wintertarwe
Wintertarwe
Wintertarwe
Maïs
Maïs
Maïs
Maïs
Aardappel
Wintertarwe
Wintertarwe
Wintertarwe
Wintertarwe
Maïs
Wintertarwe
Maïs
Maïs
Maïs
Wintertarwe
Bottelare
Duffel
Tongeren
Bottelare
Bottelare
Bottelare
Moerkerke
Bottelare
Bottelare
Bottelare
Bottelare
Bottelare
Poperinge
Poperinge
Rumbeke
Hoogstade
Poperinge
Hoogstade
Sint-Margriete
Bottelare
Bottelare
Bottelare
Bottelare
Bottelare
Bottelare
Bottelare
Bottelare
Bottelare
Gontrode
Nukerke
Geel
Merchtem
Merchtem
Merchtem
Merchtem
Merchtem
Merchtem
Moerkerke
Schriek
Wetteren
Waarschoot
Ravels
Ronse
Ronse
Ronse
Ronse
Evergem
Ronse
Gontrode
Gontrode
Gontrode
Merkem
Maïs
Zandleem
Cichorei
Maïs
Eiwitgewassen
Maïs
Maïs
Eiwitgewassen
Wintertarwe
Eiwitgewassen
Maïs
Eiwitgewassen
Maïs
Maïs
Wortelen
Suikerbiet
Maïs
Suikerbiet
Leem
Zandleem
Zandleem
Zandleem
Zandleem
Zandleem
Zandleem
Zandleem
Zandleem
Zandleem
Zandleem
Zandleem
Zandleem
Zandleem
Zandleem
Zandleem
Eiwitgewassen
Maïs
Maïs
Maïs
Maïs
Zomergerst
Eiwitgewassen
Wintertarwe
Eiwitgewassen
Wintertarwe
Aardappel
Maïs
Aardappel
Aardappel
Aardappel
Aardappel
Maïs
Maïs
Maïs
Rogge
Zandleem
Zandleem
Zandleem
Zandleem
Zandleem
Zandleem
Zandleem
Zandleem
Zandleem
Zand
Zandleem
Zand
Leem
Leem
Leem
Leem
Leem
Leem
Zandleem
Zand
Zandleem
Aardappel
Suikerbiet
Suikerbiet
Maïs
Maïs
Maïs
Suikerbiet
Grasklaver
Grasklaver
Grasklaver
Maïs
Zand
Leem
Leem
Leem
Leem
Zand
Leem
Leem
Leem
Leem
Klei
Amanita basiorubra
Hypocrea rufa
Phytium intermedium
Phytium sylvaticum
Rhizoctonia solani: AG 3
Amanita basiorubra
Fusarium sp.
Amanita basiorubra
Uncultured fungus
Phytium ultimum
Phytium sylvaticum
Phytium intermedium
Phytium intermedium
Amanita basiorubra
Trichoderma hamatum
Amanita basiorubra
Trichoderma hamatum
Phytium sp.
Trichoderma viride
Uncultured Mortierella
Rhizoctonia oryzae
Trichoderma hamatum
Rhizoctonia solani: AG2-1
Rhizoctonia oryzae
Fusarium tricinctum
Fusarium oxysporum
Ascomycota sp.
Rhizoctonia solani: AG 3
Mortierella sp.
Mortierella sp.
Trichoderma hamatum
Rhizoctonia oryzae
Trichoderma hamatum
Trichoderma viride
Uncultured fungus
Trichoderma hamatum
Trichoderma gamsii
Trichoderma hamatum
Mucor racemosus
Uncultured fungus
Uncultured fungus
Mucor racemosus
Uncultured Mortierella
Uncultured fungus
Uncultured fungus
Uncultured fungus
Fusarium solani
Uncultured Mortierella
Trichoderma hamatum
Mortierella sp.
Trichoderma hamatum
Fusarium equiseti
85

Tipkaart Rudis lelie bolontsmetting 2401 KB

Grote verschillen productie groenbemester na maïs

Bloembollenbericht 1 2014

Figurenlijst (74 kB, 10 januari 2013)

BEMA Commodities

Condi Plants - Inno Potato Award

HAARBROEKSTEEG 4 7217 MC HARFSEN TEL

dinerkaart - Old School

1. 1. A s 2. z Blauwe Sluis Aan de Noor steiger