Inductie van DNA dubbelstrengbreuken door mammografie X-stralen in borstweefsel. Charlotte CARLIER Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen Promotor: Prof. Dr. Anne VRAL Vakgroep: Medische basiswetenschappen Academiejaar 2013-2014 Inductie van DNA dubbelstrengbreuken door mammografie X-stralen in borstweefsel. Charlotte CARLIER Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen Promotor: Prof. Dr. Anne VRAL Vakgroep: Medische basiswetenschappen Academiejaar 2013-2014 “De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.” Datum: Charlotte Carlier Prof. Dr. Anne Vral Voorwoord Deze thesis zou nooit tot stand zijn gekomen zonder hulp van verschillende mensen, daarom richt ik graag een woordje van dank naar hen. Eerst en vooral wil ik mijn promotor, Prof. Dr. Anne Vral bedanken. Zonder haar expertise, vakkennis, toewijding en feedback was deze masterproef niet tot stand gekomen. Ik wil haar tevens bedanken voor het beantwoorden van vele vragen en het nalezen van mijn thesis. Ik wil ook Prof. Dr. Cornelissen bedanken voor het gebruik van het labo. Uiteraard wil ik ook mijn lieve begeleidster, Julie Depuydt, bedanken voor het beantwoorden van vele vragen, het nalezen van mijn thesis, het maken van de grafieken en nog zoveel meer. Een speciaal woordje van dank gaat uit naar Leen. Ook al had ze het druk met andere zaken, toch was ze steeds bereid om me te helpen. Zowel voor het uitvoeren als voor het beoordelen van de talrijke immunohistochemische kleuringen. Ik wil haar ook bedanken voor het beantwoorden van vele vragen en voor mij efficiënt de kneepjes van de routine histologie aan te leren. Dankjewel Leen! Annelies, dankjewel voor het geven van vele nuttige tips, het beantwoorden van vele vragen en de leuke babbels. Annelot, dankjewel voor het vinden van bepaalde artikels die ik niet zonder betaling te pakken kon krijgen! Indra, dankjewel voor de vele hulp in het 2de semester. Heidi, Johanna, Greet, Toke, Pamela, Sebastian, Elien, Elke en Sylvia dankjewel voor de aangename middagpauzes en vragen die ik aan jullie mocht stellen. Tot slot wil ik ook mijn ouders en vrienden bedanken voor hun onvoorwaardelijke steun tijdens mijn studentenjaren. Inhoudstafel Samenvatting -1- Abstract -2- 1. Inleiding -3- 1.1 Borstkankerincidentie -3- 1.2 Anatomie en histologie van de borst -3- 1.3 Screeningsmammografie -6- 1.4 Ioniserende straling (IR) -7- 1.4.1 Deoxyribonucleïnezuur (DNA) schade geïnduceerd door IR -8- 1.4.2 Lineaire energie transfer (LET) -9- 1.4.3 Relatieve biologische effectiviteit (RBE) - 10 - 1.4.4 Detectie over inductie ratio (DIR) - 12 - 1.5 Cellulaire respons op DNA schade - 13 - 1.5.1 Herstelmechanismen voor DNA DSB - 13 - 1.5.2 Repair kinetiek van DNA DSB - 17 - 1.5.3 BRCA1 en BRCA2 - 17 - 1.5.4 γ-H2AX foci test - 19 - 1.6 Doelstelling - 20 - 2. Materialen en Methoden - 21 - 2.1 Onderzoekspopulatie - 21 - 2.2 Bestraling + incubatie - 22 - 2.3 Fixatie - 23 - 2.4 Inbedden + weefselcoupes snijden - 23 - 2.5 γ-H2AX foci test - 24 - 2.5.1 Haematoxyline-eosine (HE) kleuring - 24 - 2.5.2 Immunohistochemische kleuring - 24 - 2.5.3 Visualisatie en analyse van de γ-H2AX foci - 27 - 3. Resultaten - 27 - 3.1 HE kleuring - 27 - 3.2 Optimalisatie van het protocol voor de γ-H2AX foci analyse - 28 - 3.3 Dosis-respons curve - 32 - 3.4 Repair kinetiek 4. Discussie - 35 - 36 - 4.1 Materiaal - 37 - 4.2 γ-H2AX foci analyse - 38 - 4.3 Dosis-respons curve - 39 - 4.4 Repair kinetiek - 44 - 5. Algemeen besluit - 46 - 6. Referenties - 47 - 7. Bijlagen Afkortingen APLF ATM ATR BARD1 BRCA1 BRCA2 C-terminus CT DNA DNA-PKcs DSB Ekin EMS Gy HE HR IAEA ICRP IR KCE keV kVp LET LNT MeV MGD min µm mm MRI MRN NER NHEJ Palb2 PBL PMMA PNK RBE RPA sec SSB TDLU UV WRN XRCC4 Aprataxine and PNK-like factor Ataxia Telangiectasia Mutated ATM and Rad3-related BRCA1 associated RING Domain protein 1 Breast Cancer gene 1 Breast Cancer gene 2 Carboxy-terminus Computed Tomografie Desoxyribonucleïne Acid DNA-Proteïne Kinase catalytische subunit Double-Strand Break Kinetische Energie Elektromagnetische Straling Gray Haematoxyline-Eosine Homologe Recombinatie International Atomic Energy Agency International Commission on Radioprotection Ionizing Radiation The Belgian Health Care Knowledge Centre kiloelectron volt kilovolts peak Linear Energy Transfer Linear No Treshold Megaelektron Volt Mean Glandular Dose minuten micrometer milimeter Magnetic Resonance Imaging Mre11/RAD50/NBS1 Nucleotide Excision Repair Non Homologous End Joining Partner and localisator of BRCA2 Perifere Bloed Lymfocyten Polymethylmethacrylaat Polynucleotide Kinase Relatief Biologische Effectiviteit Replicatie Proteïne A seconden Single-Strand Break Terminal Duct Lobular Unit Ultraviolet Werner’s syndroom helicase X-Ray repair Cross-Complementing protein 4 Samenvatting Wereldwijd treft borstkanker 1 op de 9 vrouwen en vormt het tevens de belangrijkste doodsoorzaak bij vrouwen in de leeftijdscategorie van 50 tot en met 69 jaar. Omdat borstkanker het meest frequent voorkomt in deze leeftijdsgroep, biedt de Vlaamse overheid deze vrouwen gratis een 2-jaarlijkse mammografie aan. Mammografieën maken gebruik van ioniserende 30kV X-stralen en laten toe om borstkanker vroegtijdig op te sporen en te behandelen, zodat een betere prognose en reductie van mortaliteit kan bekomen worden. Het ICRP veronderstelt een RBE van 1 voor alle lage LET straling, inclusief 30kV X- en 60Co γstralen. Dit wordt echter in vraag gesteld omdat deze RBE afkomstig is van extrapolaties van data uit de “life span study”, waarbij overlevenden van Hiroshima en Nagasaki waren blootgesteld aan hoge energie 60Co γ-stralen (2-5MeV). Om deze reden wordt in dit onderzoek het effect van 30kV X-stralen nagegaan, met 60 Co γ- stralen (1,22MeV) als referentie. Zowel de inductie als repair van DNA DSB wordt onderzocht aan de hand van de zeer gevoelige en specifieke γ-H2AX foci test. In vergelijking met voorgaande studies, waar gefocust werd op cellen of cellijnen, wordt in deze studie gewerkt met vers gedisseceerd gezond borstweefsel. Op die manier wordt een relevantere setting bekomen. Enerzijds tonen eerste resultaten uit dit onderzoek aan dat 30kV X-stralen algemeen een hoger aantal foci induceren dan 60 Co γ-stralen na 30min incubatie. Preliminaire resultaten tonen eveneens een hypersensitiviteit aan in het lage dosis gebied (0-10mGy), dewelke meer is uitgesproken voor 30kV X- dan voor 60 Co γ-stralen. Dit uit zich in een RBE van 2,34 voor γ- H2AX foci in het lage dosis gebied (0-10mGy). Anderzijds tonen preliminaire resultaten over de repair kinetiek van DNA DSB aan dat het aantal geïnduceerde γ-H2AX foci daalt, voor beide stralingskwaliteiten. Het aantal geïnduceerde foci reduceert na 24 uur naar achtergrondwaarden bij 4mGy 60 Co γ-stralen. Dit is echter niet het geval bij 4 en 40mGy 30kV X-stralen, waar het aantal residuele foci na 24 uur boven de achtergrondwaarden blijft. Verdere uitbreiding van dit onderzoek, met meerdere stalen, is noodzakelijk om significante resultaten te bekomen. -1- Abstract Background: A lot of studies have investigated the effect of low mammography X-rays on cells. In this study we want to investigate the effect of 30kV X-rays on healthy breast tissue and determine the RBE for γ-H2AX foci. We also want to study the repair kinetics of DNA DSB for 30kV X-and 60Co γ-rays after 24 hours. Methods: Healthy breast tissue of 8 female donors was irradiated in vitro with 30kV X-and 60Co γ-rays, with doses between 0 and 100mGy. The γ-H2AX foci assay was used to quantify the number of DNA DSB after irradiation. Repair kinetics of γ-H2AX foci were observed 30minutes and 24hours after irradiation with 4 and 40mGy 30kV X- and 60Co γ-rays. Results: Preliminary results show that 30kV X-rays are in general more harmful than 60 Co γ- rays. First results also show a hypersensitivity in the low-dose region between 0-10mGy for 30kV X-and 60 Co γ-rays. An RBE of 2,34 was obtained with the γ-H2AX foci assay in this low-dose region. Results of the repair kinetics show that the initial γ-H2AX foci reduce after 24 hours to background levels after irradiation with 4mGy 60Co γ-rays. Though, this was not the case for 4 and 40mGy 30kV X-rays, where the residual foci stay above background levels. Conclusions: Preliminary results show that mammography X-rays produce more DSB in comparison with 60Co γ-rays. Therefore, 30kV X-rays are supposed to be more harmful than 60Co γ-rays (RBE: 2,34). Concerning repair kinetics, a decrease was found after 24 hours for both irradiation conditions. -2- 1. Inleiding 1.1 Borstkankerincidentie Wereldwijd wordt 1 op de 9 vrouwen geconfronteerd met borstkanker [1]. Borstkanker is hierdoor de meest frequent gediagnosticeerde kanker en de belangrijkste doodsoorzaak bij vrouwen wereldwijd in de leeftijdscategorie van 50 tot en met 69 jaar [1-4]. Figuur 1 toont het absoluut aantal nieuwe borstkankers, gedetecteerd in 2011 bij de vrouwelijke populatie uit België [4]. Door preventief een screeningsmammografie te laten uitvoeren kan borstkanker vroeger worden gedetecteerd en beter worden behandeld. Dit leidt tot een betere prognose en reductie van mortaliteit. Hierdoor staat borstkanker desondanks zijn 1ste plaats qua incidentie, pas op de 3de plaats wat betreft mortaliteit [1, 5, 6]. Figuur 1: Het absoluut aantal nieuwe gediagnosticeerde borstkankers bij vrouwen uit België in 2011 [4]. 1.2 Anatomie en histologie van de borst Borstklieren zijn sterk gewijzigde tubulo-alveolaire apocriene zweetklieren die zich bevinden in subcutaan weefsel. Ze ontwikkelen zich vanaf de puberteit bij vrouwen onder invloed van oestrogeen en progesteron dat voornamelijk wordt vrijgesteld door de ovaria. Tijdens de eerste zwangerschap is er een significante stijging van het aantal klierbuizen voornamelijk onder invloed van het oestrogeen en progesteron, maar ook door prolactine, groeihormoon, insuline en hormonen afgescheiden door de bijnieren. Het is pas na de eerste zwangerschap dat het -3- borstklierweefsel volledig morfologisch en functioneel ontwikkeld zal zijn [7, 8]. Figuur 2 geeft de anatomische structuur van borstweefsel weer [8]. Borstweefsel is voornamelijk samengesteld uit vet- en fibroglandulair weefsel. De verhouding waarin deze weefsels voorkomen is afhankelijk van een aantal factoren waaronder leeftijd en hormonale regulatie. Het fibroglandulair weefsel, ook wel borstparenchym genoemd, is samengesteld uit 15 tot 25 lobaire septa die de borstklier opdelen in lobi. Deze worden van elkaar gescheiden door vet- en celrijk bindweefsel. Elke klier eindigt in een ductus lactiferus, die vlak voor het uitmonden in de tepel verbreedt in een sinus lactiferus [8]. Figuur 2: Anatomie van de borst [8]. Vanuit de ductus lactiferus lopen blind eindigende terminale ducti/lobulaire eenheden (TDLU). Een TDLU vormt de structurele en functionele eenheid van de borst. Figuur 3A en B toont respectievelijk een schematisch en histologisch overzicht van een TDLU [8]. In een actieve borst zijn de TDLU’s voornamelijk opgebouwd uit clusters van kleine melkkliergroepen, de lobuli. De lobuli zijn samengesteld uit trossen van klierblaasjes die acini worden genoemd, dewelke de eigenlijke melkklieren zijn. In een inactieve borst bestaan de TDLU’s voornamelijk uit terminale melkgangen of ducti. Zowel de lobuli als ducti worden omgeven door losmazig, lobulair (= intralobulair) stroma [8, 9]. Afhankelijk van de locatie hebben de ducti een andere structuur gaande van meerlagig plaveiselepitheel bij uitmonding in de tepel, over 2-lagig epitheel met basaal kubische cellen bedekt met cilindrische epitheelcellen, tot 1-lagig kubisch of cilindrisch epitheel in de TDLU’s. Naast de luminaire epitheliale cellaag, bevatten de TDLU’s ook een discontinuë basale cellaag van contraherende myoepitheliale cellen [7, 8, 10]. Deze -4- myoepitheliale cellen vertonen veel vacuolen tijdens de vroege en late luteale fase van de menstruele cyclus (dag 15-28) [11, 12]. De collecterende lobulaire ducti zorgen voor het transport van de alveolaire secreties naar de ductus lactiferus. Rondom de TDLU’s ligt voornamelijk dens lobair (= interlobulair) bindweefsel, dat overwegend is opgebouwd uit collageen (stevigheid van de borst) en vetweefsel [8]. A B Figuur 3A. Schematisch overzicht van een TDLU; 3B. Histologisch kleuring (HE) van een TDLU [8]. De meest voorkomende borstkankers zijn invasieve ductale carcinomen (80%), gevolgd door invasief lobulaire carcinomen (10%) [13]. Figuur 4 geeft een HE kleuring weer van een ductaal invasief carcinoom. Hierop is te zien dat kankercellen een euchromatische kern hebben met veel nucleoli, weinig cytoplasma en onregelmatig van vorm en grootte zijn. Naast tumorcellen worden ook kernen van inflammatoire cellen en losmazig bindweefsel afgebeeld. 3 1 2 Figuur 4: HE kleuring op een invasief ductaal carcinoom. 1. Kankercellen met kernen met meerdere nucleoli, 2. Inflammatiore cellen, 3. Losmazig bindweefsel. (Vergroting 40X). -5- 1.3 Screeningsmammografie Omdat borstkanker het meest frequent voorkomt in de leeftijdscategorie van 50 tot en met 69 jaar, biedt de Vlaamse overheid deze vrouwen sinds 15 juni 2001 gratis een 2-jaarlijkse screeningsmammografie aan [14]. Mammografieën maken gebruik van ioniserende X-stralen en laten toe om borstkanker vroegtijdig op te sporen en te behandelen, zodat een betere prognose en reductie van mortaliteit kan bekomen worden. Vanaf de leeftijd van 50 jaar zijn de voordelen hiervan reeds bewezen [5, 6, 15]. Door het intensief screenen van een asymptomatische populatie worden echter ook borsttumoren opgespoord die heel traag groeien en nooit aanleiding zouden geven tot symptomen of mortaliteit (overdiagnose). Soms worden ook letsels gezien op de medische beeldvorming, daar waar eigenlijk geen kanker aanwezig is (vals-positieven). Beiden vormen een actueel discussiepunt [16, 17]. Bij een mammografie wordt gebruik gemaakt van lage energie X-stralen met een piek en gemiddelde foton energie van respectievelijk 30 kV en 15-20 keV [1]. Standaard worden 2 opnames gemaakt per borst, 1 in craniocaudale en 1 in medio-laterale oblique richting [18]. De eenheid van geabsorbeerde stralingsdosis is de gray (Gy), waarbij 1Gy overeen komt met 1 joule/kilogram [18, 19]. Algemeen wordt aangenomen dat een dosis van 1-1,5 Gy X-stralen in weefsel aanleiding geeft tot 1000 enkelstrengbreuken (SSB) en 50 tot 100 dubbelstrengbreuken (DSB). De gemiddelde geabsorbeerde dosis, mean glandular dose (MGD), die wordt geabsorbeerd door het borstklierweefsel bedraagt bij de klassieke scherm-film ongeveer 2,5mGy/view en bij de digitale mammografie ongeveer 2mGy/view [17, 18, 20, 21]. De MGD kan echter door verschillende parameters worden beïnvloed. Hoge borstdensiteit, groter borstvolume, te weinig borstcompressie en variaties in de set-up van de mammograaf kunnen de MGD doen stijgen tot ongeveer 20mGy [21]. De klassieke scherm-film methode en digitale mammografie kunnen als evenwaardig worden beschouwd voor het detecteren van borstkanker. Digitale mammografie wordt echter wel aangeraden voor het screenen van jongere vrouwen met dens borstweefsel [17]. Door het gebruik van ioniserende X-stralen bij een mammografie loopt men steeds een beperkt risico op een stralingsgeïnduceerde borsttumor. Echter, door het herhaaldelijk blootstellen van een groot deel van de bevolking, mag het gebruik van deze ioniserende straling niet worden onderschat [1]. -6- Alternatieven voor een screeningsmammografie bij vrouwen met een verhoogd risico Voor vrouwen met een familiaal verhoogd of sterk verhoogd risico op borstkanker is het aan te raden zich reeds intensief te laten opvolgen vanaf jongere leeftijd (20-30 jaar). De methode en de frequentie van de follow-up is momenteel echter niet gestandaardiseerd en in de richtlijnen van het Belgisch federaal kenniscentrum voor gezondheidszorg (KCE) staat niets vermeld over mutatiedragers (BRCA1 en/of BRCA2) [22]. Men is op zoek naar optimale diagnostische tools die per risicogroep zouden kunnen worden gebruikt. Voor vrouwen met een verhoogd familiaal risico wordt een jaarlijkse mammografie vanaf de leeftijd van 40 jaar aanbevolen. Vanaf de leeftijd van 50 jaar zouden deze vrouwen gewoon kunnen deelnemen aan het 2-jaarlijks bevolkingsonderzoek. Vrouwen daarentegen met een sterk verhoogd familiaal risico raadt men aan vanaf de leeftijd van 30 jaar of 5 jaar voor de leeftijd van het eerst gediagnosticeerde familielid een magnetisch resonantie beeldvormingsonderzoek (MRI) te laten uitvoeren gecombineerd met een mammografie. MRI maakt in tegenstelling tot mammografie gebruik van radiofrequente pulsen. Het heeft een grotere gevoeligheid dan mammografie voor het opsporen van invasieve borstkankers in bijna alle leeftijdsgroepen van personen die drager zijn van de borstkanker predispositiegenen 1 (BRCA1) en/of 2 (BRCA2) [23]. MRI vormt dus een ideaal beeldvormingsalternatief voor vrouwen met een verhoogd risico [22, 24]. Echografie daarentegen maakt gebruik van geluidsgolven. Dit kan een alternatieve controle bieden voor het screenen van vrouwen met een sterk verhoogd risico, naast mammografie of MRI [22]. 1.4 Ioniserende straling (IR) Er wordt een onderscheid gemaakt tussen 2 soorten IR: elektromagnetische straling (EMS) enerzijds en corpusculaire straling anderzijds. EMS waaronder X- en γ-stralen worden het meest gebruikt voor diagnostisch en therapeutische doeleinden zoals voor computed tomografie (CT), conventionele en interventionele radiografie maar ook voor screeningsmammografieën [25]. Tabel 1 geeft de opeenvolgende effecten van ioniserende straling weer. Wanneer IR invalt op weefsels ontstaan er ionisaties en excitaties, die op hun beurt zorgen voor fysico-chemische en chemische interacties. Deze fysico-chemische en chemische interacties kunnen uiteindelijk -7- resulteren in biologische effecten waaronder kanker. De meest voorkomende stralingsgeïnduceerde kanker is leukemie [26]. Tabel 1: Chronologie van stralingseffecten [26]. 1.4.1 Deoxyribonucleïnezuur (DNA) schade geïnduceerd door IR Figuur 5 geeft de verschillende soorten DNA schade weer, die kunnen ontstaan na blootstelling aan IR [27]. Baseschade (mismatch, insertie, deletie), “bulky adducts”, SSB en DSB komen hierbij het meest frequent voor, met een gemiddelde halfwaardetijd voor herstel van 1-5minuten (min) voor baseschade, 5-10min voor SSB en 50min voor DSB [1, 18, 27]. “Bulky adducts” ontstaan voornamelijk door blootstelling aan chemische mutagenen en ultraviolet (UV) straling en worden hersteld via nucleotide excisie repair (NER). Baseschade en SSB worden meestal efficiënt hersteld bij gezonde personen. Bij DSB worden beide strengen van de dubbele helix verbroken waardoor er verlies van informatie optreedt in beide templates. Foutief of nietherstelde DSB kunnen hierdoor aanleiding geven tot celdood, puntmutaties en chromosomale aberraties. Wanneer een puntmutatie voorkomt ter hoogte van een tumor suppressor gen of oncogen kan dit aanleiding geven tot kanker. Over het algemeen zal de schade beperkt worden door het stilleggen van de celcyclus ter hoogte van de celcyclus checkpoints, wanneer schade wordt gedetecteerd. Zo krijgen cellen de tijd om de schade te herstellen vooraleer de celcyclus -8- verder gaat. Wanneer fouten niet kunnen worden hersteld zal de cel in apoptose gaan [1, 18, 25, 28-32]. Figuur 5: Meest voorkomende soorten van DNA schade: SSB, DSB, “bulky adducts” en baseschade (mismatch, insertie, deletie) [27]. 1.4.2 Lineaire energie transfer (LET) De biologische effecten die optreden voor een bepaald type weefsel hebben geen directe link met het gemiddelde aantal ionisaties, maar wel met de lokale ionisatiedichtheid. De gemiddelde ionisatiedichtheid is gerelateerd aan de geabsorbeerde dosis, maar houdt geen rekening met de LET. De lokale ionisatiedichtheid wordt echter wel gelinkt aan de LET [26]. De LET geeft de hoeveelheid energie weer die wordt neergezet, onder de vorm van excitaties en/of ionisaties, per eenheid van afgelegde weg en wordt uitgedrukt in keV/µm [33]. Standaard komt een LET van 250kVp X-stralen overeen met een weglengte van 2keV/ µm. De ionisatiedichtheid is omgekeerd evenredig met de kinetische energie (Ekin) van de fotonen of partikels, waardoor de schade dus het grootst zal zijn net voor het einde van de track, waar de Ekin het kleinst is [34]. IR met een verschillende energie kan dus bij eenzelfde geabsorbeerde stralingsdosis zorgen voor een verschillende ernst van schade [26, 33]. Lage LET straling Lage LET straling, waaronder X-en γ-straling, veroorzaakt random geïsoleerde of verspreide ionisaties ter hoogte van het DNA. De breuken die worden geïnduceerd zijn niet complex en worden meestal enzymatisch hersteld. Op het einde van de track komen wel geclusterde ionisaties voor. De dosis-respons curve, die de relatie tussen de dosis en een biologisch eindpunt weergeeft, vertoont bij lage LET straling een lineair kwadratisch verloop (E=αD+βD2). Hierbij stelt D de dosis voor en E het biologisch effect. De lineaire coëfficiënt α is klein voor lage LET -9- en is onafhankelijk van tijdsfactoren, terwijl de kwadratische coëfficiënt β2 wel afhankelijk is van tijdsfactoren waaronder het dosistempo en/of fractionatie [1, 26, 33]. Hoge LET straling Hoge LET straling daarentegen, waaronder snelle neutronen en alfadeeltjes, heeft een grotere ionisatiedichtheid en wordt gekenmerkt door grote tot zeer grote ionisatieclusters en deltastralen. De schade aan het DNA is hierdoor complexer, moeilijker te herstellen en leidt vaker tot foutief of niet-herstelde DNA breuken. De dosis-respons curve voor hoge LET straling kent een lineair verloop (E=αD), waarbij E eveneens het effect en D de dosis voorstelt. De lineaire component αD is opnieuw onafhankelijk van tijdsfactoren [1, 26, 33]. Figuur 6A en B geeft respectievelijk het ionisatiepatroon van lage en hoge LET straling weer. De zwarte stippen stellen de ionisatietracks voor [26]. A B Figuur 6: Ionisatiedistributie van een medium bestraald met lage LET (A) en hoge LET (B) [26]. 1.4.3 Relatieve biologische effectiviteit (RBE) RBE is de verhouding van de geabsorbeerde dosis van de referentiestraling op de geabsorbeerde dosis van de straling die wordt getest en hetzelfde biologisch effect teweegbrengt in een bepaald type van weefsel voor een bepaald eindpunt. Het is een parameter die toelaat om verschillen in biologische effectiviteit van hoge of lage LET straling weer te geven, op een kwantitatieve manier [26, 33]. Tegenwoordig zijn de risico’s in het lage dosis gebied enerzijds gebaseerd op extrapolaties van data uit de “life span study“. Deze studie is uitgevoerd op overlevenden van Hiroshima en Nagasaki die waren blootgesteld aan hoge energie - 10 - 60 Co γ-stralen (2-5MeV). Anderzijds kunnen de risico’s ook gebaseerd zijn op extrapolaties van andere epidemiologische data, die het effect nagaan van X-stralen met een veel hogere energie dan deze gegeven bij een mammografie. Deze extrapolaties worden gemaakt omdat de sample size te groot zou moeten zijn om risico’s met voldoende statistische power te kunnen schatten in het lage dosisgebied [19, 23, 32, 35]. De validiteit van deze extrapolaties, waarop het linear no treshold (LNT) model is gebaseerd, wordt echter in vraag gesteld door het bystander effect en de adaptieve respons. Het bystander effect veronderstelt dat bestraalde cellen signalen doorgeven aan niet-bestraalde bystander cellen. Men veronderstelt dat dit enerzijds kan gebeuren door het vrijstellen van oplosbare factoren, waaronder stikstofoxide en reactieve zuurstofradicalen, in het medium en/of anderzijds via intercellulaire gap juncties via dewelke signalen worden doorgegeven aan nietbestraalde cellen. Via deze 2 mechanismen zouden ook niet-bestraalde cellen genetische veranderingen ondergaan [32, 36]. De adaptieve respons daarentegen veronderstelt dat cellen die op voorhand zijn blootgesteld aan lage stralingsdosissen meer resistent zullen zijn aan straling wanneer ze hierna worden blootgesteld aan hogere dosissen [37]. Figuur 7 geeft het linear no treshold (LNT) model weer. Dit model is gebaseerd op extrapolaties van data verkregen bij blootstelling aan hoge dosissen en veronderstelt dat alle straling schadelijk is, onafhankelijk van de dosis. Deze veronderstelling komt echter niet overeen met deze van het bystander effect en de adaptieve respons, waar het stralingsrisico bij blootstelling aan lage dosissen respectievelijk hoger of lager zou liggen dan de lineaire respons [37, 38]. 1 2 3 Figuur 7: Weergave van het LNT model: 1. Bystander effect, 2. Lineaire respons (LNT), 3. Adaptieve respons [37]. - 11 - De internationale commissie voor radioprotectie (ICRP) veronderstelt een RBE van 1 voor alle lage LET straling [1, 18, 32, 35]. Hierdoor worden zowel 30kV X- als 60 Co γ-stralen met een respectievelijke energie van 15-20 keV en 1,22 MeV beschouwd als lage LET straling. Echter, uit meerdere studies blijkt dat de RBE voor 30kV X-stralen een waarde van 1 tot 6 zou kunnen benaderen, voor verschillende biologische eindpunten. Op die manier zouden lage energie Xstralen efficiënter geclusterde DNA schade kunnen induceren in vergelijking met hogere energie X-stralen of 60Co γ-stralen [1, 15, 18, 23, 32, 35, 39, 40]. Afhankelijk van de energie van de lage LET straling zouden er dus wel verschillen kunnen zijn in het induceren van DNA schade [1, 18, 32]. Ook het internationale atoomenergie agentschap (IAEA) haalt aan dat X-stralen in het algemeen 2 à 3 keer effectiever dan γ-stralen [41]. 1.4.4 Detectie over inductie ratio (DIR) Wanneer IR wordt gebruikt voor diagnostische of therapeutische doeleinden kunnen deze worden geassocieerd met de inductie van tumoren. Daarom is het van belang de voordelen en risico’s goed in te schatten en tegen elkaar af te wegen [39]. Dit kan worden benaderd door het berekenen van de DIR. De DIR stelt de verhouding voor van het aantal borstkankers die worden gedetecteerd ten opzichte van het aantal borstkankers die worden geïnduceerd door het screenen zelf. Het aantal stralingsgeïnduceerde borstkankers (30kV X-stralen) hangt samen met de RBE, die door het ICRP wordt beschouwd als 1 voor alle lage LET straling (zie 1.4.3). Het aantal gedetecteerde borstkankers moet vanzelfsprekend hoger liggen dan het aantal geïnduceerde borstkankers. Hoeveel hoger dat aantal moet liggen is nog steeds onderwerp van discussie. Een DIR boven de 100, voor vrouwen ouder dan 50 jaar die zich 2-jaarlijks laten screenen, wordt door de meeste internationale screeningsprogramma’s aanvaard [1]. Aangezien de RBE van 30kV X-stralen voor verschillende eindpunten met een factor 1 tot 6 zou kunnen worden onderschat (zie 1.3.4), heeft dit een impact op de DIR. Deze zou op die manier met een factor 1 tot 6 kunnen worden overschat, wat gevolgen heeft voor de rechtvaardiging van de routine screeningsmammografieën. Deze gevolgen zijn voornamelijk van belang voor hoog-risico patiënten met mutaties in onder andere BRCA1 en/of BRCA2, maar ook voor wanneer men zou beslissen de leeftijd voor het starten van de bevolkingsscreening uit te breiden naar 40 jaar of jonger [1, 15, 35]. - 12 - 1.5 Cellulaire respons op DNA schade 1.5.1 Herstelmechanismen voor DNA DSB Het genoom van eukaryoten staat voortdurend onder stress. Deze stress wordt veroorzaakt door zowel endogene (reactieve zuurstof partikels) als exogene factoren (IR). Dit heeft tot gevolg dat het DNA continu wordt beschadigd en deze schade moet worden herkend en hersteld [32]. Per celcyclus worden ongeveer 50 DNA DSB geïnduceerd, dewelke minder complex zijn dan de stralingsgeïnduceerde DSB. Om ervoor te zorgen dat de integriteit van het genoom bewaard blijft, bestaan er daarom verschillende herstelmechanismen en celcyclus checkpoints [42]. Enzymatische herstelmechanismen die fundamenteel zijn voor het herstel van DNA schade zijn homologe recombinatie (HR) en niet homologe endjoining (NHEJ). Deze 2 mechanismen verschillen essentieel in hun accuraatheid voor herstel en noodzaak voor homologie. Wanneer de DNA schade te complex is, kan apoptose optreden [26, 29, 33, 43, 44]. Homologe recombinatie (HR) Voor het herstel van DNA DSB via HR zijn er grote gebieden van homologie nodig vooraleer de breuk accuraat kan worden hersteld. Herstel via HR zal daarom enkel gebeuren in de aanwezigheid van het intacte homoloog chromosoom of het niet-beschadigde zusterchromatide. Het is voornamelijk van belang voor het herstel van DSB bij gisten en bacteriën. Bij dierlijke cellen speelt HR enkel een rol in de late synthese en Gap-2 fase van de celcyclus [31, 32, 45, 46]. Figuur 8A geeft het herstelmechanisme van HR weer [47]. Wanneer een DSB optreedt zal de celcyclus worden stilgelegd door het Ataxia Telangiectasia mutated (ATM) kinase. Vervolgens worden de vrije uiteinden van de DSB opgespoord door het MRE11/RAD50/NBS1 (MRN) eiwitcomplex. Het MRE11 heeft een endonuclease activiteit die 3’ SSB DNA uiteinden vormt. Deze endonuclease activiteit wordt gereguleerd door het CtBP proteïne, dat in normale omstandigheden afhankelijk is van het BRCA1 en het ATM. Hierna worden hSSB1 moleculen aangetrokken, die vervolgens worden verdrongen door het replicatie proteïne A (RPA). Het BRCA1/partner and localizer of BRCA2 (Palb2) complex rekruteert daarna het eiwitcomplex RAD52/BRCA2/RAD51/RAD54 naar de SSB. Op die manier wordt het RPA vervangen door het RAD51, wat zorgt voor stabilisatie van de streng. RAD51 gaat tevens op zoek naar de homologe - 13 - sequentie in het homoloog zusterchromatide en versnelt de invasie zodat een Holliday junction kan gevormd worden. Cohesines helpen het RAD51, door ervoor te zorgen dat de zusterchromatiden voldoende dicht bij elkaar worden gebracht. RAD52 heeft een protectieve functie en bindt direct aan de SSB om exonuclease tegen te gaan. Als laatste zal het DNA polymerase δ zorgen voor de synthese van de ontbrekende DNA moleculen, wordt de Holliday junction afgebroken door resolvasen en worden de DNA uiteinden aan elkaar gezet door ligasen [10, 15, 31, 26, 47]. Niet homologe endjoining (NHEJ) Voor het herstel van DNA DSB via NHEJ is er weinig homologie nodig. Bijgevolg zal het herstel veel sneller, maar minder accuraat gebeuren dan bij HR. Het is het belangrijkste herstelmechanisme voor stralingsgeïnduceerde DNA DSB in dierlijke cellen [44]. Hoewel NHEJ overal actief is in de celcyclus, zal het toch voornamelijk zorgen voor herstel in de Gap 0-, Gap 1- en de vroege synthese fase van de celcyclus. Naast herstel van DSB is het NHEJ ook essentieel voor class-switching tussen immunoglobulines en verantwoordelijk voor de somatische herschikkingen van het TCR-, IGH- en IGL loci bij de ontwikkeling van T-en B cellen [43-46]. Figuur 8B geeft het herstelmechanisme van NHEJ weer [47]. Wanneer een stralingsgeïnduceerde DSB ontstaat, zal binnen enkele seconden (sec) het ringvormig, heterodimeer eiwitcomplex Ku70/80 worden aangetrokken. Vervolgens worden 2 DNA afhankelijke proteïne kinase catalytische subunits (DNA-PKcs) gerekruteerd, elk naar een uiteinde van de DSB, via binding met de carboxy-terminus (C-terminus) van het Ku80. Hierdoor komen de DNA uiteinden dichter bij elkaar en worden de 2 DNA-PKcs geactiveerd. Wanneer deze 2 moleculen worden geactiveerd en de DNA uiteinden dicht genoeg bij elkaar worden gebracht, vindt autofosforylatie en fosforylatie van DNA-PKcs door ATM en ATM rad-3 verwanten (ATR) plaats. Daar stralingsgeïnduceerde DSB vaak fosfaten en fosfoglycolaten aan hun 3’ uiteinden bevatten, is het nodig dat het polynucleotide kinase (PNK), fosfatase en Werner’s syndroom helicase (WRN) worden geactiveerd, vooraleer er DNA ligatie kan plaatsvinden. Andere sleutelmoleculen die van belang zijn voor het herstel via NHEJ zijn het Artemis, het X-straal herstel cross-complementing proteïne 4 (XRCC4) en het DNA ligase IV [47]. Het PNK wordt gefosforyleerd, door een nog - 14 - onbekend kinase, na blootstelling aan IR en is betrokken bij het verwijderen van DNA uiteinden die anders niet opnieuw aan elkaar zouden kunnen worden gezet. Het WRN is een RecQ helicase en zorgt eveneens voor de bewerking van DNA uiteinden, dewelke anders niet aan elkaar kunnen worden gezet. Artemis is een 5’-3’ exonuclease, maar in de aanwezigheid van DNA-PKcs en adenosinetrifosfaat krijgt het een endonuclease activiteit. De aprataxin en PNK-like factor (APLF) heeft eveneens zowel een endo- als exonuclease activiteit. Deze factor wordt gefosforyleerd door het ATM en gaat een reactie met het Ku aan. Algemeen treedt bij knockdown van het PNK, APLF en WRN een verhoogde stralingsgevoeligheid op, worden er minder DSB hersteld en is men bijgevolg gevoeliger voor het ontwikkelen van kanker. Downstream in de cascade van NHEJ zijn het XRCC4 en ligase IV van belang. Het XRCC4 heeft geen enzymatische functie maar wel een α-helicale regio, dewelke bindt met een regio tussen de 2 Cterminale BRCT domeinen van het DNA ligase IV. Hierdoor ontstaat een stabiel complex en kunnen de uiteinden van het DNA aan elkaar worden gezet via het DNA ligase IV [25, 31, 44, 45, 47-50]. - 15 - A B Figuur 8: Herstel van DNA DSB via HR (A) en via NHEJ (B). A. Bij HR wordt de celcyclus stilgelegd door het ATM. Na herkenning van de vrije DNA uiteinden wordt het MRN eiwitcomplex aangetrokken. Dit complex heeft een exonuclease activiteit en zorgt ervoor dat 3’ uiteinden worden vrijgemaakt. Vervolgens wordt naar deze uiteinden het multimeer eiwitcomplex RAD52/BRCA2/RAD51/RAD54 aangetrokken. Het RAD51 zorgt voor invasie van de gebroken streng in het homoloog zusterchromatide zodat een Holliday junction kan gevormd worden. Tenslotte zullen DNA polymerasen zorgen voor de DNA synthese en wordt de DSB hersteld, B. Bij NHEJ wordt het heterodimeer Ku70/80 aangetrokken en worden DNA-PKcs gerekruteerd om de vrije DNA uiteinden te stabiliseren. Verschillende sleuteleiwitten zoals het WRN, APLF, Artemis en PNK spelen een rol bij het bewerken van de DNA uiteinden zodat uiteindelijk door het XRCC4 en DNA ligase IV de breuk kan worden hersteld [47]. - 16 - 1.5.2 Repair kinetiek van DNA DSB Uit analyses van gelelektroferese en γ-H2AX foci testen blijkt dat het herstel van stralingsgeïnduceerde DSB bifasisch verloopt, zowel voor cellen die zich bevinden in de Gap 0-, Gap 1- als in de Gap 2-fase. Hierbij doet een eerste, snelle herstelcomponent zich voor gedurende de eerste 2-3 uur na bestraling en een tweede, tragere herstelcomponent zich voor tot 24 uur na bestraling. Eveneens werd opgemerkt dat DSB in de euchromatische regio's sneller worden hersteld dan DSB in heterochromatische regio's, waarbij bijkomende signalisatie nodig is van onder andere het ATM en 53BP1. Verschillende studies stellen ook vast dat repair via NHEJ de snelle component vertegenwoordigt in de G1-en G2-fase en dat repair via HR de trage component in de G1- en G2-fase vertegenwoordigt. Bijgevolg zal HR voornamelijk gebruikt worden voor het herstel van DSB in de heterochromatine regio's en NHEJ voor het herstel van DSB in de euchromatine regio's. Algemeen werd vastgesteld dat HR en NHEJ eerder zullen samenwerken dan in competitie te treden met elkaar, zodat wanneer een fout optreedt in 1 van de 2 pathways, dit kan gecompenseerd worden door een verhoogde activiteit van de andere pathway [32, 48, 50]. 1.5.3 BRCA1 en BRCA2 BRCA1, gelegen op chromosoom 17q, en BRCA2, gelokaliseerd op chromosoom 13q, zijn belangrijke onderdelen van multimere eiwitcomplexen die worden aangetrokken bij het herstel van DNA DSB [24, 25, 51]. BRCA1 is een zeer groot gen (1863 aminozuren), dat codeert voor verschillende proteïnen. Naast een rol in de repair van DNA DSB, speelt BRCA1 ook een rol bij NER en het controleren van de celcyclus checkpoints [50-52]. Het BRCA2 is een nog groter gen (3418 aminozuren), maar hiervan zijn minder motieven gekend [50]. Wanneer mutaties voorkomen in deze tumor suppressor genen, die zowel instaan voor signalisatie als repair van de DNA schade, leidt dit tot genoominstabiliteit [18]. Dit zorgt voor een grotere gevoeligheid aan straling, maar ook aan cytostatica en geeft bijgevolg aanleiding tot een verhoogde kankerpredispositie [53]. Ongeveer 5% van alle borstkankers ontstaan door mutaties in de autosomaal dominante BRCA1 en/of BRCA2 genen [17]. Vrouwen met een BRCA1 en/of BRCA2 mutatie hebben respectievelijk 60-80% kans en 50-70% kans om borstkanker te ontwikkelen voor de leeftijd van 70 jaar. Mannen met een BRCA1 en/of BRCA2 mutatie hebben respectievelijk 1-5% kans en 5-10% kans om borstkanker te ontwikkelen voor de leeftijd van 70 - 17 - jaar [24, 25, 51]. Vrouwen die drager zijn van een BRCA1 en/of BRCA2 mutatie lopen eveneens een groter risico op het ontwikkelen van ovariumkanker (20-45% BRCA1, 10-20% BRCA2) en vrouwelijke dragers van een BRCA1 mutatie lopen eveneens voor de leeftijd van 50 jaar een verhoogd risico op colonkanker [54]. Mannen met een BRCA2 mutatie hebben 25% meer kans op de ontwikkeling van prostaatkanker. Tot slot lopen zowel mannelijke als vrouwelijke dragers met een BRCA1 en/of BRCA2 mutatie een beperkt risico op pancreaskanker (2-3% BRCA1, 35% BRCA2) [24, 25, 50, 51]. Het is moeilijk om vrouwen met een verhoogd risico op borst-of ovarium kanker te detecteren omdat enerzijds het verlies van 1 functionerend kopie van BRCA1 en/of BRCA2 klinisch niet uitgesproken is en anderzijds de huidige tools die testen op haploïnsufficiëntie niet precies genoeg zijn om mutaties direct op te sporen aan de hand van perifere bloed lymfocyten (PBL). Daarom zullen personen die familiaal belast zijn meestal geïdentificeerd worden wanneer zijzelf of een familielid een typische kanker ontwikkelen [51]. Bij niet-familiale, sporadische vormen van borstkanker zijn er geen mutaties aanwezig in de BRCA1 en/of BRCA2 borstkanker predispositie genen [25]. Het BRCA1 proteïne bevat een RING domein, gelegen aan de aminoterminus, dat sterk geconserveerd is en een coiled-coil domein + tandem BRCT, gelegen aan de C-terminus. Deze domeinen zijn essentieel voor herstel via HR en signalisatie van DNA schade. Onder normale omstandigheden komt het BRCA1 voor als heterodimeer met een ander RING/BRCT domein bevattend proteïne, het BRCA1 geassocieerd RING domein proteïne 1 (BARD1). Wanneer het BARD1 echter niet aanwezig is, wordt het BRCA1 onstabiel en snel gedegradeerd. Tevens kan het BRCA1 zijn functie als herstelmechanisme slechts uitoefenen wanneer het in staat is om chromatine domeinen met DSB te herkennen. Hiervoor zijn de BRCT herhalingen essentieel [5052]. Wanneer IR DNA DSB induceert, vormt het heterodimeer complex BRCA1/BARD1 een aantal proteïne supercomplexen, waaronder het BRCA1/C-terminaal bindingsproteïne interactie proteïne/MRN complex. Deze werken samen om SSB te initialiseren aan DSB uiteinden. BRCA1, via Palb2 gekoppeld aan BRCA2, is eveneens nodig voor het rekruteren van het RAD51 - 18 - en het genereren van het RAD51 nucleoproteïne filament. Echter, wanneer een mutatie voorkomt in het BRCA1, kan het PALB2 niet binden aan het BRCA1, waardoor het herstel via HR niet kan doorgaan [50, 51]. BRCA1 zou eveneens betrokken zijn bij herstel via NHEJ, voornamelijk tijdens de complexvorming van het Ku70/80 en/of tijdens de complexvorming van XRCC4/ligase IV. Hierover is men echter nog niet zeker, verder onderzoek is aangewezen [50]. BRCA2 bevat 8 BRCT herhalingen die elk een RAD51 kunnen binden en staat eveneens in voor het herstel van DNA schade, voornamelijk via HR. Wanneer het BRCA2 gemuteerd is, zal geen RAD 51 worden aangetrokken naar het beschadigde DNA en bijgevolg de HR gecompromitteerd worden [50]. 1.5.4 γ-H2AX foci test De γ-H2AX foci test is een zeer specifieke en gevoelige biomerker die toelaat om DNA DSB, zowel in vitro als in vivo, te detecteren en te kwantificeren in het zeer lage dosisgebied, zoals gegeven bij een mammografie [18, 32, 55]. Het humane DNA is georganiseerd in een compacte structuur zodat het zou passen in de kern van de cel. Het windt zich op rond acht histoneiwitten (= nucleosomen), die op hun beurt verder condenseren met vorming van het chromatine. Een nucleosoom bestaat uit 8 histoneiwitten, 2 van elk van de 4 histoneiwit families (H4, H3, H2B en H2A) [56]. Als cellulaire respons op een stralingsgeïnduceerde DSB bindt het MRN eiwitcomplex aan beide uiteinden van de breuk (zie 1.4.1). Het MRN eiwitcomplex rekruteert het wild-type ATM [57]. De 3 leden van de fosfatidylinositol 3-kinase like kinase familie (PI3KK), zijnde DNA-PK, ATM en ATR staan in voor de fosforylatie van het sterk geconserveerde serine 139, ter hoogte van de C-terminus van het nucleosomaal histon proteïne H2AX. Dit histon wordt na fosforylatie ɣH2AX genoemd [56-59]. Vorming van deze γ-H2AX foci vindt plaats binnen de eerste sec en bereikt een maximum na 15-30min postbestralingstijd [32, 56, 59]. Dit geeft aanleiding tot het rekruteren van het MDC1 en zorgt voor verdere signalisatie. Vervolgens kunnen via het MDC1 MRN eiwitten worden aangetrokken en gebonden aan het DNA. Via deze interacties wordt er in beide richtingen van de breuk meer MRN en ATM aangetrokken en gebonden, zodat de naburige H2AX-histonen ook worden gefosforyleerd. Rond de DSB worden op die manier 1000’en H2AX-histonen gefosforyleerd, met ongeveer een omvang van 2 megabaseparen, die samen 1 - 19 - focus vormen [32, 58, 59]. Er is bewijs dat 1 γ-H2AX focus kwantitatief overeenkomt met 1 DNA DSB in niet-delende cellen [32, 60]. Figuur 9 geeft de MDC1 gereguleerde H2AX fosforylatie weer [57]. Figuur 9: MDC1 gereguleerde H2AX fosforylatie [57]. Meerdere studies onderzochten reeds het effect van straling in het lage dosis gebied aan de hand van de γ-H2AX foci test. Deze onderzoeken werden voornamelijk uitgevoerd op cellen waaronder PBL, humane fibroblasten en geïsoleerde epitheelcellen van de borst [1, 18, 32, 36, 61]. De γ-H2AX foci test wordt eveneens gebruikt om de repair kinetiek van DNA DSB na te gaan. Residuele DSB die overblijven na 24 uur geven immers een idee over het aantal resterende, nog niet-herstelde DSB [18, 32, 38]. 1.6 Doelstelling Het doel van dit onderzoek is nagaan of een dosis van enkele mGy, zoals gegeven bij een mammografie, resulteert in waarneembare stralingsgeïnduceerde ɣ-H2AX foci in gezond borstweefsel. Het aantal foci geïnduceerd door 30kV X-stralen zal vergeleken worden met het aantal geïnduceerd door 60 Co γ-stralen (referentie). Aan de hand van deze resultaten kan een dosis-respons curve worden opgesteld, wat toelaat om de RBE te berekenen. De repair kinetiek zal eveneens worden onderzocht na bestraling met 4 en 40mGy en een postbestralingstijd van 30min en 24uur, voor beide stralingskwaliteiten. Om het aantal DNA DSB te kwantificeren zal - 20 - gebruik gemaakt worden van de zeer gevoelige en specifieke ɣ-H2AX foci test. In dit onderzoek wordt gewerkt met vers gedisseceerd borstweefsel, in tegenstelling tot voorgaande studies die gebruik maakten van cellen of cellijnen [1, 18, 32, 36, 39]. Bijgevolg zou deze studie moeten leiden tot een betere risico-inschatting voor het gebruik van 30kV X-stralen. 2. Materialen en Methoden 2.1 Onderzoekspopulatie Deze studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van het UZ Gent en uitgevoerd op gezond borstweefsel. Dit gezond borstweefsel is afkomstig van vrouwen die 1. een borstreductie lieten uitvoeren, 2. preventief een mastectomie lieten uitvoeren omdat ze asymptomatisch drager zijn van een BRCA1 of BRCA2 mutatie of omdat ze familiaal belast zijn, 3. een mastectomie lieten uitvoeren omdat borstkanker werd vastgesteld. Om dit weefsel te mogen gebruiken voor onderzoek werd een informed consent van alle patiënten verkregen, nadat aan hen de volledige opzet van de studie werd medegedeeld. Uit het verkregen borstweefsel werd het overtollige vetweefsel verwijderd, zodat overwegend bindweefsel met daarin klierweefsel overbleef. Het versnijden van het weefsel, met pincet en schaar, gebeurt in een petrischaal (Greiner bio-one, Wemmel, België), waarbij het borstweefsel vochtig wordt gehouden met een ringer oplossing (kamertemperatuur). In bijlage 1 wordt de samenstelling van ringer weergegeven. Het fibroglandulair weefsel wordt na het snijden in 6 well-platen (Greiner bio-one) gelegd. De 6 wellplaten worden gevuld met voorverwarmd medium (37°C), dat gebruikt wordt voor culturen van humane borstepitheel cellijnen (MCF10A), tot 2 mm laagdikte. In bijlage 2 wordt de samenstelling van het medium weergegeven. Aanvankelijk zou de McIlwain tissue chopper (Goose Green, United Kingdom) of de Microm vibratoom (Walldorf, Duitsland) worden gebruikt om uniforme weefselstukken van 1 à 2 mm te kunnen snijden. Figuren 10 en 11 geven deze snijtoestellen respectievelijk weer. Deze werden op voorhand uitgetest op nier- en leverweefsel van de muis en leverden mooie sneden op. Wanneer deze toestellen echter gebruikt werden voor het snijden van borstweefsel bleek het fibroglandulair weefsel een te rigide structuur te hebben om in uniforme sneden te kunnen - 21 - snijden. Daarom werd er beslist om het weefsel met een pincet en schaar in plakken te snijden van maximaal 2 mm dik. Figuur 10: Chopper. Figuur 11: Vibratoom. 2.2 Bestraling + incubatie De borstweefselsneden van 2mm (in medium, in 6-well plaat) werden in vitro bestraald in het INW, Instituut voor Nucleaire Wetenschappen (Prof. H. Thierens). De bestraling gebeurde met een Siemens Mammomat3 mammograaf (Siemens, Brussel, België) en een 60 Co-bron als referentie. De dosissen waarmee het borstweefsel werd bestraald zijn 0; 2; 2+2; 4; 10; 20; 40-en 100mGy, zodat een representatieve dosis-respons curve kan worden opgesteld in het lage dosis gebied. De 60 Co-γ stralen werden toegediend aan een dosistempo van 0,00484 Gy/min in een voorverwarmd waterbad (37°C). De mammograaf produceerde een 30 kV Mo/Mo X-straal spectrum aan een dosistempo van 0.125 Gy/min en werd uitgevoerd in een voorverwarmde polymethylmethacrylaat bak (PMMA, 37°C). Tabel 2 geeft de ingestelde parameters weer. Na het in vitro bestralen, zowel met 60 Co bron als met de mammograaf, werden alle borstweefselsneden gedurende 30min geïncubeerd in een CO2 incubator (Thermo Scientific, 5%CO2, 37°C). Na 30min incubatie werden de bestraalde sneden in een 6 well-plaat (Greiner bio-one) gelegd, gevuld met koude ringer en op ijs geplaatst om het DNA herstel proces te stoppen [1]. De sneden die bestraald werden met 4 en 40mGy, evenals de controle stalen van 0mGy, werden naast 30min ook nog 24uur geïncubeerd. Na 24uur werden deze stalen eveneens - 22 - in 6-well platen (Greiner bio-one) overgebracht, gevuld met koude ringer en op ijs geplaatst gedurende 10min. Op die manier krijgen de cellen de tijd om de stralingsschade zoveel mogelijk te herstellen en kan de repair kinetiek worden onderzocht. Tabel 2: Parameters Siemens Mammomat 3 mammograaf. Dosis kV mAs Samenstelling (mGy) 0 0 0 / 2 30 7 5+2 4 30 14 10+4 10 30 35 25+10 20 30 69 45+22+2 40 30 138 110+28 100 30 346 250+80+16 2.3 Fixatie Fixeren van het borstweefsel is nodig om dynamische processen in de cel stil te leggen en zoveel mogelijk de oorspronkelijke morfologie te bewaren. De coupes worden hiervoor 24 uur op 4°C in 4% neutraal gebufferde formol (NGF) gebracht. De samenstelling van het 4% NGF wordt weergegeven in bijlage 3. 2.4 Inbedden + weefselcoupes snijden Na het fixeren van het borstweefsel volgt het inbedden in paraffine (Thermo Scientific, Aalst, België). Vooraleer er kan worden ingebed in paraffine is het nodig dat het weefsel wordt ontwaterd, via een stijgende alcoholreeks. Omdat alcohol niet oplosbaar is in paraffine worden de weefselstukken geïncubeerd in achtereenvolgens: isopropyl alcohol, isopropyl alcohol/toluol en als laatste in toluol. Bijlage 4 geeft het protocol weer dat gebruikt werd voor de manuele inbedding. Na overnachting van het weefsel in de paraffinecups worden de borstweefselstukken georiënteerd en gedurende 2uur in de koelkast geplaatst (4°C). Dit is nodig om de paraffine voldoende te laten uitharden. Hierna wordt het weefsel ingebed in paraffine uit de cups gehaald, op houten blokken gezet en opnieuw gedurende 2uur in de koelkast geplaatst. Vervolgens worden coupes van 5µm gesneden. - 23 - 2.5 γ-H2AX foci test De ɣ-H2AX foci test is een zeer gevoelige, specifieke moleculaire test die het toelaat om DNA DSB te kwantificeren bij lage stralingsdosissen [1].Op basis van de bekomen resultaten van de ɣH2AX foci test kan een dosis-respons curve worden opgesteld voor 30kV X-en 60 Co γ-stralen, waaruit de RBE kan worden berekend. Er zal in deze studie ook onderzocht worden vanaf welke dosis ɣ-H2AX foci te zien zijn (drempeldosis) en hoe het herstel van DNA DSB verloopt na 24 uur. 2.5.1 Haematoxyline-eosine (HE) kleuring Alvorens een γ-H2AX foci kleuring uit te voeren, wordt eerst een standaard haematoxyline (1/4 mayer, VWR®) eosine-pfloxine (Thermo Scientific) kleuring uitgevoerd. Op die manier kan worden nagegaan of er voldoende klierbuizen in de coupes aanwezig zijn en een γ-H2AX foci kleuring zinvol is. Bijlage 5 geeft het HE protocol van het kleurtoestel Microm HMS 740 weer. 2.5.2 Immunohistochemische kleuring Immuno-enzymatische kleuring De 2 meest gebruikte methodes om antigen - antilichaam complexen te visualiseren zijn immunofluorescente en immuno-enzymatische kleuringen. Meerdere onderzoeks-protocollen, zowel immuno- fluorescente als immuno-enzymatische, werden uitgetest op coupes van staal 01 (10/05/2012, gezond weefsel), met als doel een geoptimaliseerd protocol te bekomen. Optimalisatie anti ɣ-H2AX antilichaam protocol Tijdens de onderzoeksstage en gedurende het thesisjaar werden verschillende zaken om de indirecte, enzymatische immunohistochemische kleuring te optimaliseren, uitgetest. Verschillende verdunningen werden uitgeprobeerd voor het muis anti-γ-H2AX antilichaam (613401, Biolegend, Erembodegem, België) namelijk 1:1000, 1:500 en 1:200. Meerdere tegenkleuringen met onder andere haematoxyline (1.09249, VWR®), toluïdine blauw (34187.185, VWR®), methylgroen (1.0314, VWR®) en lichtgroen (L-5382, Sigma-Aldrich®) werden - 24 - eveneens uitgetest. Als kleurloos chromogeen substraat werden het 3,3'-diaminobenzidine (DAB, D5637, Sigma-Aldrich®) en het DAB-Nickel(II)chloride hexahydraat (NiCl2, Merck, Darmstadt, Duitsland) uitgetest. Voor het DAB werden incubatietijden van 5 en 10min uitgetest. Het geoptimaliseerde protocol zoals gebruikt in dit onderzoek: 1. Deparaffineren van de coupes met het kleurtoestel Microm HMS 740 (Robot-Stainer, Walldorf, Duitsland) en afgrenzen van de weefselcoupes met een Dako pen (Dako, Heverlee, België). Bijlage 6 geeft het protocol voor het deparaffineren van het kleurtoestel Microm HMS 740 weer. 2. Immunohistochemische kleuring: • Voorbehandeling van de coupes, in het donker, met 3% H2O2 (1.06172, VWR®), gedurende 10min. • Toevoegen van 100µl blokkingsserum (BS) op de coupes, gedurende 30 min op kamertemperatuur. Tabel 3 geeft de samenstelling van het BS weer. • 1ste stap. Aanbrengen van 100µl muis anti-γ-H2AX antilichaam, 1:500 verdund in verdunningsbuffer (VB), gedurende 2uur op kamertemperatuur. Hierna worden de coupes 2 keer gewassen met een fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), telkens 5min. De VB bestaat uit 9 delen PBS en 1 deel BS. Tabel 3 geeft de samenstelling van het PBS weer. • 2de stap. Aanbrengen van 100µl gebiotinyleerd rabbit anti-muis antilichaam (biot-RAM, E0413, Dako), 1:200 verdund in VB, gedurende 30min op kamertemperatuur. Hierna worden de coupes opnieuw 2 keer gewassen met PBS, telkens 5min. • 3de stap. Aanbrengen van 100µl streptavidine-horse radish peroxidase (strep-HRP, P0397, Dako), 1:200 verdund in PBS. Dit ook 30min laten incuberen op kamertemperatuur. Daarna 3 keer wassen met PBS, telkens 5min. • Aanbrengen van 100µl DAB-NiCl2, gedurende 10min op kamertemperatuur in het donker, 10min spoelen met stromend leidingwater, 2 à 3 min spoelen met gedestilleerd water. Tabel 3 geeft de samenstelling van de stock-en werkoplossing van het DAB en het NiCl2 weer. - 25 - 3. Tegenkleuring van de paraffine coupes gebeurt met toluïdine blauw (VWR®, 0,5%+1% ijsazijn (Chemlab), gedurende 10sec. Hierna wordt 2 keer 30sec gespoeld in gedestilleerd water. 4. Manueel ontwateren van de coupes in een stijgende alcoholreeks (70%, 2 keer 96%) en eindigen in toluol (telkens 2min). Bijlage 4 geeft de firma en het catalogusnummer van deze producten weer. Na het ontwateren wordt er op de coupes mounting media (Thermo Scientific) aangebracht en worden ze afgedekt met een dekglas (knittel glass, Duitsland). Tabel 3: Samenstelling 1l PBS, BS en DAB/ NiCl2 stock-en werkoplossing. Producten Firma Catalogusnummer Hoeveelheid PBS (pH: 7,2) Natriumwaterstoffosfaat (Na2HPO4) VWR® 1.06580 1,780 g Kaliumwaterstoffosfaat (KH2PO4) VWR® 1.04873 0,420 g Natriumchloride (NaCl) Sigma-Aldrich® S-9888 7,200 g Gedestilleerd water / / 1,000 l PBS (PH:7,2) UGent Zie boven 0,005 l Roche diagnostics (Vilvoorde, België) 10 735 086 001 BSA NRS DAKO X0902 250,0 x10^-6 l VWR 161-0781 100,0 x10^-6 l DAB Sigma-Aldrich® D5637 0,025 g Gedestilleerd H2O / / 0,001 l NiCl2 VWR® 1.06717 4,000 g Gedestilleerd H2O / / 0,050 l DAB Sigma-Aldrich® D5637 200,0 x10^-6 l PBS (PH:7,2) Zie boven BS Tween 20 (10%) ® 0,050 g DAB (stockoplossing) NiCl2 (stockoplossing) DAB- NiCl2 (werkoplossing) NiCl2 H2O2 (30%) Zie boven 0,010 l ® 1.06717 50,00 x10^-6 l ® 1.06172 4,170 x10^-6 l VWR VWR - 26 - 2.5.3 Visualisatie en analyse van de γ-H2AX foci De γ-H2AX foci worden lichtmicroscopisch geëvalueerd (Leica LEITZ-DMRB, Diegem, België), bij een vergroting van 63X. Door optimalisatie van het immunohistochemisch kleuringsprotocol werd een minimum aan achtergrond verkregen, zodat de foci zo duidelijk mogelijk kunnen worden gevisualiseerd. Het gemiddelde aantal foci/cel is immers een belangrijke maat om stralingsschade op te meten. De foci worden enkel in de luminaire epitheelcellen van de TDLU’s gescoord, aangezien deze het meest betrokken zijn bij het ontstaan van borstkanker [13]. Om een objectieve telling uit te voeren, worden de coupes gecodeerd en wordt de scoring uitgevoerd door 2 personen. Per coupe worden de γ-H2AX foci gescoord in gemiddeld 4 klierbuisgroepen zodat ongeveer 200cellen/coupe/scorer en dus ongeveer 400 cellen/slide in het totaal worden geteld (figuur 12). Slide Coupe 1 1 200 Coupe 2 200 Figuur 12: Per coupe worden γ-H2AX foci gescoord in 200 luminaire epitheelcellen, verdeeld over 4 klierbuisgroepen, door 1 scorer. 3. Resultaten 3.1 HE kleuring Figuur 13 geeft een HE kleuring weer, uitgevoerd op borstweefsel van staal 01. Er wordt een overzicht weergegeven van TDLU’s met hun verschillende onderdelen. De TLDU’s zijn gelegen in losmazig lobulair bindweefsel. Verder worden ook acini of terminale ductuli en een lobaire ductus weergegeven. Rondom de TLDU’s wordt dens lobair bindweefsel aangetroffen. De celkernen van de TDLU’s kleuren blauw-paars aan en het cytoplasma roze. - 27 - 4 3 2 1 Figuur 13: HE kleuring. Vergroting 10X, schaal -100µm. 1. Losmazig lobulair bindweefsel, 2. Acini of terminale ductuli, 3. Lobaire ductus, 4. Dens lobair bindweefsel. 3.2 Optimalisatie van het protocol voor de γ-H2AX foci analyse Verdunningen Voor de γ-H2AX immunohistochemische kleuring werden verschillende verdunningen (1:200, 1:500, 1:1000) van het anti-γ-H2AX antilichaam uitgetest op coupes van staal 01. Dit staal werd voorafgaand bestraald met 50mGy 30kV X-stralen en er werd een immunohistochemische kleuring, met DAB en haematoxyline als tegenkleuring, op uitgevoerd. Bij een verdunning van 1:1000 is er bijna geen kleuring van het antigen γ-H2AX (figuur 14C). Er blijkt geen zichtbaar verschil te zijn tussen verdunning 1:200 (figuur 14A) en 1:500 (figuur 14B). Om deze reden wordt in dit onderzoek voor de verdunning 1:500 gekozen, waarbij er minder kans is op aspecifieke binding en hierdoor resulteert in een optimale specifieke kleuring met de laagste achtergrond (figuur 14B). - 28 - A B C D Figuur 14: ɣ-H2AX foci kleuring (DAB + H). Vergroting 60X, schaal - 10µm. A. Verdunning 1:200, B. Verdunning 1:500, C. Verdunning 1:1000, D. Negatieve controle. Chromogeen substraat Chromogenen zijn stoffen die door een specifiek enzym kunnen worden omgezet in een gekleurde verbinding [62]. De immuno-enzymatische reactie in dit onderzoekt verloopt als volgt: Kleurloos chromogeen (DAB) + substraat (H2O2) + enzym (horse radish peroxidase) => horse radish peroxidase + 2H2O + geoxideerd DAB (bruine neerslag, onoplosbaar in alcohol) Het resultaat van deze immunohistochemische kleuring zijn bruine, niet scherp afgelijnde foci die soms moeilijk te onderscheiden zijn van de achtergrond. Het DAB werd zowel 10 als 5min geïncubeerd, waarbij 10min incubatie het beste resultaat gaf. Figuur 15A geeft een DAB - 29 - immunohistochemische kleuring weer, uitgevoerd op staal 01. Om de intensiteit van het DAB signaal te versterken, werd in dit onderzoek het DAB gekoppeld aan NiCl2. Het NiCl2 bindt aan het DAB en zorgt voor een zwarte kleur, waardoor foci niet langer als bruine, onduidelijke stippen worden waargenomen maar wel als zwarte, duidelijker afgelijnde stippen. Figuur 15B geeft een DAB-NiCl2 immunohistochemische kleuring weer, eveneens uitgevoerd op staal 01. In beide kleuringen werd toluïdine blauw gebruikt als tegenkleuring. A B Figuur 15: ɣ-H2AX foci kleuring (toluïdine blauw). Vergroting 60X, schaal - 10µm. A. DAB, B. DAB-NiCl2. Tegenkleuringen Verschillende tegenkleuringen werden uitgetest om een zo duidelijk mogelijk onderscheid te kunnen maken tussen de kern en het cytoplasma van de epitheliale cellen, aangezien de foci voorkomen in het DNA van de celkern. De kernen mogen eveneens niet te donker aankleuren. Het tegenkleuren van de paraffine coupes van staal 01 is gebeurd met onder andere haematoxyline, lichtgroen, methylgroen en toluïdine blauw. De tegenkleuring met lichtgroen kleurt zowel de kern als het cytoplasma van de cellen zeer licht aan en is bijgevolg geen optie om te gebruiken als tegenkleuring (figuur 16A). Tegenkleuren met methylgroen zorgt voor intense, groene celkernen (figuur 16B). Haematoxyline aan de andere kant, toont donkere, blauwe celkernen (figuur 16C). Aangezien toluïdine blauw zorgt voor mooi afgelijnde, duidelijke en niet te donkere celkernen werd dit in deze studie gekozen als tegenkleuring (figuur 16D). - 30 - A B C D Figuur 16: Tegenkleuringen. Vergroting 60X, schaal - 10µm. A. Lichtgroen, B. Methylgroen, C. Haematoxyline, D. Toluïdine blauw. Geoptimaliseerd γ-H2AX immunohistochemisch kleuringsprotocol Enkel de coupes waarop de immunohistochemische kleuring optimaal gelukt was en waar de γH2AX foci duidelijk zichtbaar waren, werden foci geteld. Figuur 17A en B geven respectievelijk een negatieve controle en een coupe bestraald met 100mGy 30kV X-stralen weer. Deze immunohistochemische kleuringen met DAB-NiCl2 werden uitgevoerd op staal 2 (19/11/2013, familiale belasting), waarbij toluïdine blauw werd gebruikt als tegenkleuring. - 31 - A B Figuur 17: ɣ-H2AX foci kleuring (DAB-NiCl2,toluïdine blauw). Vergroting 60X, schaal - 10µm. A. Negatieve controle, B. 100mGy. 3.3 Dosis-respons curve Tabel 4 geeft een overzicht van de verkregen stalen tijdens dit onderzoek en toont ook welke types van bestraling er op de verschillende stalen werd uitgevoerd. In het totaal werden tijdens deze masterpoef 8 gezonde stalen verkregen, waarvan 3 stalen afkomstig van vrouwen die een borstverkleining lieten uitvoeren (G), 2 stalen afkomstig van vrouwen die asymptomatisch drager waren van een BRCA1 of BRCA2 mutatie (M), 1 staal afkomstig van een vrouw met familiale belasting (B) en 2 stalen afkomstig van vrouwen met borstkanker (K). In staal 1 en 7 werden geen klierbuizen aangetroffen na het uitvoeren van een HE kleuring. Op deze stalen werd daarom geen γ-H2AX foci test uitgevoerd. Tabel 4: Donoren en bestralingstype. 60 Co γ 30kV X Stalen Staal 1 (18/11/2013) / M Staal 2 (19/11/2013) / B Staal 3 (26/11/2013) / K Staal 4 (06/12/2013) / G Staal 5 (19/12/2013) / G Staal 6 (24/02/2014) / M Staal 7 (27/03/2014) / K Staal 8 (10/04/2014) / G ɣ-H2AX x x x x x x x x x x x x - 32 - Tabel 5A en B geeft het gemiddelde aantal foci/cel weer na 30min incubatie, voor respectievelijk 60 Co γ- en 30kV X-stralen. Sham bestraalde stalen werden eveneens meegenomen. In de tabel wordt het gemiddelde van de tellingen weergegeven, uitgevoerd door de 2 scorers, waarbij in totaal ongeveer 400 cellen per coupe werden geanalyseerd (zie 2.5.3). Echter, door een tekort aan fibroglandulair weefsel in de stalen en/of het feit dat er voor de bestraling niet kan worden bepaald of klierweefsel in het bindweefsel aanwezig is, kan voor sommige dosissen en/of stralingskwaliteit geen waarde in de tabel worden ingevuld. Tabel 5: Het gemiddelde aantal geïnduceerde foci/ cel na 30min incubatie. A. 60Co γ-stralen, B. 30kV X-stralen. Sham bestraalde stalen werden eveneens in rekening gebracht. A Borstkanker Gezond Gezond Gezond Belasting BRCA1/2 60 Staal 3 Staal 4 Staal 5 Staal 8 Staal 2 Staal 6 Co γ (mGy) 0,18 0,25 0,34 0 0,23 2 0,31 0,35 2+2 0,40 0,31 0,14 4 0,21 0,41 0,27 10 0,42 0,55 0,29 20 0,26 0,82 0,7 40 1,33 100 B 30kV X (mGy) 0 2 2+2 4 10 20 40 100 Borstkanker Staal 3 Gezond Staal 4 Gezond Staal 5 Gezond Staal 8 Belasting Staal 2 0,14 0,11 0,35 0,17 BRCA1/2 Staal 6 0,066 0,075 0,33 0,44 0,71 0,46 0,39 0,62 1,2 1,35 0,32 0,61 0,80 0,75 1,12 Figuur 18 geeft de dosis-respons weer van het aantal stralingsgeïnduceerde γ-H2AX foci voor 60 Co γ- en 30 kV X-stralen, na 30min incubatie. Het aantal stralingsgeïnduceerde foci wordt bepaald door de foci gescoord in de niet-bestraalde stalen te verminderen met het aantal foci gescoord in de bestraalde stalen. Resultaten van alle donoren werden samengevoegd (G, M, B, K), aangezien na 30min incubatie geen verschil in het aantal stralingsgeïnduceerde DSB wordt - 33 - verwacht tussen de stalen. Figuur 19 geeft de dosis-respons curven van de γ-H2AX foci weer voor 30kV X- en 60Co γ-stralen in het lage dosis gebied (0-10mGy), na 30min incubatie. Lineaire regressies werden gefit door de datapunten, dewelke opnieuw zijn uitgemiddeld over alle stalen. 1,2 60 Co y-rays (unfrac) Co y-rays (frac) 30 kV X-rays (unfrac) 30 kV X-rays (frac) 60 1,0 nbr of rad ind foci 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0 20 40 60 80 100 120 dose (mGy) -0,2 Figuur 18: Dosis-respons (met lineaire curve, ‘to guide the eye’) van het gemiddelde aantal stralingsgeïnduceerde γH2AX foci voor 60Co γ- en 30kV X-stralen, na 30min incubatie. Zowel de gefractioneerde (2+2mGy) als de nietgefractioneerde datapunten voor 60Co γ- en 30kV X-stralen worden weergegeven. 0,3 nbr of rad ind foci 0,2 0,1 0,0 0 2 4 6 8 10 12 dose (mGy) -0,1 60 Co y-rays (unfrac) Co y-rays (frac) 30kV X-rays (unfrac) 30kV X-rays (frac) 60 -0,2 Figuur 19: Gefitte dosis-responscurven van het gemiddelde aantal stralingsgeïnduceerde γ-H2AX foci voor 60Co γen 30kV X-stralen, na 30min incubatie, in het lage dosis gebied (0-10mGy). Zowel de gefractioneerde (2+2my) als niet-gefractioneerde datapunten voor 60Co γ- en 30kV X-stralen worden weergegeven. - 34 - Er wordt een hogere dosis-respons waargenomen bij 30kV X- dan bij 60 Co γ-stralen, uitgezonderd bij 20 en 100mGy 30kV X-stralen (figuur 18). Een negatief aantal foci wordt waargenomen bij 2mGy 30kV X-stralen (figuur 18, 19). In het lage dosis gebied van 0-10mGy wordt een sterkere stijging van aantal γ-H2AX foci waargenomen (hypersensitiviteit = supralineariteit). Dit is meer uitgesproken voor 30kV X- dan voor 60Co γ-stralen (figuur 18, 19). Uit de lineaire regressies, gefit door de datapunten van figuur 19, werd een RBE van 2,34 bekomen voor de γ-H2AX foci in het lage dosis-gebied (0-10mGy). Voor dosissen vanaf 20mGy wordt een vergelijkbare lineaire respons, met lagere helling, vastgesteld voor 30kV X- en 60 Co γ-stralen (figuur 18). Bij een gefractioneerde blootstelling (2+2mGy) aan 30kV X- of 60Co γ-stralen wordt een hoger aantal foci waargenomen dan bij een enkelvoudige blootstelling aan 2 of 4mGy (figuur 18, 19). 3.4 Repair kinetiek Tabel 6 geeft een overzicht weer van de stalen (niet-mutatiedragers) waarop de repair kinetiek werd onderzocht. Het eventuele verschil in repair van DNA DSB geïnduceerd door 30kV X- en 60 Co γ-stralen werd geanalyseerd voor een stralingsdosis van 4 en 40mGy en een postbestralingstijd van 30min en 24uur. Voor sham bestraalde stalen werd het gemiddelde (µ) genomen van 30kV X- en 60 Co γ-stralen. Wegens de reeds aangehaalde oorzaak (zie 3.3) kan voor sommige dosissen en/of stralingskwaliteit geen waarde in de tabel kunnen worden ingevuld. Tabel 6: Het gemiddelde aantal residuele γ-H2AX foci (niet- mutatiedragers) voor 30kV X- en 60Co γ- stralen, bij een stralingsdosis van 4- en 40mGy en een post-bestralingstijd van 24uur. Voor sham bestraalde stalen werd het µ genomen van 30kV X- en 60Co γ-stralen. 60 µ: 60Co ɣ + 30 kV X Co ɣ 30kV X Dosis (mGy) 0 4 40 4 40 Niet-mutatiedragers Staal 3 0,12 0,34 0,43 Staal 4 0,08 0,15 0,23 0,27 Staal 5 0,58 Staal 8 0,17 Figuur 20 geeft de repair kinetiek van de γ-H2AX foci weer voor 60Co γ- en 30kV X-stralen, na een postbestralingstijd van 30min en 24uur. Deze tijden geven respectievelijk het initieel aantal - 35 - stralingsgeïnduceerde en het residueel aantal DSB weer. De repair kinetiek werd enkel onderzocht voor de niet-mutatiedragers, aangezien in dit onderzoek slechts data van 1 mutatiedrager kon worden verkregen. Het aantal geïnduceerde en residuele foci, uitgezet in het histogram, is bijgevolg het gemiddelde van de waarden van de niet-mutatiedragers. 0,7 0.5h inc 24h inc 0,6 nbr of yH2AX foci 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 G/M 0 G_4 G_40 M_4 M_40 Figuur 20: Repair kinetiek (niet-mutatiedragers) van de γ-H2AX foci voor 60Co γ- en 30kV X-stralen, na 30min en 24uur incubatie. Het aantal geïnduceerde γ-H2AX foci daalt na 24 uur zowel voor 60 Co γ- als voor 30kV X- 60 stralen, met uitzondering van 40mGy Co γ-stralen waar een stijging voorkomt. Er wordt tevens een hoger aantal geïnduceerde foci waargenomen bij 4mGy dan bij 40mGy aantal geïnduceerde foci reduceert naar achtergrondwaarden bij 4mGy 60 Co γ-stralen. Het 60 Co γ-stralen. Dit is echter niet het geval bij 4 en 40mGy 30kV X-stralen, waar het aantal residuele γ-H2AX foci na 24 uur boven de achtergrondwaarden blijft en het aantal residuele foci bij 40mGy tevens hoger ligt dan bij 4mGy 30kV X-stralen (figuur 20). 4. Discussie Een groot deel van deze masterproef werd gewijd aan de optimalisatie van de γ-H2AX foci test. Deze test wordt gebruikt om efficiënt DNA DSB op te sporen in borstweefsel. Het is belangrijk om de cellulaire respons op DNA schade te onderzoeken in gezond borstweefsel, voornamelijk in het kader van screeningsmammografieën. In dit onderzoek werd het verschil in biologisch effect - 36 - van 30kV X-stralen ten opzichte van 60Co γ-stralen nagegaan. Er werd hiervoor gebruik gemaakt van gezond borstweefsel afkomstig van vrouwen die 1. een borstreductie lieten uitvoeren, 2. preventief een mastectomie lieten uitvoeren omdat ze asymptomatisch drager zijn van een BRCA1 of BRCA2 mutatie of omdat ze familiaal belast zijn, 3. een mastectomie lieten uitvoeren omdat borstkanker werd vastgesteld. Een dosis-respons curve werd opgesteld voor 30kV X- en 60 Co γ-stralen, wat toelaat om de RBE te berekenen. Deze RBE is belangrijk voor het bepalen van de DIR en de benefit/risk ratio. De repair kinetiek van DNA DSB werd onderzocht bij de niet-mutatiedragers aan de hand van de γ-H2AX foci test. Wegens een te beperkt aantal data in deze studie, werden resultaten samengevoegd. 4.1 Materiaal Een belangrijk probleem dat is gerezen bij het uitvoeren van deze studie, is het verzamelen van voldoende klierweefsel. Wanneer het bindweefsel uit de borstflap wordt gedisseceerd en in 2mm sneden wordt gesneden vooraleer te bestralen, is het onmogelijk om uit te maken of er klierweefsel in het bindweefsel aanwezig zal zijn. Om deze reden gebeurt, alvorens de γ-H2AX foci test wordt uitgevoerd, een HE kleuring op alle coupes zodat een idee kan verkregen worden over de hoeveelheid aanwezige klierbuizen (figuur 13). Aangezien elke snede wordt bestraald met een verschillende dosis en/of verschillende stralingskwaliteit en er tijdens de bestraling niet geweten is of er al dan niet klierweefsel aanwezig is, zal er van sommige dosissen en/of stralingskwaliteit geen resultaat kunnen worden uitgezet in de dosis-respons curve (tabel 5, 6, figuur 18, 19). In de literatuur zijn helaas geen methoden terug te vinden die beschrijven op welke manier er voor het bestralen van de weefselsneden kan worden nagegaan of er al dan niet klierweefsel in het bindweefsel aanwezig is. Daarenboven is er geen informatie over de manier waarop borstweefsel het best gesneden wordt. Dit komt omdat in voorgaande studies voornamelijk werd gefocust op cellen (PBL, geïsoleerde epitheelcellen van de borst, primaire humane fibroblasten) om het effect van lage energie X-stralen na te gaan [1, 18, 32, 61]. In dit onderzoek wordt bevestigd dat oudere patiëntstalen veel minder borstklierweefsel en overwegend vetweefsel bevatten. Dit komt door een verminderde oestrogeen- en progesteronproductie, met als gevolg dat TDLU’s atrofiëren en involueren [12]. - 37 - 4.2 γ-H2AX foci analyse Voor het betrouwbaar te kunnen uitvoeren van de γ-H2AX foci test was optimalisatie vereist. Om deze reden werden een aantal verdunningen (figuur 14), verschillende chromogene substraten (figuur 15) en verschillende tegenkleuringen (figuur 16) uitgetest. Op die manier kwam een geoptimaliseerde indirecte, enzymatische immunohistochemische kleuring tot stand (figuur 17). In de meeste studies, uitgevoerd op celpreparaten, werd gekozen voor een fluorescente immunohistochemische kleuring om het aantal γ-H2AX foci te kwantificeren [1, 18, 32]. In dit onderzoek, uitgevoerd op weefselcoupes, wordt echter gekozen voor een enzymatische immunohistochemische kleuring waarbij het signaal via lichtmicroscopie kan worden gevisualiseerd en waaraan enkele voordelen verbonden zijn. Bij de gebruikte (HRP-DAB-NiCl2) kleuring heeft men namelijk geen probleem met autofluorescentie van het weefsel, kan de structuur van het weefsel beter zichtbaar worden gemaakt en zal geen fading van het signaal optreden. Dit zorgt ervoor dat de γ-H2AX foci stabiel blijven, door meerdere personen kunnen worden geteld en langer kunnen worden bewaard [63]. Aangezien in dit onderzoek met hele lage dosissen wordt gewerkt (0-100mGy) en op zoek wordt gegaan naar hele kleine verschillen, moeten de γ-H2AX foci betrouwbaar en uniform kunnen worden geteld. De γ-H2AX foci worden in deze studie enkel gescoord in de luminaire epitheliale laag van de TDLU’s, aangezien deze het meest betrokken zijn bij het ontstaan van borstkanker en de myoepitheliale, basale cellen van de klierbuizen soms vacuolen vertonen [13]. Deze vacuolen komen enkel voor in de myoepitheliale cellen tijdens de vroege en late luteale fase van de menstruele cyclus (zie 1.2) [11, 12]. Op sommige weefselcoupes werd een vrij groot verschil waargenomen in het aantal γ-H2AX foci tussen de verschillende klierbuisgroepen van eenzelfde coupe. Verschillende oorzaken kunnen echter aan de basis liggen van een minder goede immunohistochemische kleuring waaronder: te veel achtergrondkleuring ten gevolge van aspecifieke bindingen, slechte morfologie van de klierbuizen, verschillen in proliferatiegraad tussen de klierbuizen, inname van hormonen,…[11]. In dit onderzoek werden de coupes waarop de enzymatische immunohistochemische kleuring niet optimaal gelukt was, niet gebruikt voor het scoren van γ-H2AX foci. - 38 - Per coupe werden de γ-H2AX foci gescoord in gemiddeld 4 klierbuisgroepen, zodat ongeveer 200cellen/coupe/scorer en dus ongeveer 400 cellen/preparaat in het totaal werden geteld (figuur 12). Depuydt et al. en Beels et al. scoorden de γ-H2AX foci in respectievelijk 100 lymfocyten/slide en 200-250 lymfocyten/slide via fluorescentie microscopie. In beide studies verloopt de scoring van de γ-H2AX foci manueel. Bij Beels et al. wordt de telling, eveneens zoals in dit onderzoek, door 2 onafhankelijke personen uitgevoerd [1, 32]. Birkelbach et al. en Simonsson et al. voerden de γ-H2AX foci test uit op weefselcoupes [60, 64]. In de studie uitgevoerd door Birkelbach et al. onderzocht men in vitro het aantal stralingsgeïnduceerde DSB in longtumorweefsel, na bestraling met 10Gy X-stralen of behandeling met een chemotherapeuticum (cisplatin). De γ-H2AX foci werden gescoord in 200-400 cellen/coupe via fluorescentie microscopie [64]. Simonsson et al. examineerde in vivo de hypersensitiviteit in huidbiopsies van prostaatkanker patiënten, na bestraling met 100, 200, 450 en 1100mGy Xstralen. γ-H2AX foci werden automatisch gescoord met een CCD camera en fluorescentie microscoop [60]. 4.3 Dosis-respons curve In een dosis-responscurve wordt een biologisch effect in functie van de dosis weergegeven. Aangezien DNA een cruciaal target is voor straling, zal het biologische effect op dit niveau worden onderzocht. Rogakou et al. waren de eersten die konden aantonen dat het fosforyleren van het H2AX histon een zeer snelle en sensitieve reactie is van de cel op de aanwezigheid van DNA DSB [18]. Daarom werd in dit onderzoek de γ-H2AX foci test gebruikt om in vitro de effecten van X- en 60Co γ-stralen na te gaan in het lage dosis gebied. Gezien het beperkte aantal stalen die we in onze studie konden verzamelen (zie 4.1), werden de data van alle gezonde stalen samengevoegd voor verdere analyse (figuur 18, 19). Voor het opstellen van de dosis-respons curve werd een postbestralingstijd van 30min gekozen omdat in vele in vitro studies een maximaal aantal γ-H2AX wordt gevormd 15 à 30min na bestraling [32, 56, 60]. - 39 - Eerste resultaten uit dit onderzoek tonen aan dat het aantal foci in borstweefsel, 30min na bestraling, hoger ligt voor 30kV X- dan voor 60 Co γ-stralen, uitgezonderd voor 20 en 100mGy 30kV X-stralen (figuur 18, 19). Een hoger aantal foci komt voornamelijk voor in het lage dosis gebied van 0-10mGy en wijst op een lage dosis hypersensitiviteit (supra-lineariteit; zie 1.4.3, figuur 18, 19). Voor 60Co γ-stralen is deze lage dosis hypersensitiviteit minder duidelijk en strekt de lineariteit zich eerder uit over de volledige dosis-respons regio (figuur 18, 19). De hypersensitiviteit wordt gevolgd door een lineaire respons met lagere helling voor de hogere dosissen (20-100mGy), dewelke vergelijkbaar is voor beide stralingskwaliteiten. Het hoger aantal foci dat wordt waargenomen bij 30kV X-stralen voor alle dosispunten, uitgezonderd bij 20 en 100mGy, kan verklaard worden door een densere ionisatie track van 30kV X-stralen in vergelijking met 60Co γ-stralen [1]. Het lager aantal foci bij 20 en 100mGy 30kV X- dan bij 60Co γ-stralen, kan te wijten zijn aan het beperkt aantal datapunten. Het negatief aantal foci bij 2mGy 30kV X-stralen kan eveneens te wijten zijn aan een te beperkt aantal datapunten, waardoor uitschieters beter zichtbaar worden. Lage dosis hypersensitiviteit (supra-lineariteit) wordt in verscheidene artikels verklaard aan de hand van het bystander effect (zie 1.4.3). Ojima et al. onderzochten het bystander effect aan de hand van een inhibitor voor intercellulaire gap juncties (lindaan). In deze studie werd vastgesteld dat de hypersensitiviteit in het lage dosis gebied wegviel na het toedienen van lindaan. Volgens Ojima et al. impliceerde deze reactie dat het bystander effect verantwoordelijk is voor de hypersensitiviteit in het lage dosis gebied [36]. Simonsson et al. daarentegen brachten ook nog 2 andere plausibele oorzaken naar voren om de hypersensitiviteit te verklaren. Enerzijds zou hypersensitiviteit het effect kunnen zijn van een dosis-afhankelijke repair ratio, zodat bij hele lage dosissen de herstelmechanismen niet voldoende getriggerd worden om efficiënt de schade te herstellen. Anderzijds zou hypersensitiviteit ook het resultaat kunnen zijn van een efficiëntere defosforylatie of moeilijkere fosforylatie bij hogere dosissen [60]. Preliminaire resultaten uit dit onderzoek zijn overeenkomstig met deze van Beels et al. [32]. In laatstgenoemde in vitro studie werd een lage dosis hypersensitiviteit waargenomen (0-10mGy) bij 100kVp X-stralen en niet bij 60Co γ-stralen voor γ-H2AX foci. Deze hypersensitiviteit was hoger - 40 - bij bestraling van bloedstalen dan bij bestraling van geïsoleerde T-lymfocyten. De bloedstalen waren afkomstig van 3 gezonde donoren, die niet rookten en geen radiotherapie achtergrond hadden en werden bestraald met dosissen van 1-500mGy X- of 60 Co γ-stralen. De hypersensitiviteit die werd waargenomen in het lage dosis gebied is volgens Beels et al. te wijten aan het bystander effect [32]. Onze resultaten zijn niet in overeenstemming met deze van Simonsson et al. en Löbrich et al., waar de respons echter werd bekeken na in vivo bestraling [38, 60]. Simonsson et al. onderzochten de inductie en repair van γ-H2AX foci in huidbiopten, afkomstig van 5 prostaatkanker patiënten die radiotherapie ondergingen. Na de eerste therapeutische behandeling werden, 30min later, 4 huidbiopten van 3mm dik genomen. Deze huidbiopten kregen een dosis van 100, 200, 450 of 1100mGy X-stralen. Er kon een hypersensitiviteit worden aangetoond in het lage dosis-gebied van 50-300mGy. Het lange-termijn effect van de herhaaldelijke DNA schade werd geanalyseerd aan de hand van de hoeveelheid celdood (apoptose). Hieruit kon worden geconstateerd dat apoptose (0,026%) geen overheersende rol speelt bij de in vivo respons in het lage dosis gebied en dus niet verantwoordelijk is voor de vastgestelde hypersensitiviteit [60]. Aangezien in ons onderzoek wordt gewerkt met dosissen die lager zijn (0-100mGy), kan apoptose ook in onze studie niet aan de basis liggen van de waargenomen hypersensitiviteit. Löbrich et al. daarentegen namen een lineaire dosis-respons waar, nadat patiënten een CT onderzoek van de thorax en/of abdomen hadden ondergaan. Deze lineaire-dosis respons curve, voor γ-H2AX foci, werd waargenomen over het dosis gebied van 3-30mGy 120 kVp X-stralen [38]. Net zoals in ons onderzoek, simuleerden Colin et al. een mammografie, waar de in vitro inductie en repair van DNA DSB werden onderzocht aan de hand van geïsoleerde primaire borstepitheelcellen [18]. Deze epitheelcellen, afkomstig van 30 vrouwelijke patiënten met een hoge of lage familiale belasting, werden gefractioneerd blootgesteld aan lage energie X-stralen (2+2mGy, 28kVp) en ook eenzijdig blootgesteld aan lage energie X-stralen (2, 4mGy). Enerzijds stelden Colin et al. vast dat het spontaan aantal DSB significant hoger ligt bij personen met een hoge familiale belasting in vergelijking met personen met een lage familiale belasting. Er wordt - 41 - gesuggereerd dat dit een teken zou kunnen zijn van de impact van voorafgaande radiotherapie of genetische achtergrond (of beiden) van de patiënten met een hoge familiale belasting. Anderzijds namen Colin. et al. een significant dosis effect waar in het lage dosis gebied ongeacht de risicostatus. Dit is in overeenstemming met onze resultaten, dewelke echter enkel gelden voor gezond borstweefsel van niet-mutatiedragers en niet significant konden worden aangetoond wegens een gebrek aan voldoende data. In onze studie blijkt een duidelijke verhoging van het aantal γ-H2AX foci te kunnen worden gedetecteerd bij een dosis van 2+2 en 4mGy (figuur 18, 19). Colin et al. stelden eveneens vast dat minder DSB werden geïnduceerd bij een enkele dosis van 2 of 4mGy 28kVp X-stralen dan bij een gefractioneerde blootstelling (2+2mGy), ongeacht de risicostatus. Er wordt gesuggereerd door Colin et. al dat een groter aantal stralingsgeïnduceerde DSB, bij 2 opeenvolgende views van de borst, teweeggebracht zou kunnen worden door interferentie van de schade verworven tijdens de 2de blootststelling aan X-stralen met het herstel van baseschade en SSB veroorzaakt tijdens de 1ste blootstelling. Dit kan verklaard worden door de halfwaardetijd die nodig is voor het herstel van baseschade en SSB. Deze bedraagt 1-5min voor het herstel van baseschade en 5-10min voor het herstel van SSB (zie 1.4.1). Deze effecten waren steeds meer uitgesproken voor personen met een hoge familiale belasting [18]. Resultaten uit onze studie bevestigen dat een gefractioneerde blootstelling aan 2+2mGy schadelijker is dan een eenzijdige blootstelling aan 2 en 4mGy, voor zowel 30kV X- als 60 Co γ-stralen (figuur 18, 19). Naast γ-H2AX foci kunnen ook gefosforyleerde ATM foci gebruikt worden als biomerker om het effect van straling in het lage dosis gebied na te gaan. Deze laatstgenoemde foci test werd aangewend door Ojima et al. en Suzuki et al., omdat deze minder aanleiding gaf tot achtergrond foci in prolifererende cellen. γ-H2AX foci komen namelijk eveneens voor in delende cellen tijdens de S-fase van de celcyclus [36, 65]. Tijdens de synthese van het DNA wordt de dubbelstreng helix ontwonden door een enzym helicase. Hierdoor ontstaat op de plaats van de replicatie een spanning op de DNA streng. Deze spanning wordt opgegeven door het knippen van de helix, waardoor een DSB ontstaat [25]. Preliminaire resultaten uit onze studie zijn in overeenstemming met deze van Ojima et al. en Suzuki et al. [36, 65]. De in vitro studie uitgevoerd door Ojima et al. ging de sensitiviteit van de primaire normale humane - 42 - fibroblastencellijn (MRC-5) na bij blootstelling aan 90kVp X-stralen. Resultaten uit deze studie bevestigen een hypersensitieve dosis-respons bij dosissen van 1,2-5mGy. Een lineaire dosisrespons curve werd gevonden bij dosissen van 10mGy-200mGy [36]. Suzuki et al. onderzochten in vitro de gevoeligheid van exponentieel groeiende normale humane diploïde cellen aan 150kVp X-stralen. Er werd eveneens een lineaire dosis respons vastgesteld bij dosissen van 10-1000mGy [65]. Naast het voordeel van minder ATM foci als achtergrond in prolifererende cellen, moet worden in acht genomen dat de incidentie van Ataxia Telangiectasia wereldwijd 1/40 000 tot 1/100 000 bedraagt. Ataxia Telangiectasia is een autosomaal recessieve genetische aandoening, die wordt gekenmerkt door een overgevoeligheid aan IR en verlies van controle van de celcyclus, met een sterk verhoogd kankerrisico tot gevolg [66]. Echter, 0,5-1% van de wereldbevolking is heterozygoot voor ATM (ATM+/-) [67]. Dit maakt het gebruik van de γ-H2AX foci test geschikter dan de gefosforyleerde ATM foci test om stralingsschade na te gaan. Aangezien borstepitheelcellen enkel tijdens de late luteale fase frequent prolifereren, zal de fractie aan achtergrond foci in dit onderzoek miniem zijn [12]. Om het verschil in inductie van DNA DSB te bepalen tussen 30kV X-en 60Co γ-stralen, wordt de RBE bepaald. Uit de dosis-respons curve wordt een RBE van 2,34 afgeleid voor γ-H2AX foci, in het lage dosis gebied van 0-10mGy (figuur 19). Voor hogere dosissen (20-100mGy) wordt een vergelijkbare lineaire respons (RBE) waargenomen voor beide stralingskwaliteiten (figuur 18). Het ICRP beschouwd echter nog steeds een RBE van 1 voor alle lage LET straling (zie 1.4.3) [1, 35, 39]. Data uit onze studie zijn echter zeer beperkt en moeten verder uitgebreid worden. Resultaten uit onze studie zijn gedeeltelijk in overeenstemming met deze bekomen door Depuydt et al. [1]. In laatstgenoemde in vitro studie werden de PBL, afkomstig van 5 gezonde donoren, bestraald met dosissen van 5-500 mGy 30kV X- en 60 Co γ-stralen. Voor de volledige dosis- respons curve kon worden aangetoond dat 30kV X-stralen meer DSB induceren dan 60 Co γ- stralen (1,22MeV). Dit schadelijker effect uit zich in een RBE van 1,4 voor de γ-H2AX foci test, wat impliceert dat 30kV X-stralen schadelijker zijn dan 60 Co γ-stralen. Bij Depuydt et al. uitte deze hogere LET waarde zich tevens in een lagere drempeldosis vanaf wanneer γ-H2AX foci konden worden gedetecteerd. Deze bedroeg 10mGy voor 30kV X-stralen en 50mGy voor 60Co γ- - 43 - stralen [1]. In onze studie blijken γ-H2AX foci reeds detecteerbaar te zijn bij een dosis van 2+2 en 4mGy 30kV X-stralen (figuur 18, 19). Colin et al. namen reeds een significant dosis effect waar vanaf 4mGy, wat erop zou kunnen wijzen dat epitheliale cellen van de borst gevoeliger zijn aan straling dan lymfocyten [1, 18]. Heyes et al. daarentegen vonden een RBE van 4.42 +/- 2.02 voor in vitro cel transformaties van de CGL-1 cellijn, bij 29kVp X-stralen in vergelijking met 60 Co γ-stralen en 2.2 MeV elektronen van een strontium90/yttrium90 radioactieve bron [68]. Resultaten uit ons onderzoek en deze bekomen door Depuydt et al., zijn niet in overeenstemming met deze bekomen door Beyreuther et al [39]. Laatgenoemde studie onderzocht in vitro het verband tussen de inductie van chromosoom aberraties in borstepitheel cellijnen (184A1 en MCF12A) en de energie-afhankelijkheid ervan aan X-stralen. De RBE werd bepaald aan de hand van de fractie acentrische ringen en dicentrische chromosomen. Uit deze studie volgde een RBE van 1,31 en 1,70 voor de cellijn 184A1 en 1,08 en 1,43 voor de cellijn MCF12A voor respectievelijk 25kV en 10kV X-stralen, met 200kV X-stralen als referentie. Hieruit kan worden vastgesteld dat lagere energie X-stralen zorgen voor een hogere RBE. Echter, voor de 25kV Xstralen die aanleunen bij de 30kV X-stralen uit ons onderzoek, bekomt Beyreuther et al. een RBE van ongeveer 1, zoals het ICRP het voorschrijft [1, 39]. Verschillende resultaten uit bovenstaande studies kunnen worden toegeschreven aan het gebruik van verschillende stralingskwaliteiten, dosissen, celtypes, cellijnen, biomerkers en/of eindpunten. Voorzichtigheid bij het vergelijken van de data is dus aangewezen. 4.4 Repair kinetiek De γ-H2AX foci test werd eveneens gebruikt om de repair kinetiek van DNA DSB, in gezond borstweefsel van niet-mutatiedragers, te bestuderen. Volgens verschillende literatuurgegevens zou de defosforylatie en bijgevolg het verdwijnen van de γ-H2AX foci overeenstemmen met het herstel van DSB [38, 61]. Om in dit onderzoek de repair kinetiek van γ-H2AX foci na te gaan, werden stalen bestraald met 4 en 40mGy en vervolgens 30min en 24uur geïncubeerd na bestraling (37°C, 5% CO2). Na deze - 44 - postbestralingstijden werden de stalen op ijs geplaatst en gefixeerd in 4% NGF. Door in dit onderzoek niet-bestraalde stralen als controle mee te nemen, werd er rekening gehouden met γH2AX foci die spontaan kunnen optreden na 30min en 24uur incubatie en waarvan het aantal kan afhangen van de individuele gevoeligheid voor onder andere oxidatieve stress [18]. Figuur 20 toont aan dat het aantal geïnduceerde γ-H2AX foci daalt na 24 uur zowel voor 30kV X- als voor 60 Co γ-stralen. Het hoger aantal residuele dan geïnduceerde foci bij 40mGy 60Co γ-stralen en het hoger aantal geïnduceerde foci bij 4mGy dan bij 40mGy 60Co γ-stralen, kan te wijten zijn aan een te beperkt aantal datapunten. Het aantal geïnduceerde foci reduceert na 24 uur naar achtergrondwaarden bij 4mGy 60Co γ-stralen. Dit is echter niet het geval bij 4 en 40mGy 30kV X-stralen, waar het aantal residuele foci na 24 uur boven de achtergrondwaarden blijft. Het residueel aantal foci blijkt eveneens hoger te liggen bij 40mGy dan bij 4mGy na bestraling met 30kV X-stralen. Preliminaire resultaten uit onze studie zijn in overeenstemming met deze van Depuydt et al., Beels et al. en gedeeltelijk in overeenstemming met deze van Löbrich et al. en Rothkamm et al. [1, 32, 38, 61]. Depuydt et al stelden vast dat 30kV X-stralen voor meer geclusterde DNA schade zorgen dan 60Co γ-stralen en daarom moeilijker worden hersteld [1]. Om deze reden worden meer residuele foci na 24 uur verwacht bij 30kV X- dan bij 60 Co γ-stralen. Beels et al. toonden een verschil in repair aan, wanneer bloedstalen werden bestraald met 5 en 200mGy 100kVp Xstralen of 60 Co γ-stralen. Uit deze studie stelde men vast dat het aantal stralingsgeïnduceerde γ- H2AX foci, na bestraling met 5 en 200mGy X-stralen, niet werd gereduceerd naar achtergrondwaarden na 24uur incubatie. Echter, 40% residuele γ-H2AX foci bleven over, voor beide dosissen (5 en 200mGy). Wanneer T-lymfocyten werden bestraald met 200mGy X-stralen, bleef slechts 10% van de initiële foci over na 24 uur. Wanneer daarentegen bloedstalen en geïsoleerde T-lymfocyten werden bestraald met 200mGy 60 Co γ-stralen, werden wel achtergrondwaarden van γ-H2AX foci waargenomen na 24 uur. Bij de bloedstalen bestraald met 5mGy 60 Co γ-stralen werd geen significante stijging van het aantal stralingsgeïnduceerde γ- H2AX foci aangetroffen, waardoor geen conclusies konden worden getrokken. Beels et al. veronderstelden uit deze resultaten dat er 2 types van DSB bestaan. Enerzijds bestaan er DSB met een vertraagde herstelcapaciteit, te wijten aan de gebruikte stralingskwaliteit, en anderzijds - 45 - bestaan er DSB die herstellen met een halfwaardetijd van 3 à 4 uur [32]. Löbrich et al. namen eveneens een verschil in herstelcapaciteit waar, wanneer PBL in vitro werden bestraald met dosissen van 5 en 500mGy 90kV X-stralen. Hieruit bleek dat het aantal stralingsgeïnduceerde γH2AX foci na 24 uur voor respectievelijk 50% en 90% waren hersteld. Dit was echter niet het geval voor de in vivo situatie, waar na 24 uur incubatie achtergrondwaarden van de γ-H2AX foci werden bekomen, voor zowel 5 als 500mGy X-stralen [38]. Rothkamm et al. onderzochten in vitro het effect van 1-2000 mGy 90kV X-stralen op onder andere de MRC-5 cellijn. In deze studie werd vastgesteld dat het herstel van DSB minder efficiënt verliep bij lage dosissen (1,25mGy) of zelfs uitbleef bij dosissen lager dan 1,2mGy na 24 uur, in tegenstelling tot de efficiënte repair bij hogere dosissen (20-2000mGy), waarbij het aantal stralingsgeïnduceerde foci naar achtergrondwaarden reduceerde [61]. Preliminaire resultaten uit onze studie zijn echter niet in overeenstemming met deze van Colin et al. en Simonsson et al. [18, 60]. Colin et al. stelden een hoger aantal γ-H2AX foci vast na 24 uur dan na 10min postbestralingstijd, ongeacht de risicostatus [18]. Uit de in vivo resultaten van Simonsson et al. kon geen verschil worden vastgesteld tussen het aantal stralingsgeïnduceerde en residuele γ-H2AX foci in huidepitheelcellen, na bestraling met 450 en 1100mGy X-stralen en een postbestralingstijd van 30min en 2uur [60]. Verschillende resultaten uit bovenstaande studies in vergelijking met onze resultaten zouden kunnen worden toegeschreven aan het gebruik van verschillende postbestralingstijden, cellen, stralingskwaliteit en/of dosis. 5. Algemeen besluit In deze in vitro studie werd de inductie en het herstel van DNA DSB onderzocht in gezond borstweefsel aan de hand van de γ-H2AX foci test. Gezien het beperkt aantal stalen werden de data van de verschillende individuen samengevoegd. In onze studie werd er dus geen rekening gehouden met interindividuele verschillen die het gevolg kunnen zijn van 1. het al dan niet gehad hebben van borstkanker, 2. de fase van de menstruele cyclus waarin de vrouwen zaten tijdens het uitvoeren van de borstreductie of de mastectomie, 3. eventueel lopende hormoon-therapieën, 4. leeftijd,…Resultaten uit onze studie geven dus slechts een eerste indicatie weer over het effect - 46 - van straling op gezond borstweefsel in het lage dosis gebied en het herstel van de DNA DBS. Enerzijds tonen preliminaire resultaten uit onze studie aan dat 30kV X-stralen schadelijker zijn in het lage dosis gebied (0-10mGy) dan 60 Co γ-stralen (RBE: 2,34). Tevens kan een biologisch effect worden waargenomen bij reeds zeer lage dosissen van 2+2 en 4mGy 30kV X-stralen, zoals gegeven bij een mammografie. Gegevens over de RBE zijn van groot belang voor het opstellen van richtlijnen, zoals vanaf welke leeftijd er mag worden gescreend (DIR), voornamelijk voor risicopatiënten. Anderzijds tonen preliminaire resultaten over de repair kinetiek van DNA DSB, in gezond borstweefsel van niet-mutatiedragers, aan dat er een daling van het aantal stralingsgeïnduceerde γ-H2AX foci optreedt na 24 uur, ongeacht de stralingskwaliteit. Echter, het aantal residuele foci geïnduceerd door 30kV X-stralen blijft na 24 uur boven de achtergrondwaarden in tegenstelling tot het aantal residuele foci na bestraling met 4mGy 60Co γstralen. Uitbreiding van de studie, met meer stalen, is noodzakelijk om significante resultaten te bekomen. 6. Referenties 1. Depuydt J, Baert A, Vandersickel V, Thierens H, Vral A (2013). Relative biological effectiveness of mammography X-rays at the level of DNA and chromosomes in lymphocytes. International journal of radiation biology 89: 532-8. 2. Bray F, McCarron P, Parkin DM (2004). The changing global patterns of female breast cancer incidence and mortality. Breast cancer research : BCR 6: 229-39. 3. Jemal A, Center MM, DeSantis C, Ward EM (2010). Global patterns of cancer incidence and mortality rates and trends. Cancer epidemiology, biomarkers & prevention : a publication of the American Association for Cancer Research, cosponsored by the American Society of Preventive Oncology 19: 1893-907. 4. htpp://kankerregister.org/Statistieken. 5. Hofvind S, Ursin G, Tretli S, Sebuodegard S, Moller B (2013). Breast cancer mortality in participants of the Norwegian Breast Cancer Screening Program. Cancer 119: 3106-12. 6. Ferlay J, Autier P, Boniol M, Heanue M, Colombet M, Boyle P (2007). Estimates of the cancer incidence and mortality in Europe in 2006. Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology / ESMO 18: 581-92. 7. Young B LJ, Stevens A, Heath JW (2006). Wheater's functional histology. Elsevier. 8. Ross M H WP (2010). Histology: A Text and Atlas. 9. Crombez R PK (2006). Borstkanker. Wolters Kluwer Belgium NV. 10. Petersen OW, Ronnov-Jessen L, Howlett AR, Bissell MJ (1992). Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 89: 9064-8. 11. Ramakrishnan R, Khan SA, Badve S (2002). Morphological changes in breast tissue with menstrual cycle. Modern pathology : an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc 15: 1348-56. 12. https://www.inkling.com/read/practical-breast-pathology-diagnostic-atkins-1st/chapter-1/normal-histology. - 47 - 13. Lim S, Yu JH, Park HK, Moon B, Ko B, Suh YJ (2014). A comparison of the clinical outcomes of patients with invasive lobular carcinoma and invasive ductal carcinoma of the breast according to molecular subtype in a Korean population. World journal of surgical oncology 12: 56. 14. http://www.tegenkanker.be. 15. Heyes GJ, Mill AJ, Charles MW (2006). Enhanced biological effectiveness of low energy X-rays and implications for the UK breast screening programme. The British journal of radiology 79: 195-200. 16. Drukker CA, Schmidt MK, Rutgers EJ, Cardoso F, Kerlikowske K, Esserman LJ, et al. (2014). Mammographic screening detects low-risk tumor biology breast cancers. Breast cancer research and treatment 144: 103-11. 17. Frankenberg D, Kelnhofer K, Bar K, Frankenberg-Schwager M (2002). Enhanced neoplastic transformation by mammography X rays relative to 200 kVp X rays: Indication for a strong dependence on photon energy of the RBEM for various end points (vol 157, pg 99, 2002). Radiat Res 157: 99-105. 18. Colin C, Devic C, Noel A, Rabilloud M, Zabot MT, Pinet-Isaac S, et al. (2011). DNA double-strand breaks induced by mammographic screening procedures in human mammary epithelial cells. International journal of radiation biology 87: 1103-12. 19. Suzuki K, Yamashita S (2012). Low-dose radiation exposure and carcinogenesis. Japanese journal of clinical oncology 42: 563-8. 20. Thierry-Chef I, Simon SL, Weinstock RM, Kwon D, Linet MS (2012). Reconstruction of absorbed doses to fibroglandular tissue of the breast of women undergoing mammography (1960 to the present). Radiation research 177: 92-108. 21. Klein R, Aichinger H, Dierker J, Jansen JT, Joite-Barfuss S, Sabel M, et al. (1997). Determination of average glandular dose with modern mammography units for two large groups of patients. Physics in medicine and biology 42: 651-71. 22. https://kce.fgov.be. 23. Heyes GJ, Mill AJ, Charles MW (2009). Mammography-oncogenecity at low doses. Journal of radiological protection : official journal of the Society for Radiological Protection 29: A123-32. 24. Foulkes WD (2014). BRCA1 and BRCA2 - update and implications on the genetics of breast cancer: a clinical perspective. Clinical genetics 85: 1-4. 25. Bracke M LF, Vandenberghe P, Vanderkerken K (2013). Kanker, biomedisch bekeken. Standaard uitgeverij professional. 26. Tubiana M DJ, Wambersie A (1990). Introduction to radiobiology. 27. Cervelli T, Borghini A, Galli A, Andreassi MG (2012). DNA damage and repair in atherosclerosis: current insights and future perspectives. International journal of molecular sciences 13: 16929-44. 28. Grudzenski S, Raths A, Conrad S, Rube CE, Lobrich M (2010). Inducible response required for repair of low-dose radiation damage in human fibroblasts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107: 14205-10. 29. Goodarzi AA, Jeggo PA (2012). Irradiation induced foci (IRIF) as a biomarker for radiosensitivity. Mutation research 736: 39-47. 30. Frankenberg D, Kelnhofer K, Bar K, Frankenberg-Schwager M (2002). Enhanced neoplastic transformation by mammography X rays relative to 200 kVp X rays: indication for a strong dependence on photon energy of the RBE(M) for various end points. Radiation research 157: 99-105. 31. Pastink A, Eeken JC, Lohman PH (2001). Genomic integrity and the repair of double-strand DNA breaks. Mutation research 480-481: 37-50. 32. Beels L, Werbrouck J, Thierens H (2010). Dose response and repair kinetics of gamma-H2AX foci induced by in vitro irradiation of whole blood and T-lymphocytes with X- and gamma-radiation. International journal of radiation biology 86: 760-8. 33. EL T (2000). Primer of medical radiobiology. 34. http://www.bbc.co.uk. 35. Hill MA (2004). The variation in biological effectiveness of X-rays and gamma rays with energy. Radiation protection dosimetry 112: 471-81. 36. Ojima M, Ban N, Kai M (2008). DNA double-strand breaks induced by very low X-ray doses are largely due to bystander effects. Radiation research 170: 365-71. 37. http://www.ehs.washington.edu/rsotrain/sealedsources/cancerrisk. - 48 - 38. Lobrich M, Rief N, Kuhne M, Heckmann M, Fleckenstein J, Rube C, et al. (2005). In vivo formation and repair of DNA double-strand breaks after computed tomography examinations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102: 8984-9. 39. Beyreuther E, Dorr W, Lehnert A, Lessmann E, Pawelke J (2009). Relative biological effectiveness of 25 and 10 kV X-rays for the induction of chromosomal aberrations in two human mammary epithelial cell lines. Radiation and environmental biophysics 48: 333-40. 40. Beyreuther E, Lessmann E, Pawelke J, Pieck S (2009). DNA double-strand break signalling: X-ray energy dependence of residual co-localised foci of gamma-H2AX and 53BP1. International journal of radiation biology 85: 1042-50. 41. International Atomic Energy Agency (2011). Cytogenic dosimetry: applications in preparedness for and response to radiation emergencies. IAEA Austria. 42. Khanna KK, Jackson SP (2001). DNA double-strand breaks: signaling, repair and the cancer connection. Nature genetics 27: 247-54. 43. Rothkamm K, Kuhne M, Jeggo PA, Lobrich M (2001). Radiation-induced genomic rearrangements formed by nonhomologous end-joining of DNA double-strand breaks. Cancer research 61: 3886-93. 44. Mahaney BL, Meek K, Lees-Miller SP (2009). Repair of ionizing radiation-induced DNA double-strand breaks by non-homologous end-joining. The Biochemical journal 417: 639-50. 45. Hartlerode AJ, Scully R (2009). Mechanisms of double-strand break repair in somatic mammalian cells. The Biochemical journal 423: 157-68. 46. Bracke M LF, Vandenberghe P, Vanderkerken K (2013). Kanker, biomedisch bekeken. Standaard uitgeverij professional. 47. Kavanagh JN, Redmond KM, Schettino G, Prise KM (2013). DNA double strand break repair: a radiation perspective. Antioxidants & redox signaling 18: 2458-72. 48. Jeggo PA, Geuting V, Lobrich M (2011). The role of homologous recombination in radiation-induced double-strand break repair. Radiotherapy and oncology : journal of the European Society for Therapeutic Radiology and Oncology 101: 7-12. 49. Lee JH, Goodarzi AA, Jeggo PA, Paull TT (2010). 53BP1 promotes ATM activity through direct interactions with the MRN complex. The EMBO journal 29: 574-85. 50. O'Donovan PJ, Livingston DM (2010). BRCA1 and BRCA2: breast/ovarian cancer susceptibility gene products and participants in DNA double-strand break repair. Carcinogenesis 31: 961-7. 51. Foulkes WD, Shuen AY (2013). In brief: BRCA1 and BRCA2. The Journal of pathology 230: 347-9. 52. Dever SM, White ER, Hartman MC, Valerie K (2012). BRCA1-directed, enhanced and aberrant homologous recombination: mechanism and potential treatment strategies. Cell cycle 11: 687-94. 53. Huszno J, Budryk M, Kolosza Z, Nowara E (2013). The influence of BRCA1/BRCA2 mutations on toxicity related to chemotherapy and radiotherapy in early breast cancer patients. Oncology 85: 278-82. 54. www.nature.com. 55. Beels L, Bacher K, De Wolf D, Werbrouck J, Thierens H (2009). gamma-H2AX foci as a biomarker for patient X-ray exposure in pediatric cardiac catheterization: are we underestimating radiation risks? Circulation 120: 1903-9. 56. Rogakou EP, Pilch DR, Orr AH, Ivanova VS, Bonner WM (1998). DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. The Journal of biological chemistry 273: 5858-68. 57. West AG, van Attikum H (2006). Chromatin at the crossroads. Meeting on signalling to chromatin epigenetics. EMBO reports 7: 1206-10. 58. MacPhail SH, Banath JP, Yu TY, Chu EH, Lambur H, Olive PL (2003). Expression of phosphorylated histone H2AX in cultured cell lines following exposure to X-rays. International journal of radiation biology 79: 3518. 59. Paull TT, Rogakou EP, Yamazaki V, Kirchgessner CU, Gellert M, Bonner WM (2000). A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Current biology : CB 10: 886-95. 60. Simonsson M, Qvarnstrom F, Nyman J, Johansson KA, Garmo H, Turesson I (2008). Low-dose hypersensitive gammaH2AX response and infrequent apoptosis in epidermis from radiotherapy patients. Radiotherapy and oncology : journal of the European Society for Therapeutic Radiology and Oncology 88: 388-97. 61. Rothkamm K, Lobrich M (2003). Evidence for a lack of DNA double-strand break repair in human cells exposed to very low x-ray doses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100: 5057-62. - 49 - 62. www.encyclo.nl/begrip. 63. Kumar LG, Zucker MR (Editors) (2009). Immunohistochemical (IHC) Staining Methods. Dako North America, California, 172p. 64. Birkelbach M, Ferraiolo N, Gheorghiu L, Pfaffle HN, Daly B, Ebright MI, et al. (2013). Detection of impaired homologous recombination repair in NSCLC cells and tissues. Journal of thoracic oncology : official publication of the International Association for the Study of Lung Cancer 8: 279-86. 65. Suzuki K, Okada H, Yamauchi M, Oka Y, Kodama S, Watanabe M (2006). Qualitative and quantitative analysis of phosphorylated ATM foci induced by low-dose ionizing radiation. Radiation research 165: 499-504. 66. Shiloh Y, Kastan MB (2001). ATM: genome stability, neuronal development, and cancer cross paths. Advances in cancer research 83: 209-54. 67. www.ntvg.nl/publicatie/van-gen-naar-ziekte-ataxia-teleangiectasia/. 68. Heyes GJ, Mill AJ (2004). The neoplastic transformation potential of mammography X rays and atomic bomb spectrum radiation. Radiation research 162: 120-7. - 50 - 7. Bijlagen Bijlage 1: Samenstelling ringer. Producten Natriumchloride (NaCl) Calciumchloride (CaCl2) Kaliumchloride (KCl) Firma Catalogusnummer Hoeveelheid Sigma-Aldrich® (Bornem,België) VWR® (Leuven, België) VWR® S-9888 9,00 g 766948 0,42 g 1.04936 0,24 g Bijlage 2: Samenstelling cultuurmedium MCF10A. Producten Firma Gibco® DMEM/Glutamax (Thermo Scientific) Gibco® F12/Glutamax Gibco® FCS EGF (recombinant humaan)* Hydrocortison** Insuline*** Penicilline/Streptavidine PeproTech (HalleZoersel, België) Sigma-Aldrich® Sigma-Aldrich® Gibco® Catalogusnummer 61965 Hoeveelheid 250 ml 31765 10270-106 250 ml 25,0 ml AF-100-15 100 µl H0888 I1882 15140-122 250 µl 500 µl 2,50 ml * EGF : oplossen in 100 µg/ml in steriel water,aliquoteren en bij -20°C bewaren. ** hydrocortison : oplossen in 1 mg/ml absolute ethanol, aliquoteren en bij -20°C bewaren (eerst 10X aliquoteren en pas indien nodig verder verdunnen naar 1X). *** insuline : oplossen in 10 mg/ml in steriel water met 1% ijsazijn. Laat staan gedurende ongeveer 10-15 min, aliquoteren en bewaren bij 4°C. Bijlage 3: Samenstelling 4% NGF. Producten Formaldehyde 40% Firma ® VWR VWR® Dinatriumhygrogenfosfaat (Na2HPO4 ) VWR® Kaliumdihydrogenfosfaat (KH2PO4 )* *KH2PO4 toevoegen tot pH 6,9. **Gedestilleerd H2O toevoegen tot 1000 ml. Catalogusnummer Hoeveelheid UN.2209 100 ml 1.06580 1,78 g 1.04873 0,42 g Bijlage 4: Protocol manuele inbedding paraffine. Producten Firma Catalogusnummer Tijd CL00.1807.2500 1uur Disolol® 50% Chem-lab, Zedelgem, België Chem-lab CL00.1807.2500 1uur Disolol® 70% Chem-lab CL00.1807.2500 1uur Disolol 96% Chem-lab CL00.1807.2500 1uur Isopropyl alcohol Chem-lab CL00.0901.5000 1uur Isopropyl alcohol / toluol (1:1) Toluol Chem-lab CL00.0901.5000/CL00.2001.5000 1uur Chem-lab CL00.2001.5000 30min Paraffine op 60°C (onder vacuüm) Thermo Scientific / Overnacht ® Disolol 30% ® Bijlage 5: HE protocol van het kleurtoestel Microm HMS 740. Bad 1 Bad 1 tolueen Bad 2 Bad 2 tolueen Bad 3 Bad 3 tolueen Bad 4 isopropanol Bad 5 isopropanol Bad 6 alcohol 96% Bad 7 alcohol 96% Bad 29 leidingwater Bad 19 aqua dest Bad 15 haematox. Bad 29 leidingwater Bad 16 clarifier I Bad 29 leidingwater Bad 17 bluing reagent Bad 29 leidingwater Bad 19 aqua dest Bad 18 eosine+phloxine Bad 29 leidingwater Bad 20 alcohol 96% Bad 21 alcohol 96% Bad 22 isopropanol Bad 8 isopropanol Bad 9 tolueen Bad 23 tolueen Bad 8 tolueen 5min 5min 5min 2min 2min 2min 2min 2min 1min 15sec 2min 1min 1min 1min 1min 1min 30sec 2min 2min 2min 2min 2min 2min 2min 1min Bijlage 6: Deparaffineringsprotocol van het kleurtoestel Microm HMS 740. Bad 1 tolueen Bad 2 tolueen Bad 3 tolueen Bad 4 isopropanol Bad 5 isopropanol Bad 6 alcohol 96% Bad 7 alcohol 96% Bad 29 leidingwater Bad 19 aqua dest Bad 40 aqua dest 5min 5min 5min 2min 2min 2min 2min 2min 1min 1min
© Copyright 2025 ExpyDoc