Inductie van DNA dubbelstrengbreuken door
mammografie X-stralen in borstweefsel.
Charlotte CARLIER
Verhandeling ingediend tot
het verkrijgen van de graad van
Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: Prof. Dr. Anne VRAL
Vakgroep: Medische basiswetenschappen
Academiejaar 2013-2014
Inductie van DNA dubbelstrengbreuken door
mammografie X-stralen in borstweefsel.
Charlotte CARLIER
Verhandeling ingediend tot
het verkrijgen van de graad van
Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: Prof. Dr. Anne VRAL
Vakgroep: Medische basiswetenschappen
Academiejaar 2013-2014
“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie
beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander
gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met
betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van
resultaten uit deze masterproef.”
Datum:
Charlotte Carlier
Prof. Dr. Anne Vral
Voorwoord
Deze thesis zou nooit tot stand zijn gekomen zonder hulp van verschillende mensen, daarom richt
ik graag een woordje van dank naar hen.
Eerst en vooral wil ik mijn promotor, Prof. Dr. Anne Vral bedanken. Zonder haar expertise,
vakkennis, toewijding en feedback was deze masterproef niet tot stand gekomen. Ik wil haar
tevens bedanken voor het beantwoorden van vele vragen en het nalezen van mijn thesis.
Ik wil ook Prof. Dr. Cornelissen bedanken voor het gebruik van het labo.
Uiteraard wil ik ook mijn lieve begeleidster, Julie Depuydt, bedanken voor het beantwoorden van
vele vragen, het nalezen van mijn thesis, het maken van de grafieken en nog zoveel meer.
Een speciaal woordje van dank gaat uit naar Leen. Ook al had ze het druk met andere zaken, toch
was ze steeds bereid om me te helpen. Zowel voor het uitvoeren als voor het beoordelen van de
talrijke immunohistochemische kleuringen. Ik wil haar ook bedanken voor het beantwoorden van
vele vragen en voor mij efficiënt de kneepjes van de routine histologie aan te leren. Dankjewel
Leen!
Annelies, dankjewel voor het geven van vele nuttige tips, het beantwoorden van vele vragen en
de leuke babbels.
Annelot, dankjewel voor het vinden van bepaalde artikels die ik niet zonder betaling te pakken
kon krijgen!
Indra, dankjewel voor de vele hulp in het 2de semester.
Heidi, Johanna, Greet, Toke, Pamela, Sebastian, Elien, Elke en Sylvia dankjewel voor de
aangename middagpauzes en vragen die ik aan jullie mocht stellen.
Tot slot wil ik ook mijn ouders en vrienden bedanken voor hun onvoorwaardelijke steun tijdens
mijn studentenjaren.
Inhoudstafel
Samenvatting
-1-
Abstract
-2-
1. Inleiding
-3-
1.1 Borstkankerincidentie
-3-
1.2 Anatomie en histologie van de borst
-3-
1.3 Screeningsmammografie
-6-
1.4 Ioniserende straling (IR)
-7-
1.4.1 Deoxyribonucleïnezuur (DNA) schade geïnduceerd door IR
-8-
1.4.2 Lineaire energie transfer (LET)
-9-
1.4.3 Relatieve biologische effectiviteit (RBE)
- 10 -
1.4.4 Detectie over inductie ratio (DIR)
- 12 -
1.5 Cellulaire respons op DNA schade
- 13 -
1.5.1 Herstelmechanismen voor DNA DSB
- 13 -
1.5.2 Repair kinetiek van DNA DSB
- 17 -
1.5.3 BRCA1 en BRCA2
- 17 -
1.5.4 γ-H2AX foci test
- 19 -
1.6 Doelstelling
- 20 -
2. Materialen en Methoden
- 21 -
2.1 Onderzoekspopulatie
- 21 -
2.2 Bestraling + incubatie
- 22 -
2.3 Fixatie
- 23 -
2.4 Inbedden + weefselcoupes snijden
- 23 -
2.5 γ-H2AX foci test
- 24 -
2.5.1 Haematoxyline-eosine (HE) kleuring
- 24 -
2.5.2 Immunohistochemische kleuring
- 24 -
2.5.3 Visualisatie en analyse van de γ-H2AX foci
- 27 -
3. Resultaten
- 27 -
3.1 HE kleuring
- 27 -
3.2 Optimalisatie van het protocol voor de γ-H2AX foci analyse
- 28 -
3.3 Dosis-respons curve
- 32 -
3.4 Repair kinetiek
4. Discussie
- 35 - 36 -
4.1 Materiaal
- 37 -
4.2 γ-H2AX foci analyse
- 38 -
4.3 Dosis-respons curve
- 39 -
4.4 Repair kinetiek
- 44 -
5. Algemeen besluit
- 46 -
6. Referenties
- 47 -
7. Bijlagen
Afkortingen
APLF
ATM
ATR
BARD1
BRCA1
BRCA2
C-terminus
CT
DNA
DNA-PKcs
DSB
Ekin
EMS
Gy
HE
HR
IAEA
ICRP
IR
KCE
keV
kVp
LET
LNT
MeV
MGD
min
µm
mm
MRI
MRN
NER
NHEJ
Palb2
PBL
PMMA
PNK
RBE
RPA
sec
SSB
TDLU
UV
WRN
XRCC4
Aprataxine and PNK-like factor
Ataxia Telangiectasia Mutated
ATM and Rad3-related
BRCA1 associated RING Domain protein 1
Breast Cancer gene 1
Breast Cancer gene 2
Carboxy-terminus
Computed Tomografie
Desoxyribonucleïne Acid
DNA-Proteïne Kinase catalytische subunit
Double-Strand Break
Kinetische Energie
Elektromagnetische Straling
Gray
Haematoxyline-Eosine
Homologe Recombinatie
International Atomic Energy Agency
International Commission on Radioprotection
Ionizing Radiation
The Belgian Health Care Knowledge Centre
kiloelectron volt
kilovolts peak
Linear Energy Transfer
Linear No Treshold
Megaelektron Volt
Mean Glandular Dose
minuten
micrometer
milimeter
Magnetic Resonance Imaging
Mre11/RAD50/NBS1
Nucleotide Excision Repair
Non Homologous End Joining
Partner and localisator of BRCA2
Perifere Bloed Lymfocyten
Polymethylmethacrylaat
Polynucleotide Kinase
Relatief Biologische Effectiviteit
Replicatie Proteïne A
seconden
Single-Strand Break
Terminal Duct Lobular Unit
Ultraviolet
Werner’s syndroom helicase
X-Ray repair Cross-Complementing protein 4
Samenvatting
Wereldwijd treft borstkanker 1 op de 9 vrouwen en vormt het tevens de belangrijkste
doodsoorzaak bij vrouwen in de leeftijdscategorie van 50 tot en met 69 jaar. Omdat borstkanker
het meest frequent voorkomt in deze leeftijdsgroep, biedt de Vlaamse overheid deze vrouwen
gratis een 2-jaarlijkse mammografie aan.
Mammografieën maken gebruik van ioniserende 30kV X-stralen en laten toe om borstkanker
vroegtijdig op te sporen en te behandelen, zodat een betere prognose en reductie van mortaliteit
kan bekomen worden.
Het ICRP veronderstelt een RBE van 1 voor alle lage LET straling, inclusief 30kV X- en 60Co γstralen. Dit wordt echter in vraag gesteld omdat deze RBE afkomstig is van extrapolaties van data
uit de “life span study”, waarbij overlevenden van Hiroshima en Nagasaki waren blootgesteld
aan hoge energie 60Co γ-stralen (2-5MeV).
Om deze reden wordt in dit onderzoek het effect van 30kV X-stralen nagegaan, met
60
Co γ-
stralen (1,22MeV) als referentie. Zowel de inductie als repair van DNA DSB wordt onderzocht
aan de hand van de zeer gevoelige en specifieke γ-H2AX foci test. In vergelijking met
voorgaande studies, waar gefocust werd op cellen of cellijnen, wordt in deze studie gewerkt met
vers gedisseceerd gezond borstweefsel. Op die manier wordt een relevantere setting bekomen.
Enerzijds tonen eerste resultaten uit dit onderzoek aan dat 30kV X-stralen algemeen een hoger
aantal foci induceren dan
60
Co γ-stralen na 30min incubatie. Preliminaire resultaten tonen
eveneens een hypersensitiviteit aan in het lage dosis gebied (0-10mGy), dewelke meer is
uitgesproken voor 30kV X- dan voor
60
Co γ-stralen. Dit uit zich in een RBE van 2,34 voor γ-
H2AX foci in het lage dosis gebied (0-10mGy). Anderzijds tonen preliminaire resultaten over de
repair kinetiek van DNA DSB aan dat het aantal geïnduceerde γ-H2AX foci daalt, voor beide
stralingskwaliteiten. Het aantal geïnduceerde foci reduceert na 24 uur naar achtergrondwaarden
bij 4mGy
60
Co γ-stralen. Dit is echter niet het geval bij 4 en 40mGy 30kV X-stralen, waar het
aantal residuele foci na 24 uur boven de achtergrondwaarden blijft. Verdere uitbreiding van dit
onderzoek, met meerdere stalen, is noodzakelijk om significante resultaten te bekomen.
-1-
Abstract
Background: A lot of studies have investigated the effect of low mammography X-rays on cells.
In this study we want to investigate the effect of 30kV X-rays on healthy breast tissue and
determine the RBE for γ-H2AX foci. We also want to study the repair kinetics of DNA DSB for
30kV X-and 60Co γ-rays after 24 hours.
Methods: Healthy breast tissue of 8 female donors was irradiated in vitro with 30kV X-and 60Co
γ-rays, with doses between 0 and 100mGy. The γ-H2AX foci assay was used to quantify the
number of DNA DSB after irradiation. Repair kinetics of γ-H2AX foci were observed 30minutes
and 24hours after irradiation with 4 and 40mGy 30kV X- and 60Co γ-rays.
Results: Preliminary results show that 30kV X-rays are in general more harmful than
60
Co γ-
rays. First results also show a hypersensitivity in the low-dose region between 0-10mGy for 30kV
X-and
60
Co γ-rays. An RBE of 2,34 was obtained with the γ-H2AX foci assay in this low-dose
region. Results of the repair kinetics show that the initial γ-H2AX foci reduce after 24 hours to
background levels after irradiation with 4mGy 60Co γ-rays. Though, this was not the case for 4
and 40mGy 30kV X-rays, where the residual foci stay above background levels.
Conclusions: Preliminary results show that mammography X-rays produce more DSB in
comparison with 60Co γ-rays. Therefore, 30kV X-rays are supposed to be more harmful than 60Co
γ-rays (RBE: 2,34). Concerning repair kinetics, a decrease was found after 24 hours for both
irradiation conditions.
-2-
1. Inleiding
1.1 Borstkankerincidentie
Wereldwijd wordt 1 op de 9 vrouwen geconfronteerd met borstkanker [1]. Borstkanker is
hierdoor de meest frequent gediagnosticeerde kanker en de belangrijkste doodsoorzaak bij
vrouwen wereldwijd in de leeftijdscategorie van 50 tot en met 69 jaar [1-4]. Figuur 1 toont het
absoluut aantal nieuwe borstkankers, gedetecteerd in 2011 bij de vrouwelijke populatie uit België
[4]. Door preventief een screeningsmammografie te laten uitvoeren kan borstkanker vroeger
worden gedetecteerd en beter worden behandeld. Dit leidt tot een betere prognose en reductie van
mortaliteit. Hierdoor staat borstkanker desondanks zijn 1ste plaats qua incidentie, pas op de 3de
plaats wat betreft mortaliteit [1, 5, 6].
Figuur 1: Het absoluut aantal nieuwe gediagnosticeerde borstkankers bij vrouwen uit België in 2011 [4].
1.2 Anatomie en histologie van de borst
Borstklieren zijn sterk gewijzigde tubulo-alveolaire apocriene zweetklieren die zich bevinden in
subcutaan weefsel. Ze ontwikkelen zich vanaf de puberteit bij vrouwen onder invloed van
oestrogeen en progesteron dat voornamelijk wordt vrijgesteld door de ovaria. Tijdens de eerste
zwangerschap is er een significante stijging van het aantal klierbuizen voornamelijk onder
invloed van het oestrogeen en progesteron, maar ook door prolactine, groeihormoon, insuline en
hormonen afgescheiden door de bijnieren. Het is pas na de eerste zwangerschap dat het
-3-
borstklierweefsel volledig morfologisch en functioneel ontwikkeld zal zijn [7, 8]. Figuur 2 geeft
de anatomische structuur van borstweefsel weer [8]. Borstweefsel is voornamelijk samengesteld
uit vet- en fibroglandulair weefsel. De verhouding waarin deze weefsels voorkomen is
afhankelijk van een aantal factoren waaronder leeftijd en hormonale regulatie. Het
fibroglandulair weefsel, ook wel borstparenchym genoemd, is samengesteld uit 15 tot 25 lobaire
septa die de borstklier opdelen in lobi. Deze worden van elkaar gescheiden door vet- en celrijk
bindweefsel. Elke klier eindigt in een ductus lactiferus, die vlak voor het uitmonden in de tepel
verbreedt in een sinus lactiferus [8].
Figuur 2: Anatomie van de borst [8].
Vanuit de ductus lactiferus lopen blind eindigende terminale ducti/lobulaire eenheden (TDLU).
Een TDLU vormt de structurele en functionele eenheid van de borst. Figuur 3A en B toont
respectievelijk een schematisch en histologisch overzicht van een TDLU [8]. In een actieve borst
zijn de TDLU’s voornamelijk opgebouwd uit clusters van kleine melkkliergroepen, de lobuli. De
lobuli zijn samengesteld uit trossen van klierblaasjes die acini worden genoemd, dewelke de
eigenlijke melkklieren zijn. In een inactieve borst bestaan de TDLU’s voornamelijk uit terminale
melkgangen of ducti. Zowel de lobuli als ducti worden omgeven door losmazig, lobulair (=
intralobulair) stroma [8, 9]. Afhankelijk van de locatie hebben de ducti een andere structuur
gaande van meerlagig plaveiselepitheel bij uitmonding in de tepel, over 2-lagig epitheel met
basaal kubische cellen bedekt met cilindrische epitheelcellen, tot 1-lagig kubisch of cilindrisch
epitheel in de TDLU’s. Naast de luminaire epitheliale cellaag, bevatten de TDLU’s ook een
discontinuë basale cellaag van contraherende myoepitheliale cellen [7, 8, 10]. Deze
-4-
myoepitheliale cellen vertonen veel vacuolen tijdens de vroege en late luteale fase van de
menstruele cyclus (dag 15-28) [11, 12]. De collecterende lobulaire ducti zorgen voor het transport
van de alveolaire secreties naar de ductus lactiferus. Rondom de TDLU’s ligt voornamelijk dens
lobair (= interlobulair) bindweefsel, dat overwegend is opgebouwd uit collageen (stevigheid van
de borst) en vetweefsel [8].
A
B
Figuur 3A. Schematisch overzicht van een TDLU; 3B. Histologisch kleuring (HE) van een TDLU [8].
De meest voorkomende borstkankers zijn invasieve ductale carcinomen (80%), gevolgd door
invasief lobulaire carcinomen (10%) [13]. Figuur 4 geeft een HE kleuring weer van een ductaal
invasief carcinoom. Hierop is te zien dat kankercellen een euchromatische kern hebben met veel
nucleoli, weinig cytoplasma en onregelmatig van vorm en grootte zijn. Naast tumorcellen worden
ook kernen van inflammatoire cellen en losmazig bindweefsel afgebeeld.
3
1
2
Figuur 4: HE kleuring op een invasief ductaal carcinoom. 1. Kankercellen met kernen met meerdere nucleoli, 2.
Inflammatiore cellen, 3. Losmazig bindweefsel. (Vergroting 40X).
-5-
1.3 Screeningsmammografie
Omdat borstkanker het meest frequent voorkomt in de leeftijdscategorie van 50 tot en met 69
jaar, biedt de Vlaamse overheid deze vrouwen sinds 15 juni 2001 gratis een 2-jaarlijkse
screeningsmammografie aan [14]. Mammografieën maken gebruik van ioniserende X-stralen en
laten toe om borstkanker vroegtijdig op te sporen en te behandelen, zodat een betere prognose en
reductie van mortaliteit kan bekomen worden. Vanaf de leeftijd van 50 jaar zijn de voordelen
hiervan reeds bewezen [5, 6, 15]. Door het intensief screenen van een asymptomatische populatie
worden echter ook borsttumoren opgespoord die heel traag groeien en nooit aanleiding zouden
geven tot symptomen of mortaliteit (overdiagnose). Soms worden ook letsels gezien op de
medische beeldvorming, daar waar eigenlijk geen kanker aanwezig is (vals-positieven). Beiden
vormen een actueel discussiepunt [16, 17].
Bij een mammografie wordt gebruik gemaakt van lage energie X-stralen met een piek en
gemiddelde foton energie van respectievelijk 30 kV en 15-20 keV [1]. Standaard worden 2
opnames gemaakt per borst, 1 in craniocaudale en 1 in medio-laterale oblique richting [18]. De
eenheid van geabsorbeerde stralingsdosis is de gray (Gy), waarbij 1Gy overeen komt met 1
joule/kilogram [18, 19]. Algemeen wordt aangenomen dat een dosis van 1-1,5 Gy X-stralen in
weefsel aanleiding geeft tot 1000 enkelstrengbreuken (SSB) en 50 tot 100 dubbelstrengbreuken
(DSB). De gemiddelde geabsorbeerde dosis, mean glandular dose (MGD), die wordt
geabsorbeerd door het borstklierweefsel bedraagt bij de klassieke scherm-film ongeveer
2,5mGy/view en bij de digitale mammografie ongeveer 2mGy/view [17, 18, 20, 21]. De MGD
kan echter door verschillende parameters worden beïnvloed. Hoge borstdensiteit, groter
borstvolume, te weinig borstcompressie en variaties in de set-up van de mammograaf kunnen de
MGD doen stijgen tot ongeveer 20mGy [21]. De klassieke scherm-film methode en digitale
mammografie kunnen als evenwaardig worden beschouwd voor het detecteren van borstkanker.
Digitale mammografie wordt echter wel aangeraden voor het screenen van jongere vrouwen met
dens borstweefsel [17]. Door het gebruik van ioniserende X-stralen bij een mammografie loopt
men steeds een beperkt risico op een stralingsgeïnduceerde borsttumor. Echter, door het
herhaaldelijk blootstellen van een groot deel van de bevolking, mag het gebruik van deze
ioniserende straling niet worden onderschat [1].
-6-
Alternatieven voor een screeningsmammografie bij vrouwen met een verhoogd risico
Voor vrouwen met een familiaal verhoogd of sterk verhoogd risico op borstkanker is het aan te
raden zich reeds intensief te laten opvolgen vanaf jongere leeftijd (20-30 jaar). De methode en de
frequentie van de follow-up is momenteel echter niet gestandaardiseerd en in de richtlijnen van
het Belgisch federaal kenniscentrum voor gezondheidszorg (KCE) staat niets vermeld over
mutatiedragers (BRCA1 en/of BRCA2) [22]. Men is op zoek naar optimale diagnostische tools
die per risicogroep zouden kunnen worden gebruikt. Voor vrouwen met een verhoogd familiaal
risico wordt een jaarlijkse mammografie vanaf de leeftijd van 40 jaar aanbevolen. Vanaf de
leeftijd van 50 jaar zouden deze vrouwen gewoon kunnen deelnemen aan het 2-jaarlijks
bevolkingsonderzoek. Vrouwen daarentegen met een sterk verhoogd familiaal risico raadt men
aan vanaf de leeftijd van 30 jaar of 5 jaar voor de leeftijd van het eerst gediagnosticeerde
familielid een magnetisch resonantie beeldvormingsonderzoek (MRI) te laten uitvoeren
gecombineerd met een mammografie. MRI maakt in tegenstelling tot mammografie gebruik van
radiofrequente pulsen. Het heeft een grotere gevoeligheid dan mammografie voor het opsporen
van invasieve borstkankers in bijna alle leeftijdsgroepen van personen die drager zijn van de
borstkanker predispositiegenen 1 (BRCA1) en/of 2 (BRCA2) [23]. MRI vormt dus een ideaal
beeldvormingsalternatief voor vrouwen met een verhoogd risico [22, 24]. Echografie daarentegen
maakt gebruik van geluidsgolven. Dit kan een alternatieve controle bieden voor het screenen van
vrouwen met een sterk verhoogd risico, naast mammografie of MRI [22].
1.4 Ioniserende straling (IR)
Er wordt een onderscheid gemaakt tussen 2 soorten IR: elektromagnetische straling (EMS)
enerzijds en corpusculaire straling anderzijds. EMS waaronder X- en γ-stralen worden het meest
gebruikt voor diagnostisch en therapeutische doeleinden zoals voor computed tomografie (CT),
conventionele en interventionele radiografie maar ook voor screeningsmammografieën [25].
Tabel 1 geeft de opeenvolgende effecten van ioniserende straling weer. Wanneer IR invalt op
weefsels ontstaan er ionisaties en excitaties, die op hun beurt zorgen voor fysico-chemische en
chemische interacties. Deze fysico-chemische en chemische interacties kunnen uiteindelijk
-7-
resulteren
in
biologische
effecten
waaronder
kanker.
De
meest
voorkomende
stralingsgeïnduceerde kanker is leukemie [26].
Tabel 1: Chronologie van stralingseffecten [26].
1.4.1 Deoxyribonucleïnezuur (DNA) schade geïnduceerd door IR
Figuur 5 geeft de verschillende soorten DNA schade weer, die kunnen ontstaan na blootstelling
aan IR [27]. Baseschade (mismatch, insertie, deletie), “bulky adducts”, SSB en DSB komen
hierbij het meest frequent voor, met een gemiddelde halfwaardetijd voor herstel van 1-5minuten
(min) voor baseschade, 5-10min voor SSB en 50min voor DSB [1, 18, 27]. “Bulky adducts”
ontstaan voornamelijk door blootstelling aan chemische mutagenen en ultraviolet (UV) straling
en worden hersteld via nucleotide excisie repair (NER). Baseschade en SSB worden meestal
efficiënt hersteld bij gezonde personen. Bij DSB worden beide strengen van de dubbele helix
verbroken waardoor er verlies van informatie optreedt in beide templates. Foutief of nietherstelde DSB kunnen hierdoor aanleiding geven tot celdood, puntmutaties en chromosomale
aberraties. Wanneer een puntmutatie voorkomt ter hoogte van een tumor suppressor gen of
oncogen kan dit aanleiding geven tot kanker. Over het algemeen zal de schade beperkt worden
door het stilleggen van de celcyclus ter hoogte van de celcyclus checkpoints, wanneer schade
wordt gedetecteerd. Zo krijgen cellen de tijd om de schade te herstellen vooraleer de celcyclus
-8-
verder gaat. Wanneer fouten niet kunnen worden hersteld zal de cel in apoptose gaan [1, 18, 25,
28-32].
Figuur 5: Meest voorkomende soorten van DNA schade: SSB, DSB, “bulky adducts” en baseschade (mismatch,
insertie, deletie) [27].
1.4.2 Lineaire energie transfer (LET)
De biologische effecten die optreden voor een bepaald type weefsel hebben geen directe link met
het gemiddelde aantal ionisaties, maar wel met de lokale ionisatiedichtheid. De gemiddelde
ionisatiedichtheid is gerelateerd aan de geabsorbeerde dosis, maar houdt geen rekening met de
LET. De lokale ionisatiedichtheid wordt echter wel gelinkt aan de LET [26]. De LET geeft de
hoeveelheid energie weer die wordt neergezet, onder de vorm van excitaties en/of ionisaties, per
eenheid van afgelegde weg en wordt uitgedrukt in keV/µm [33]. Standaard komt een LET van
250kVp X-stralen overeen met een weglengte van 2keV/ µm. De ionisatiedichtheid is omgekeerd
evenredig met de kinetische energie (Ekin) van de fotonen of partikels, waardoor de schade dus
het grootst zal zijn net voor het einde van de track, waar de Ekin het kleinst is [34]. IR met een
verschillende energie kan dus bij eenzelfde geabsorbeerde stralingsdosis zorgen voor een
verschillende ernst van schade [26, 33].
Lage LET straling
Lage LET straling, waaronder X-en γ-straling, veroorzaakt random geïsoleerde of verspreide
ionisaties ter hoogte van het DNA. De breuken die worden geïnduceerd zijn niet complex en
worden meestal enzymatisch hersteld. Op het einde van de track komen wel geclusterde
ionisaties voor. De dosis-respons curve, die de relatie tussen de dosis en een biologisch eindpunt
weergeeft, vertoont bij lage LET straling een lineair kwadratisch verloop (E=αD+βD2). Hierbij
stelt D de dosis voor en E het biologisch effect. De lineaire coëfficiënt α is klein voor lage LET
-9-
en is onafhankelijk van tijdsfactoren, terwijl de kwadratische coëfficiënt β2 wel afhankelijk is van
tijdsfactoren waaronder het dosistempo en/of fractionatie [1, 26, 33].
Hoge LET straling
Hoge LET straling daarentegen, waaronder snelle neutronen en alfadeeltjes, heeft een grotere
ionisatiedichtheid en wordt gekenmerkt door grote tot zeer grote ionisatieclusters en deltastralen.
De schade aan het DNA is hierdoor complexer, moeilijker te herstellen en leidt vaker tot foutief
of niet-herstelde DNA breuken. De dosis-respons curve voor hoge LET straling kent een lineair
verloop (E=αD), waarbij E eveneens het effect en D de dosis voorstelt. De lineaire component
αD is opnieuw onafhankelijk van tijdsfactoren [1, 26, 33].
Figuur 6A en B geeft respectievelijk het ionisatiepatroon van lage en hoge LET straling weer. De
zwarte stippen stellen de ionisatietracks voor [26].
A
B
Figuur 6: Ionisatiedistributie van een medium bestraald met lage LET (A) en hoge LET (B) [26].
1.4.3 Relatieve biologische effectiviteit (RBE)
RBE is de verhouding van de geabsorbeerde dosis van de referentiestraling op de geabsorbeerde
dosis van de straling die wordt getest en hetzelfde biologisch effect teweegbrengt in een bepaald
type van weefsel voor een bepaald eindpunt. Het is een parameter die toelaat om verschillen in
biologische effectiviteit van hoge of lage LET straling weer te geven, op een kwantitatieve
manier [26, 33].
Tegenwoordig zijn de risico’s in het lage dosis gebied enerzijds gebaseerd op extrapolaties van
data uit de “life span study“. Deze studie is uitgevoerd op overlevenden van Hiroshima en
Nagasaki die waren blootgesteld aan hoge energie
- 10 -
60
Co γ-stralen (2-5MeV). Anderzijds kunnen
de risico’s ook gebaseerd zijn op extrapolaties van andere epidemiologische data, die het effect
nagaan van X-stralen met een veel hogere energie dan deze gegeven bij een mammografie. Deze
extrapolaties worden gemaakt omdat de sample size te groot zou moeten zijn om risico’s met
voldoende statistische power te kunnen schatten in het lage dosisgebied [19, 23, 32, 35]. De
validiteit van deze extrapolaties, waarop het linear no treshold (LNT) model is gebaseerd, wordt
echter in vraag gesteld door het bystander effect en de adaptieve respons.
Het bystander effect veronderstelt dat bestraalde cellen signalen doorgeven aan niet-bestraalde
bystander cellen. Men veronderstelt dat dit enerzijds kan gebeuren door het vrijstellen van
oplosbare factoren, waaronder stikstofoxide en reactieve zuurstofradicalen, in het medium en/of
anderzijds via intercellulaire gap juncties via dewelke signalen worden doorgegeven aan nietbestraalde cellen. Via deze 2 mechanismen zouden ook niet-bestraalde cellen genetische
veranderingen ondergaan [32, 36]. De adaptieve respons daarentegen veronderstelt dat cellen die
op voorhand zijn blootgesteld aan lage stralingsdosissen meer resistent zullen zijn aan straling
wanneer ze hierna worden blootgesteld aan hogere dosissen [37].
Figuur 7 geeft het linear no treshold (LNT) model weer. Dit model is gebaseerd op extrapolaties
van data verkregen bij blootstelling aan hoge dosissen en veronderstelt dat alle straling schadelijk
is, onafhankelijk van de dosis. Deze veronderstelling komt echter niet overeen met deze van het
bystander effect en de adaptieve respons, waar het stralingsrisico bij blootstelling aan lage
dosissen respectievelijk hoger of lager zou liggen dan de lineaire respons [37, 38].
1
2
3
Figuur 7: Weergave van het LNT model: 1. Bystander effect, 2. Lineaire respons (LNT), 3. Adaptieve respons [37].
- 11 -
De internationale commissie voor radioprotectie (ICRP) veronderstelt een RBE van 1 voor alle
lage LET straling [1, 18, 32, 35]. Hierdoor worden zowel 30kV X- als
60
Co γ-stralen met een
respectievelijke energie van 15-20 keV en 1,22 MeV beschouwd als lage LET straling. Echter, uit
meerdere studies blijkt dat de RBE voor 30kV X-stralen een waarde van 1 tot 6 zou kunnen
benaderen, voor verschillende biologische eindpunten. Op die manier zouden lage energie Xstralen efficiënter geclusterde DNA schade kunnen induceren in vergelijking met hogere energie
X-stralen of 60Co γ-stralen [1, 15, 18, 23, 32, 35, 39, 40]. Afhankelijk van de energie van de lage
LET straling zouden er dus wel verschillen kunnen zijn in het induceren van DNA schade [1, 18,
32]. Ook het internationale atoomenergie agentschap (IAEA) haalt aan dat X-stralen in het
algemeen 2 à 3 keer effectiever dan γ-stralen [41].
1.4.4 Detectie over inductie ratio (DIR)
Wanneer IR wordt gebruikt voor diagnostische of therapeutische doeleinden kunnen deze worden
geassocieerd met de inductie van tumoren. Daarom is het van belang de voordelen en risico’s
goed in te schatten en tegen elkaar af te wegen [39]. Dit kan worden benaderd door het berekenen
van de DIR. De DIR stelt de verhouding voor van het aantal borstkankers die worden
gedetecteerd ten opzichte van het aantal borstkankers die worden geïnduceerd door het screenen
zelf. Het aantal stralingsgeïnduceerde borstkankers (30kV X-stralen) hangt samen met de RBE,
die door het ICRP wordt beschouwd als 1 voor alle lage LET straling (zie 1.4.3). Het aantal
gedetecteerde borstkankers moet vanzelfsprekend hoger liggen dan het aantal geïnduceerde
borstkankers. Hoeveel hoger dat aantal moet liggen is nog steeds onderwerp van discussie. Een
DIR boven de 100, voor vrouwen ouder dan 50 jaar die zich 2-jaarlijks laten screenen, wordt
door de meeste internationale screeningsprogramma’s aanvaard [1]. Aangezien de RBE van
30kV X-stralen voor verschillende eindpunten met een factor 1 tot 6 zou kunnen worden
onderschat (zie 1.3.4), heeft dit een impact op de DIR. Deze zou op die manier met een factor 1
tot 6 kunnen worden overschat, wat gevolgen heeft voor de rechtvaardiging van de routine
screeningsmammografieën. Deze gevolgen zijn voornamelijk van belang voor hoog-risico
patiënten met mutaties in onder andere BRCA1 en/of BRCA2, maar ook voor wanneer men zou
beslissen de leeftijd voor het starten van de bevolkingsscreening uit te breiden naar 40 jaar of
jonger [1, 15, 35].
- 12 -
1.5 Cellulaire respons op DNA schade
1.5.1 Herstelmechanismen voor DNA DSB
Het genoom van eukaryoten staat voortdurend onder stress. Deze stress wordt veroorzaakt door
zowel endogene (reactieve zuurstof partikels) als exogene factoren (IR). Dit heeft tot gevolg dat
het DNA continu wordt beschadigd en deze schade moet worden herkend en hersteld [32]. Per
celcyclus worden ongeveer 50 DNA DSB geïnduceerd, dewelke minder complex zijn dan de
stralingsgeïnduceerde DSB. Om ervoor te zorgen dat de integriteit van het genoom bewaard
blijft, bestaan er daarom verschillende herstelmechanismen en celcyclus checkpoints [42].
Enzymatische herstelmechanismen die fundamenteel zijn voor het herstel van DNA schade zijn
homologe recombinatie (HR) en niet homologe endjoining (NHEJ). Deze 2 mechanismen
verschillen essentieel in hun accuraatheid voor herstel en noodzaak voor homologie. Wanneer de
DNA schade te complex is, kan apoptose optreden [26, 29, 33, 43, 44].
Homologe recombinatie (HR)
Voor het herstel van DNA DSB via HR zijn er grote gebieden van homologie nodig vooraleer de
breuk accuraat kan worden hersteld. Herstel via HR zal daarom enkel gebeuren in de
aanwezigheid van het intacte homoloog chromosoom of het niet-beschadigde zusterchromatide.
Het is voornamelijk van belang voor het herstel van DSB bij gisten en bacteriën. Bij dierlijke
cellen speelt HR enkel een rol in de late synthese en Gap-2 fase van de celcyclus [31, 32, 45, 46].
Figuur 8A geeft het herstelmechanisme van HR weer [47]. Wanneer een DSB optreedt zal de
celcyclus worden stilgelegd door het Ataxia Telangiectasia mutated (ATM) kinase. Vervolgens
worden de vrije uiteinden van de DSB opgespoord door het MRE11/RAD50/NBS1 (MRN)
eiwitcomplex. Het MRE11 heeft een endonuclease activiteit die 3’ SSB DNA uiteinden vormt.
Deze endonuclease activiteit wordt gereguleerd door het CtBP proteïne, dat in normale
omstandigheden afhankelijk is van het BRCA1 en het ATM. Hierna worden hSSB1 moleculen
aangetrokken, die vervolgens worden verdrongen door het replicatie proteïne A (RPA). Het
BRCA1/partner and localizer of BRCA2 (Palb2) complex rekruteert daarna het eiwitcomplex
RAD52/BRCA2/RAD51/RAD54 naar de SSB. Op die manier wordt het RPA vervangen door het
RAD51, wat zorgt voor stabilisatie van de streng. RAD51 gaat tevens op zoek naar de homologe
- 13 -
sequentie in het homoloog zusterchromatide en versnelt de invasie zodat een Holliday junction
kan gevormd worden. Cohesines helpen het RAD51, door ervoor te zorgen dat de
zusterchromatiden voldoende dicht bij elkaar worden gebracht. RAD52 heeft een protectieve
functie en bindt direct aan de SSB om exonuclease tegen te gaan. Als laatste zal het DNA
polymerase δ zorgen voor de synthese van de ontbrekende DNA moleculen, wordt de Holliday
junction afgebroken door resolvasen en worden de DNA uiteinden aan elkaar gezet door ligasen
[10, 15, 31, 26, 47].
Niet homologe endjoining (NHEJ)
Voor het herstel van DNA DSB via NHEJ is er weinig homologie nodig. Bijgevolg zal het
herstel veel sneller, maar minder accuraat gebeuren dan bij HR. Het is het belangrijkste
herstelmechanisme voor stralingsgeïnduceerde DNA DSB in dierlijke cellen [44]. Hoewel NHEJ
overal actief is in de celcyclus, zal het toch voornamelijk zorgen voor herstel in de Gap 0-, Gap
1- en de vroege synthese fase van de celcyclus. Naast herstel van DSB is het NHEJ ook essentieel
voor class-switching tussen immunoglobulines en verantwoordelijk voor de somatische
herschikkingen van het TCR-, IGH- en IGL loci bij de ontwikkeling van T-en B cellen [43-46].
Figuur 8B geeft het herstelmechanisme van NHEJ weer [47]. Wanneer een stralingsgeïnduceerde
DSB ontstaat, zal binnen enkele seconden (sec) het ringvormig, heterodimeer eiwitcomplex
Ku70/80 worden aangetrokken. Vervolgens worden 2 DNA afhankelijke proteïne kinase
catalytische subunits (DNA-PKcs) gerekruteerd, elk naar een uiteinde van de DSB, via binding
met de carboxy-terminus (C-terminus) van het Ku80. Hierdoor komen de DNA uiteinden dichter
bij elkaar en worden de 2 DNA-PKcs geactiveerd. Wanneer deze 2 moleculen worden
geactiveerd en de DNA uiteinden dicht genoeg bij elkaar worden gebracht, vindt autofosforylatie
en fosforylatie van DNA-PKcs door ATM en ATM rad-3 verwanten (ATR) plaats. Daar
stralingsgeïnduceerde DSB vaak fosfaten en fosfoglycolaten aan hun 3’ uiteinden bevatten, is het
nodig dat het polynucleotide kinase (PNK), fosfatase en Werner’s syndroom helicase (WRN)
worden geactiveerd, vooraleer er DNA ligatie kan plaatsvinden. Andere sleutelmoleculen die van
belang zijn voor het herstel via NHEJ zijn het Artemis, het X-straal herstel cross-complementing
proteïne 4 (XRCC4) en het DNA ligase IV [47]. Het PNK wordt gefosforyleerd, door een nog
- 14 -
onbekend kinase, na blootstelling aan IR en is betrokken bij het verwijderen van DNA uiteinden
die anders niet opnieuw aan elkaar zouden kunnen worden gezet. Het WRN is een RecQ helicase
en zorgt eveneens voor de bewerking van DNA uiteinden, dewelke anders niet aan elkaar kunnen
worden gezet. Artemis is een 5’-3’ exonuclease, maar in de aanwezigheid van DNA-PKcs en
adenosinetrifosfaat krijgt het een endonuclease activiteit. De aprataxin en PNK-like factor
(APLF) heeft eveneens zowel een endo- als exonuclease activiteit. Deze factor wordt
gefosforyleerd door het ATM en gaat een reactie met het Ku aan. Algemeen treedt bij knockdown
van het PNK, APLF en WRN een verhoogde stralingsgevoeligheid op, worden er minder DSB
hersteld en is men bijgevolg gevoeliger voor het ontwikkelen van kanker. Downstream in de
cascade van NHEJ zijn het XRCC4 en ligase IV van belang. Het XRCC4 heeft geen
enzymatische functie maar wel een α-helicale regio, dewelke bindt met een regio tussen de 2 Cterminale BRCT domeinen van het DNA ligase IV. Hierdoor ontstaat een stabiel complex en
kunnen de uiteinden van het DNA aan elkaar worden gezet via het DNA ligase IV [25, 31, 44,
45, 47-50].
- 15 -
A
B
Figuur 8: Herstel van DNA DSB via HR (A) en via NHEJ (B). A. Bij HR wordt de celcyclus stilgelegd door het
ATM. Na herkenning van de vrije DNA uiteinden wordt het MRN eiwitcomplex aangetrokken. Dit complex heeft
een exonuclease activiteit en zorgt ervoor dat 3’ uiteinden worden vrijgemaakt. Vervolgens wordt naar deze
uiteinden het multimeer eiwitcomplex RAD52/BRCA2/RAD51/RAD54 aangetrokken. Het RAD51 zorgt voor
invasie van de gebroken streng in het homoloog zusterchromatide zodat een Holliday junction kan gevormd worden.
Tenslotte zullen DNA polymerasen zorgen voor de DNA synthese en wordt de DSB hersteld, B. Bij NHEJ wordt het
heterodimeer Ku70/80 aangetrokken en worden DNA-PKcs gerekruteerd om de vrije DNA uiteinden te stabiliseren.
Verschillende sleuteleiwitten zoals het WRN, APLF, Artemis en PNK spelen een rol bij het bewerken van de DNA
uiteinden zodat uiteindelijk door het XRCC4 en DNA ligase IV de breuk kan worden hersteld [47].
- 16 -
1.5.2 Repair kinetiek van DNA DSB
Uit analyses van gelelektroferese en γ-H2AX foci testen blijkt dat het herstel van
stralingsgeïnduceerde DSB bifasisch verloopt, zowel voor cellen die zich bevinden in de Gap 0-,
Gap 1- als in de Gap 2-fase. Hierbij doet een eerste, snelle herstelcomponent zich voor gedurende
de eerste 2-3 uur na bestraling en een tweede, tragere herstelcomponent zich voor tot 24 uur na
bestraling. Eveneens werd opgemerkt dat DSB in de euchromatische regio's sneller worden
hersteld dan DSB in heterochromatische regio's, waarbij bijkomende signalisatie nodig is van
onder andere het ATM en 53BP1. Verschillende studies stellen ook vast dat repair via NHEJ de
snelle component vertegenwoordigt in de G1-en G2-fase en dat repair via HR de trage
component in de G1- en G2-fase vertegenwoordigt. Bijgevolg zal HR voornamelijk gebruikt
worden voor het herstel van DSB in de heterochromatine regio's en NHEJ voor het herstel van
DSB in de euchromatine regio's. Algemeen werd vastgesteld dat HR en NHEJ eerder zullen
samenwerken dan in competitie te treden met elkaar, zodat wanneer een fout optreedt in 1 van de
2 pathways, dit kan gecompenseerd worden door een verhoogde activiteit van de andere pathway
[32, 48, 50].
1.5.3 BRCA1 en BRCA2
BRCA1, gelegen op chromosoom 17q, en BRCA2, gelokaliseerd op chromosoom 13q, zijn
belangrijke onderdelen van multimere eiwitcomplexen die worden aangetrokken bij het herstel
van DNA DSB [24, 25, 51]. BRCA1 is een zeer groot gen (1863 aminozuren), dat codeert voor
verschillende proteïnen. Naast een rol in de repair van DNA DSB, speelt BRCA1 ook een rol bij
NER en het controleren van de celcyclus checkpoints [50-52]. Het BRCA2 is een nog groter gen
(3418 aminozuren), maar hiervan zijn minder motieven gekend [50]. Wanneer mutaties
voorkomen in deze tumor suppressor genen, die zowel instaan voor signalisatie als repair van de
DNA schade, leidt dit tot genoominstabiliteit [18]. Dit zorgt voor een grotere gevoeligheid aan
straling, maar ook aan cytostatica en geeft bijgevolg aanleiding tot een verhoogde
kankerpredispositie [53]. Ongeveer 5% van alle borstkankers ontstaan door mutaties in de
autosomaal dominante BRCA1 en/of BRCA2 genen [17]. Vrouwen met een BRCA1 en/of
BRCA2 mutatie hebben respectievelijk 60-80% kans en 50-70% kans om borstkanker te
ontwikkelen voor de leeftijd van 70 jaar. Mannen met een BRCA1 en/of BRCA2 mutatie hebben
respectievelijk 1-5% kans en 5-10% kans om borstkanker te ontwikkelen voor de leeftijd van 70
- 17 -
jaar [24, 25, 51]. Vrouwen die drager zijn van een BRCA1 en/of BRCA2 mutatie lopen eveneens
een groter risico op het ontwikkelen van ovariumkanker (20-45% BRCA1, 10-20% BRCA2) en
vrouwelijke dragers van een BRCA1 mutatie lopen eveneens voor de leeftijd van 50 jaar een
verhoogd risico op colonkanker [54]. Mannen met een BRCA2 mutatie hebben 25% meer kans
op de ontwikkeling van prostaatkanker. Tot slot lopen zowel mannelijke als vrouwelijke dragers
met een BRCA1 en/of BRCA2 mutatie een beperkt risico op pancreaskanker (2-3% BRCA1, 35% BRCA2) [24, 25, 50, 51].
Het is moeilijk om vrouwen met een verhoogd risico op borst-of ovarium kanker te detecteren
omdat enerzijds het verlies van 1 functionerend kopie van BRCA1 en/of BRCA2 klinisch niet
uitgesproken is en anderzijds de huidige tools die testen op haploïnsufficiëntie niet precies
genoeg zijn om mutaties direct op te sporen aan de hand van perifere bloed lymfocyten (PBL).
Daarom zullen personen die familiaal belast zijn meestal geïdentificeerd worden wanneer zijzelf
of een familielid een typische kanker ontwikkelen [51]. Bij niet-familiale, sporadische vormen
van borstkanker zijn er geen mutaties aanwezig in de BRCA1 en/of BRCA2 borstkanker
predispositie genen [25].
Het BRCA1 proteïne bevat een RING domein, gelegen aan de aminoterminus, dat sterk
geconserveerd is en een coiled-coil domein + tandem BRCT, gelegen aan de C-terminus. Deze
domeinen zijn essentieel voor herstel via HR en signalisatie van DNA schade. Onder normale
omstandigheden komt het BRCA1 voor als heterodimeer met een ander RING/BRCT domein
bevattend proteïne, het BRCA1 geassocieerd RING domein proteïne 1 (BARD1). Wanneer het
BARD1 echter niet aanwezig is, wordt het BRCA1 onstabiel en snel gedegradeerd. Tevens kan
het BRCA1 zijn functie als herstelmechanisme slechts uitoefenen wanneer het in staat is om
chromatine domeinen met DSB te herkennen. Hiervoor zijn de BRCT herhalingen essentieel [5052].
Wanneer IR DNA DSB induceert, vormt het heterodimeer complex BRCA1/BARD1 een aantal
proteïne supercomplexen, waaronder het BRCA1/C-terminaal bindingsproteïne interactie
proteïne/MRN complex. Deze werken samen om SSB te initialiseren aan DSB uiteinden.
BRCA1, via Palb2 gekoppeld aan BRCA2, is eveneens nodig voor het rekruteren van het RAD51
- 18 -
en het genereren van het RAD51 nucleoproteïne filament. Echter, wanneer een mutatie voorkomt
in het BRCA1, kan het PALB2 niet binden aan het BRCA1, waardoor het herstel via HR niet kan
doorgaan [50, 51]. BRCA1 zou eveneens betrokken zijn bij herstel via NHEJ, voornamelijk
tijdens de complexvorming van het Ku70/80 en/of tijdens de complexvorming van XRCC4/ligase
IV. Hierover is men echter nog niet zeker, verder onderzoek is aangewezen [50].
BRCA2 bevat 8 BRCT herhalingen die elk een RAD51 kunnen binden en staat eveneens in voor
het herstel van DNA schade, voornamelijk via HR. Wanneer het BRCA2 gemuteerd is, zal geen
RAD 51 worden aangetrokken naar het beschadigde DNA en bijgevolg de HR gecompromitteerd
worden [50].
1.5.4 γ-H2AX foci test
De γ-H2AX foci test is een zeer specifieke en gevoelige biomerker die toelaat om DNA DSB,
zowel in vitro als in vivo, te detecteren en te kwantificeren in het zeer lage dosisgebied, zoals
gegeven bij een mammografie [18, 32, 55]. Het humane DNA is georganiseerd in een compacte
structuur zodat het zou passen in de kern van de cel. Het windt zich op rond acht histoneiwitten
(= nucleosomen), die op hun beurt verder condenseren met vorming van het chromatine. Een
nucleosoom bestaat uit 8 histoneiwitten, 2 van elk van de 4 histoneiwit families (H4, H3, H2B en
H2A) [56].
Als cellulaire respons op een stralingsgeïnduceerde DSB bindt het MRN eiwitcomplex aan beide
uiteinden van de breuk (zie 1.4.1). Het MRN eiwitcomplex rekruteert het wild-type ATM [57].
De 3 leden van de fosfatidylinositol 3-kinase like kinase familie (PI3KK), zijnde DNA-PK, ATM
en ATR staan in voor de fosforylatie van het sterk geconserveerde serine 139, ter hoogte van de
C-terminus van het nucleosomaal histon proteïne H2AX. Dit histon wordt na fosforylatie ɣH2AX genoemd [56-59]. Vorming van deze γ-H2AX foci vindt plaats binnen de eerste sec en
bereikt een maximum na 15-30min postbestralingstijd [32, 56, 59]. Dit geeft aanleiding tot het
rekruteren van het MDC1 en zorgt voor verdere signalisatie. Vervolgens kunnen via het MDC1
MRN eiwitten worden aangetrokken en gebonden aan het DNA. Via deze interacties wordt er in
beide richtingen van de breuk meer MRN en ATM aangetrokken en gebonden, zodat de naburige
H2AX-histonen ook worden gefosforyleerd. Rond de DSB worden op die manier 1000’en
H2AX-histonen gefosforyleerd, met ongeveer een omvang van 2 megabaseparen, die samen 1
- 19 -
focus vormen [32, 58, 59]. Er is bewijs dat 1 γ-H2AX focus kwantitatief overeenkomt met 1
DNA DSB in niet-delende cellen [32, 60]. Figuur 9 geeft de MDC1 gereguleerde H2AX
fosforylatie weer [57].
Figuur 9: MDC1 gereguleerde H2AX fosforylatie [57].
Meerdere studies onderzochten reeds het effect van straling in het lage dosis gebied aan de hand
van de γ-H2AX foci test. Deze onderzoeken werden voornamelijk uitgevoerd op cellen
waaronder PBL, humane fibroblasten en geïsoleerde epitheelcellen van de borst [1, 18, 32, 36,
61]. De γ-H2AX foci test wordt eveneens gebruikt om de repair kinetiek van DNA DSB na te
gaan. Residuele DSB die overblijven na 24 uur geven immers een idee over het aantal resterende,
nog niet-herstelde DSB [18, 32, 38].
1.6 Doelstelling
Het doel van dit onderzoek is nagaan of een dosis van enkele mGy, zoals gegeven bij een
mammografie, resulteert in waarneembare stralingsgeïnduceerde ɣ-H2AX foci in gezond
borstweefsel. Het aantal foci geïnduceerd door 30kV X-stralen zal vergeleken worden met het
aantal geïnduceerd door
60
Co γ-stralen (referentie). Aan de hand van deze resultaten kan een
dosis-respons curve worden opgesteld, wat toelaat om de RBE te berekenen. De repair kinetiek
zal eveneens worden onderzocht na bestraling met 4 en 40mGy en een postbestralingstijd van
30min en 24uur, voor beide stralingskwaliteiten. Om het aantal DNA DSB te kwantificeren zal
- 20 -
gebruik gemaakt worden van de zeer gevoelige en specifieke ɣ-H2AX foci test. In dit onderzoek
wordt gewerkt met vers gedisseceerd borstweefsel, in tegenstelling tot voorgaande studies die
gebruik maakten van cellen of cellijnen [1, 18, 32, 36, 39]. Bijgevolg zou deze studie moeten
leiden tot een betere risico-inschatting voor het gebruik van 30kV X-stralen.
2. Materialen en Methoden
2.1 Onderzoekspopulatie
Deze studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van het UZ Gent en uitgevoerd op
gezond borstweefsel. Dit gezond borstweefsel is afkomstig van vrouwen die 1. een borstreductie
lieten uitvoeren, 2. preventief een mastectomie lieten uitvoeren omdat ze asymptomatisch drager
zijn van een BRCA1 of BRCA2 mutatie of omdat ze familiaal belast zijn, 3. een mastectomie
lieten uitvoeren omdat borstkanker werd vastgesteld. Om dit weefsel te mogen gebruiken voor
onderzoek werd een informed consent van alle patiënten verkregen, nadat aan hen de volledige
opzet van de studie werd medegedeeld. Uit het verkregen borstweefsel werd het overtollige
vetweefsel verwijderd, zodat overwegend bindweefsel met daarin klierweefsel overbleef. Het
versnijden van het weefsel, met pincet en schaar, gebeurt in een petrischaal (Greiner bio-one,
Wemmel, België), waarbij het borstweefsel vochtig wordt gehouden met een ringer oplossing
(kamertemperatuur). In bijlage 1 wordt de samenstelling van ringer weergegeven. Het
fibroglandulair weefsel wordt na het snijden in 6 well-platen (Greiner bio-one) gelegd. De 6 wellplaten worden gevuld met voorverwarmd medium (37°C), dat gebruikt wordt voor culturen van
humane borstepitheel cellijnen (MCF10A), tot 2 mm laagdikte. In bijlage 2 wordt de
samenstelling van het medium weergegeven.
Aanvankelijk zou de McIlwain tissue chopper (Goose Green, United Kingdom) of de Microm
vibratoom (Walldorf, Duitsland) worden gebruikt om uniforme weefselstukken van 1 à 2 mm te
kunnen snijden. Figuren 10 en 11 geven deze snijtoestellen respectievelijk weer. Deze werden op
voorhand uitgetest op nier- en leverweefsel van de muis en leverden mooie sneden op. Wanneer
deze toestellen echter gebruikt werden voor het snijden van borstweefsel bleek het
fibroglandulair weefsel een te rigide structuur te hebben om in uniforme sneden te kunnen
- 21 -
snijden. Daarom werd er beslist om het weefsel met een pincet en schaar in plakken te snijden
van maximaal 2 mm dik.
Figuur 10: Chopper.
Figuur 11: Vibratoom.
2.2 Bestraling + incubatie
De borstweefselsneden van 2mm (in medium, in 6-well plaat) werden in vitro bestraald in het
INW, Instituut voor Nucleaire Wetenschappen (Prof. H. Thierens). De bestraling gebeurde met
een Siemens Mammomat3 mammograaf (Siemens, Brussel, België) en een
60
Co-bron als
referentie. De dosissen waarmee het borstweefsel werd bestraald zijn 0; 2; 2+2; 4; 10; 20; 40-en
100mGy, zodat een representatieve dosis-respons curve kan worden opgesteld in het lage dosis
gebied. De
60
Co-γ stralen werden toegediend aan een dosistempo van 0,00484 Gy/min in een
voorverwarmd waterbad (37°C). De mammograaf produceerde een 30 kV Mo/Mo X-straal
spectrum aan een dosistempo van 0.125 Gy/min en werd uitgevoerd in een voorverwarmde
polymethylmethacrylaat bak (PMMA, 37°C). Tabel 2 geeft de ingestelde parameters weer. Na
het in vitro bestralen, zowel met
60
Co bron als met de mammograaf, werden alle
borstweefselsneden gedurende 30min geïncubeerd in een CO2 incubator (Thermo Scientific,
5%CO2, 37°C). Na 30min incubatie werden de bestraalde sneden in een 6 well-plaat (Greiner
bio-one) gelegd, gevuld met koude ringer en op ijs geplaatst om het DNA herstel proces te
stoppen [1]. De sneden die bestraald werden met 4 en 40mGy, evenals de controle stalen van
0mGy, werden naast 30min ook nog 24uur geïncubeerd. Na 24uur werden deze stalen eveneens
- 22 -
in 6-well platen (Greiner bio-one) overgebracht, gevuld met koude ringer en op ijs geplaatst
gedurende 10min. Op die manier krijgen de cellen de tijd om de stralingsschade zoveel mogelijk
te herstellen en kan de repair kinetiek worden onderzocht.
Tabel 2: Parameters Siemens Mammomat 3 mammograaf.
Dosis
kV mAs
Samenstelling
(mGy)
0
0
0
/
2
30
7
5+2
4
30
14
10+4
10
30
35
25+10
20
30
69
45+22+2
40
30
138
110+28
100
30
346
250+80+16
2.3 Fixatie
Fixeren van het borstweefsel is nodig om dynamische processen in de cel stil te leggen en zoveel
mogelijk de oorspronkelijke morfologie te bewaren. De coupes worden hiervoor 24 uur op 4°C in
4% neutraal gebufferde formol (NGF) gebracht. De samenstelling van het 4% NGF wordt
weergegeven in bijlage 3.
2.4 Inbedden + weefselcoupes snijden
Na het fixeren van het borstweefsel volgt het inbedden in paraffine (Thermo Scientific, Aalst,
België). Vooraleer er kan worden ingebed in paraffine is het nodig dat het weefsel wordt
ontwaterd, via een stijgende alcoholreeks. Omdat alcohol niet oplosbaar is in paraffine worden de
weefselstukken geïncubeerd in achtereenvolgens: isopropyl alcohol, isopropyl alcohol/toluol en
als laatste in toluol. Bijlage 4 geeft het protocol weer dat gebruikt werd voor de manuele
inbedding. Na overnachting van het weefsel in de paraffinecups worden de borstweefselstukken
georiënteerd en gedurende 2uur in de koelkast geplaatst (4°C). Dit is nodig om de paraffine
voldoende te laten uitharden. Hierna wordt het weefsel ingebed in paraffine uit de cups gehaald,
op houten blokken gezet en opnieuw gedurende 2uur in de koelkast geplaatst. Vervolgens worden
coupes van 5µm gesneden.
- 23 -
2.5 γ-H2AX foci test
De ɣ-H2AX foci test is een zeer gevoelige, specifieke moleculaire test die het toelaat om DNA
DSB te kwantificeren bij lage stralingsdosissen [1].Op basis van de bekomen resultaten van de ɣH2AX foci test kan een dosis-respons curve worden opgesteld voor 30kV X-en
60
Co γ-stralen,
waaruit de RBE kan worden berekend. Er zal in deze studie ook onderzocht worden vanaf welke
dosis ɣ-H2AX foci te zien zijn (drempeldosis) en hoe het herstel van DNA DSB verloopt na 24
uur.
2.5.1 Haematoxyline-eosine (HE) kleuring
Alvorens een γ-H2AX foci kleuring uit te voeren, wordt eerst een standaard haematoxyline (1/4
mayer, VWR®) eosine-pfloxine (Thermo Scientific) kleuring uitgevoerd. Op die manier kan
worden nagegaan of er voldoende klierbuizen in de coupes aanwezig zijn en een γ-H2AX foci
kleuring zinvol is. Bijlage 5 geeft het HE protocol van het kleurtoestel Microm HMS 740 weer.
2.5.2 Immunohistochemische kleuring
Immuno-enzymatische kleuring
De 2 meest gebruikte methodes om antigen - antilichaam complexen te visualiseren zijn immunofluorescente en immuno-enzymatische kleuringen. Meerdere onderzoeks-protocollen, zowel
immuno- fluorescente als immuno-enzymatische, werden uitgetest op coupes van staal 01
(10/05/2012, gezond weefsel), met als doel een geoptimaliseerd protocol te bekomen.
Optimalisatie anti ɣ-H2AX antilichaam protocol
Tijdens de onderzoeksstage en gedurende het thesisjaar werden verschillende zaken om de
indirecte,
enzymatische
immunohistochemische
kleuring
te
optimaliseren,
uitgetest.
Verschillende verdunningen werden uitgeprobeerd voor het muis anti-γ-H2AX antilichaam
(613401, Biolegend, Erembodegem, België) namelijk 1:1000, 1:500 en 1:200. Meerdere
tegenkleuringen met onder andere haematoxyline (1.09249, VWR®), toluïdine blauw (34187.185,
VWR®), methylgroen (1.0314, VWR®) en lichtgroen (L-5382, Sigma-Aldrich®) werden
- 24 -
eveneens uitgetest. Als kleurloos chromogeen substraat werden het 3,3'-diaminobenzidine (DAB,
D5637, Sigma-Aldrich®) en het DAB-Nickel(II)chloride hexahydraat (NiCl2, Merck, Darmstadt,
Duitsland) uitgetest. Voor het DAB werden incubatietijden van 5 en 10min uitgetest.
Het geoptimaliseerde protocol zoals gebruikt in dit onderzoek:
1. Deparaffineren van de coupes met het kleurtoestel Microm HMS 740 (Robot-Stainer,
Walldorf, Duitsland) en afgrenzen van de weefselcoupes met een Dako pen (Dako, Heverlee,
België). Bijlage 6 geeft het protocol voor het deparaffineren van het kleurtoestel Microm
HMS 740 weer.
2. Immunohistochemische kleuring:
• Voorbehandeling van de coupes, in het donker, met 3% H2O2 (1.06172, VWR®), gedurende
10min.
• Toevoegen van 100µl blokkingsserum (BS) op de coupes, gedurende 30 min op
kamertemperatuur. Tabel 3 geeft de samenstelling van het BS weer.
• 1ste stap. Aanbrengen van 100µl muis anti-γ-H2AX antilichaam, 1:500 verdund in
verdunningsbuffer (VB), gedurende 2uur op kamertemperatuur. Hierna worden de coupes 2
keer gewassen met een fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), telkens 5min. De VB bestaat
uit 9 delen PBS en 1 deel BS. Tabel 3 geeft de samenstelling van het PBS weer.
• 2de stap. Aanbrengen van 100µl gebiotinyleerd rabbit anti-muis antilichaam (biot-RAM, E0413,
Dako), 1:200 verdund in VB, gedurende 30min op kamertemperatuur. Hierna worden de
coupes opnieuw 2 keer gewassen met PBS, telkens 5min.
• 3de stap. Aanbrengen van 100µl streptavidine-horse radish peroxidase (strep-HRP, P0397,
Dako), 1:200 verdund in PBS. Dit ook 30min laten incuberen op kamertemperatuur. Daarna 3
keer wassen met PBS, telkens 5min.
• Aanbrengen van 100µl DAB-NiCl2, gedurende 10min op kamertemperatuur in het donker,
10min spoelen met stromend leidingwater, 2 à 3 min spoelen met gedestilleerd water. Tabel 3
geeft de samenstelling van de stock-en werkoplossing van het DAB en het NiCl2 weer.
- 25 -
3. Tegenkleuring van de paraffine coupes gebeurt met toluïdine blauw (VWR®, 0,5%+1%
ijsazijn (Chemlab), gedurende 10sec. Hierna wordt 2 keer 30sec gespoeld in gedestilleerd
water.
4. Manueel ontwateren van de coupes in een stijgende alcoholreeks (70%, 2 keer 96%) en
eindigen in toluol (telkens 2min). Bijlage 4 geeft de firma en het catalogusnummer van deze
producten weer. Na het ontwateren wordt er op de coupes mounting media (Thermo
Scientific) aangebracht en worden ze afgedekt met een dekglas (knittel glass, Duitsland).
Tabel 3: Samenstelling 1l PBS, BS en DAB/ NiCl2 stock-en werkoplossing.
Producten
Firma
Catalogusnummer
Hoeveelheid
PBS (pH: 7,2)
Natriumwaterstoffosfaat
(Na2HPO4)
VWR®
1.06580
1,780 g
Kaliumwaterstoffosfaat
(KH2PO4)
VWR®
1.04873
0,420 g
Natriumchloride (NaCl)
Sigma-Aldrich®
S-9888
7,200 g
Gedestilleerd water
/
/
1,000 l
PBS (PH:7,2)
UGent
Zie boven
0,005 l
Roche diagnostics
(Vilvoorde, België)
10 735 086 001
BSA
NRS
DAKO
X0902
250,0 x10^-6 l
VWR
161-0781
100,0 x10^-6 l
DAB
Sigma-Aldrich®
D5637
0,025 g
Gedestilleerd H2O
/
/
0,001 l
NiCl2
VWR®
1.06717
4,000 g
Gedestilleerd H2O
/
/
0,050 l
DAB
Sigma-Aldrich®
D5637
200,0 x10^-6 l
PBS (PH:7,2)
Zie boven
BS
Tween 20 (10%)
®
0,050 g
DAB (stockoplossing)
NiCl2 (stockoplossing)
DAB- NiCl2 (werkoplossing)
NiCl2
H2O2 (30%)
Zie boven
0,010 l
®
1.06717
50,00 x10^-6 l
®
1.06172
4,170 x10^-6 l
VWR
VWR
- 26 -
2.5.3 Visualisatie en analyse van de γ-H2AX foci
De γ-H2AX foci worden lichtmicroscopisch geëvalueerd (Leica LEITZ-DMRB, Diegem,
België), bij een vergroting van 63X. Door optimalisatie van het immunohistochemisch kleuringsprotocol werd een minimum aan achtergrond verkregen, zodat de foci zo duidelijk mogelijk
kunnen worden gevisualiseerd. Het gemiddelde aantal foci/cel is immers een belangrijke maat om
stralingsschade op te meten. De foci worden enkel in de luminaire epitheelcellen van de TDLU’s
gescoord, aangezien deze het meest betrokken zijn bij het ontstaan van borstkanker [13]. Om een
objectieve telling uit te voeren, worden de coupes gecodeerd en wordt de scoring uitgevoerd door
2 personen. Per coupe worden de γ-H2AX foci gescoord in gemiddeld 4 klierbuisgroepen zodat
ongeveer 200cellen/coupe/scorer en dus ongeveer 400 cellen/slide in het totaal worden geteld
(figuur 12).
Slide
Coupe 1
1
200
Coupe 2
200
Figuur 12: Per coupe worden γ-H2AX foci gescoord in 200 luminaire epitheelcellen, verdeeld over 4
klierbuisgroepen, door 1 scorer.
3. Resultaten
3.1 HE kleuring
Figuur 13 geeft een HE kleuring weer, uitgevoerd op borstweefsel van staal 01. Er wordt een
overzicht weergegeven van TDLU’s met hun verschillende onderdelen. De TLDU’s zijn gelegen
in losmazig lobulair bindweefsel. Verder worden ook acini of terminale ductuli en een lobaire
ductus weergegeven. Rondom de TLDU’s wordt dens lobair bindweefsel aangetroffen. De
celkernen van de TDLU’s kleuren blauw-paars aan en het cytoplasma roze.
- 27 -
4
3
2
1
Figuur 13: HE kleuring. Vergroting 10X, schaal -100µm. 1. Losmazig lobulair bindweefsel, 2. Acini of terminale
ductuli, 3. Lobaire ductus, 4. Dens lobair bindweefsel.
3.2 Optimalisatie van het protocol voor de γ-H2AX foci analyse
Verdunningen
Voor de γ-H2AX immunohistochemische kleuring werden verschillende verdunningen (1:200,
1:500, 1:1000) van het anti-γ-H2AX antilichaam uitgetest op coupes van staal 01. Dit staal werd
voorafgaand bestraald met 50mGy 30kV X-stralen en er werd een immunohistochemische
kleuring, met DAB en haematoxyline als tegenkleuring, op uitgevoerd. Bij een verdunning van
1:1000 is er bijna geen kleuring van het antigen γ-H2AX (figuur 14C). Er blijkt geen zichtbaar
verschil te zijn tussen verdunning 1:200 (figuur 14A) en 1:500 (figuur 14B). Om deze reden
wordt in dit onderzoek voor de verdunning 1:500 gekozen, waarbij er minder kans is op
aspecifieke binding en hierdoor resulteert in een optimale specifieke kleuring met de laagste
achtergrond (figuur 14B).
- 28 -
A
B
C
D
Figuur 14: ɣ-H2AX foci kleuring (DAB + H). Vergroting 60X, schaal - 10µm. A. Verdunning 1:200, B. Verdunning
1:500, C. Verdunning 1:1000, D. Negatieve controle.
Chromogeen substraat
Chromogenen zijn stoffen die door een specifiek enzym kunnen worden omgezet in een
gekleurde verbinding [62]. De immuno-enzymatische reactie in dit onderzoekt verloopt als volgt:
Kleurloos chromogeen (DAB) + substraat (H2O2) + enzym (horse radish peroxidase) => horse
radish peroxidase + 2H2O + geoxideerd DAB (bruine neerslag, onoplosbaar in alcohol)
Het resultaat van deze immunohistochemische kleuring zijn bruine, niet scherp afgelijnde foci die
soms moeilijk te onderscheiden zijn van de achtergrond. Het DAB werd zowel 10 als 5min
geïncubeerd, waarbij 10min incubatie het beste resultaat gaf. Figuur 15A geeft een DAB
- 29 -
immunohistochemische kleuring weer, uitgevoerd op staal 01. Om de intensiteit van het DAB
signaal te versterken, werd in dit onderzoek het DAB gekoppeld aan NiCl2. Het NiCl2 bindt aan
het DAB en zorgt voor een zwarte kleur, waardoor foci niet langer als bruine, onduidelijke
stippen worden waargenomen maar wel als zwarte, duidelijker afgelijnde stippen. Figuur 15B
geeft een DAB-NiCl2 immunohistochemische kleuring weer, eveneens uitgevoerd op staal 01. In
beide kleuringen werd toluïdine blauw gebruikt als tegenkleuring.
A
B
Figuur 15: ɣ-H2AX foci kleuring (toluïdine blauw). Vergroting 60X, schaal - 10µm. A. DAB, B. DAB-NiCl2.
Tegenkleuringen
Verschillende tegenkleuringen werden uitgetest om een zo duidelijk mogelijk onderscheid te
kunnen maken tussen de kern en het cytoplasma van de epitheliale cellen, aangezien de foci
voorkomen in het DNA van de celkern. De kernen mogen eveneens niet te donker aankleuren.
Het tegenkleuren van de paraffine coupes van staal 01 is gebeurd met onder andere
haematoxyline, lichtgroen, methylgroen en toluïdine blauw. De tegenkleuring met lichtgroen
kleurt zowel de kern als het cytoplasma van de cellen zeer licht aan en is bijgevolg geen optie om
te gebruiken als tegenkleuring (figuur 16A). Tegenkleuren met methylgroen zorgt voor intense,
groene celkernen (figuur 16B). Haematoxyline aan de andere kant, toont donkere, blauwe
celkernen (figuur 16C). Aangezien toluïdine blauw zorgt voor mooi afgelijnde, duidelijke en niet
te donkere celkernen werd dit in deze studie gekozen als tegenkleuring (figuur 16D).
- 30 -
A
B
C
D
Figuur 16: Tegenkleuringen. Vergroting 60X, schaal - 10µm. A. Lichtgroen, B. Methylgroen, C. Haematoxyline, D.
Toluïdine blauw.
Geoptimaliseerd γ-H2AX immunohistochemisch kleuringsprotocol
Enkel de coupes waarop de immunohistochemische kleuring optimaal gelukt was en waar de γH2AX foci duidelijk zichtbaar waren, werden foci geteld. Figuur 17A en B geven respectievelijk
een negatieve controle en een coupe bestraald met 100mGy 30kV X-stralen weer. Deze
immunohistochemische kleuringen met DAB-NiCl2 werden uitgevoerd op staal 2 (19/11/2013,
familiale belasting), waarbij toluïdine blauw werd gebruikt als tegenkleuring.
- 31 -
A
B
Figuur 17: ɣ-H2AX foci kleuring (DAB-NiCl2,toluïdine blauw). Vergroting 60X, schaal - 10µm. A. Negatieve
controle, B. 100mGy.
3.3 Dosis-respons curve
Tabel 4 geeft een overzicht van de verkregen stalen tijdens dit onderzoek en toont ook welke
types van bestraling er op de verschillende stalen werd uitgevoerd. In het totaal werden tijdens
deze masterpoef 8 gezonde stalen verkregen, waarvan 3 stalen afkomstig van vrouwen die een
borstverkleining lieten uitvoeren (G), 2 stalen afkomstig van vrouwen die asymptomatisch drager
waren van een BRCA1 of BRCA2 mutatie (M), 1 staal afkomstig van een vrouw met familiale
belasting (B) en 2 stalen afkomstig van vrouwen met borstkanker (K). In staal 1 en 7 werden
geen klierbuizen aangetroffen na het uitvoeren van een HE kleuring. Op deze stalen werd daarom
geen γ-H2AX foci test uitgevoerd.
Tabel 4: Donoren en bestralingstype.
60
Co γ
30kV X
Stalen
Staal 1 (18/11/2013) / M
Staal 2 (19/11/2013) / B
Staal 3 (26/11/2013) / K
Staal 4 (06/12/2013) / G
Staal 5 (19/12/2013) / G
Staal 6 (24/02/2014) / M
Staal 7 (27/03/2014) / K
Staal 8 (10/04/2014) / G
ɣ-H2AX
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
- 32 -
Tabel 5A en B geeft het gemiddelde aantal foci/cel weer na 30min incubatie, voor respectievelijk
60
Co γ- en 30kV X-stralen. Sham bestraalde stalen werden eveneens meegenomen. In de tabel
wordt het gemiddelde van de tellingen weergegeven, uitgevoerd door de 2 scorers, waarbij in
totaal ongeveer 400 cellen per coupe werden geanalyseerd (zie 2.5.3). Echter, door een tekort aan
fibroglandulair weefsel in de stalen en/of het feit dat er voor de bestraling niet kan worden
bepaald of klierweefsel in het bindweefsel aanwezig is, kan voor sommige dosissen en/of
stralingskwaliteit geen waarde in de tabel worden ingevuld.
Tabel 5: Het gemiddelde aantal geïnduceerde foci/ cel na 30min incubatie. A. 60Co γ-stralen, B. 30kV X-stralen.
Sham bestraalde stalen werden eveneens in rekening gebracht.
A
Borstkanker Gezond
Gezond
Gezond
Belasting
BRCA1/2
60
Staal 3
Staal 4
Staal 5
Staal 8
Staal 2
Staal 6
Co γ
(mGy)
0,18
0,25
0,34
0
0,23
2
0,31
0,35
2+2
0,40
0,31
0,14
4
0,21
0,41
0,27
10
0,42
0,55
0,29
20
0,26
0,82
0,7
40
1,33
100
B
30kV X
(mGy)
0
2
2+2
4
10
20
40
100
Borstkanker
Staal 3
Gezond
Staal 4
Gezond
Staal 5
Gezond
Staal 8
Belasting
Staal 2
0,14
0,11
0,35
0,17
BRCA1/2
Staal 6
0,066
0,075
0,33
0,44
0,71
0,46
0,39
0,62
1,2
1,35
0,32
0,61
0,80
0,75
1,12
Figuur 18 geeft de dosis-respons weer van het aantal stralingsgeïnduceerde γ-H2AX foci voor
60
Co γ- en 30 kV X-stralen, na 30min incubatie. Het aantal stralingsgeïnduceerde foci wordt
bepaald door de foci gescoord in de niet-bestraalde stalen te verminderen met het aantal foci
gescoord in de bestraalde stalen. Resultaten van alle donoren werden samengevoegd (G, M, B,
K), aangezien na 30min incubatie geen verschil in het aantal stralingsgeïnduceerde DSB wordt
- 33 -
verwacht tussen de stalen. Figuur 19 geeft de dosis-respons curven van de γ-H2AX foci weer
voor 30kV X- en 60Co γ-stralen in het lage dosis gebied (0-10mGy), na 30min incubatie. Lineaire
regressies werden gefit door de datapunten, dewelke opnieuw zijn uitgemiddeld over alle stalen.
1,2
60
Co y-rays (unfrac)
Co y-rays (frac)
30
kV X-rays (unfrac)
30
kV X-rays (frac)
60
1,0
nbr of rad ind foci
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0
20
40
60
80
100
120
dose (mGy)
-0,2
Figuur 18: Dosis-respons (met lineaire curve, ‘to guide the eye’) van het gemiddelde aantal stralingsgeïnduceerde γH2AX foci voor 60Co γ- en 30kV X-stralen, na 30min incubatie. Zowel de gefractioneerde (2+2mGy) als de nietgefractioneerde datapunten voor 60Co γ- en 30kV X-stralen worden weergegeven.
0,3
nbr of rad ind foci
0,2
0,1
0,0
0
2
4
6
8
10
12
dose (mGy)
-0,1
60
Co y-rays (unfrac)
Co y-rays (frac)
30kV X-rays (unfrac)
30kV X-rays (frac)
60
-0,2
Figuur 19: Gefitte dosis-responscurven van het gemiddelde aantal stralingsgeïnduceerde γ-H2AX foci voor 60Co γen 30kV X-stralen, na 30min incubatie, in het lage dosis gebied (0-10mGy). Zowel de gefractioneerde (2+2my) als
niet-gefractioneerde datapunten voor 60Co γ- en 30kV X-stralen worden weergegeven.
- 34 -
Er wordt een hogere dosis-respons waargenomen bij 30kV X- dan bij
60
Co γ-stralen,
uitgezonderd bij 20 en 100mGy 30kV X-stralen (figuur 18). Een negatief aantal foci wordt
waargenomen bij 2mGy 30kV X-stralen (figuur 18, 19). In het lage dosis gebied van 0-10mGy
wordt een sterkere stijging van aantal γ-H2AX foci waargenomen (hypersensitiviteit = supralineariteit). Dit is meer uitgesproken voor 30kV X- dan voor 60Co γ-stralen (figuur 18, 19). Uit de
lineaire regressies, gefit door de datapunten van figuur 19, werd een RBE van 2,34 bekomen voor
de γ-H2AX foci in het lage dosis-gebied (0-10mGy). Voor dosissen vanaf 20mGy wordt een
vergelijkbare lineaire respons, met lagere helling, vastgesteld voor 30kV X- en
60
Co γ-stralen
(figuur 18). Bij een gefractioneerde blootstelling (2+2mGy) aan 30kV X- of 60Co γ-stralen wordt
een hoger aantal foci waargenomen dan bij een enkelvoudige blootstelling aan 2 of 4mGy (figuur
18, 19).
3.4 Repair kinetiek
Tabel 6 geeft een overzicht weer van de stalen (niet-mutatiedragers) waarop de repair kinetiek
werd onderzocht. Het eventuele verschil in repair van DNA DSB geïnduceerd door 30kV X- en
60
Co γ-stralen werd geanalyseerd voor een stralingsdosis van 4 en 40mGy en een
postbestralingstijd van 30min en 24uur. Voor sham bestraalde stalen werd het gemiddelde (µ)
genomen van 30kV X- en
60
Co γ-stralen. Wegens de reeds aangehaalde oorzaak (zie 3.3) kan
voor sommige dosissen en/of stralingskwaliteit geen waarde in de tabel kunnen worden ingevuld.
Tabel 6: Het gemiddelde aantal residuele γ-H2AX foci (niet- mutatiedragers) voor 30kV X- en 60Co γ- stralen, bij
een stralingsdosis van 4- en 40mGy en een post-bestralingstijd van 24uur. Voor sham bestraalde stalen werd het µ
genomen van 30kV X- en 60Co γ-stralen.
60
µ: 60Co ɣ + 30 kV X
Co ɣ
30kV X
Dosis (mGy)
0
4
40
4
40
Niet-mutatiedragers
Staal 3
0,12
0,34 0,43
Staal 4
0,08
0,15
0,23
0,27
Staal 5
0,58
Staal 8
0,17
Figuur 20 geeft de repair kinetiek van de γ-H2AX foci weer voor 60Co γ- en 30kV X-stralen, na
een postbestralingstijd van 30min en 24uur. Deze tijden geven respectievelijk het initieel aantal
- 35 -
stralingsgeïnduceerde en het residueel aantal DSB weer. De repair kinetiek werd enkel
onderzocht voor de niet-mutatiedragers, aangezien in dit onderzoek slechts data van 1
mutatiedrager kon worden verkregen. Het aantal geïnduceerde en residuele foci, uitgezet in het
histogram, is bijgevolg het gemiddelde van de waarden van de niet-mutatiedragers.
0,7
0.5h inc
24h inc
0,6
nbr of yH2AX foci
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
G/M 0
G_4
G_40
M_4
M_40
Figuur 20: Repair kinetiek (niet-mutatiedragers) van de γ-H2AX foci voor 60Co γ- en 30kV X-stralen, na 30min en
24uur incubatie.
Het aantal geïnduceerde γ-H2AX foci daalt na 24 uur zowel voor
60
Co γ- als voor 30kV X-
60
stralen, met uitzondering van 40mGy Co γ-stralen waar een stijging voorkomt. Er wordt tevens
een hoger aantal geïnduceerde foci waargenomen bij 4mGy dan bij 40mGy
aantal geïnduceerde foci reduceert naar achtergrondwaarden bij 4mGy
60
Co γ-stralen. Het
60
Co γ-stralen. Dit is
echter niet het geval bij 4 en 40mGy 30kV X-stralen, waar het aantal residuele γ-H2AX foci na
24 uur boven de achtergrondwaarden blijft en het aantal residuele foci bij 40mGy tevens hoger
ligt dan bij 4mGy 30kV X-stralen (figuur 20).
4. Discussie
Een groot deel van deze masterproef werd gewijd aan de optimalisatie van de γ-H2AX foci test.
Deze test wordt gebruikt om efficiënt DNA DSB op te sporen in borstweefsel. Het is belangrijk
om de cellulaire respons op DNA schade te onderzoeken in gezond borstweefsel, voornamelijk in
het kader van screeningsmammografieën. In dit onderzoek werd het verschil in biologisch effect
- 36 -
van 30kV X-stralen ten opzichte van 60Co γ-stralen nagegaan. Er werd hiervoor gebruik gemaakt
van gezond borstweefsel afkomstig van vrouwen die 1. een borstreductie lieten uitvoeren, 2.
preventief een mastectomie lieten uitvoeren omdat ze asymptomatisch drager zijn van een
BRCA1 of BRCA2 mutatie of omdat ze familiaal belast zijn, 3. een mastectomie lieten uitvoeren
omdat borstkanker werd vastgesteld. Een dosis-respons curve werd opgesteld voor 30kV X- en
60
Co γ-stralen, wat toelaat om de RBE te berekenen. Deze RBE is belangrijk voor het bepalen
van de DIR en de benefit/risk ratio. De repair kinetiek van DNA DSB werd onderzocht bij de
niet-mutatiedragers aan de hand van de γ-H2AX foci test. Wegens een te beperkt aantal data in
deze studie, werden resultaten samengevoegd.
4.1 Materiaal
Een belangrijk probleem dat is gerezen bij het uitvoeren van deze studie, is het verzamelen van
voldoende klierweefsel. Wanneer het bindweefsel uit de borstflap wordt gedisseceerd en in 2mm
sneden wordt gesneden vooraleer te bestralen, is het onmogelijk om uit te maken of er
klierweefsel in het bindweefsel aanwezig zal zijn. Om deze reden gebeurt, alvorens de γ-H2AX
foci test wordt uitgevoerd, een HE kleuring op alle coupes zodat een idee kan verkregen worden
over de hoeveelheid aanwezige klierbuizen (figuur 13). Aangezien elke snede wordt bestraald
met een verschillende dosis en/of verschillende stralingskwaliteit en er tijdens de bestraling niet
geweten is of er al dan niet klierweefsel aanwezig is, zal er van sommige dosissen en/of
stralingskwaliteit geen resultaat kunnen worden uitgezet in de dosis-respons curve (tabel 5, 6,
figuur 18, 19). In de literatuur zijn helaas geen methoden terug te vinden die beschrijven op
welke manier er voor het bestralen van de weefselsneden kan worden nagegaan of er al dan niet
klierweefsel in het bindweefsel aanwezig is. Daarenboven is er geen informatie over de manier
waarop borstweefsel het best gesneden wordt. Dit komt omdat in voorgaande studies
voornamelijk werd gefocust op cellen (PBL, geïsoleerde epitheelcellen van de borst, primaire
humane fibroblasten) om het effect van lage energie X-stralen na te gaan [1, 18, 32, 61]. In dit
onderzoek wordt bevestigd dat oudere patiëntstalen veel minder borstklierweefsel en overwegend
vetweefsel bevatten. Dit komt door een verminderde oestrogeen- en progesteronproductie, met
als gevolg dat TDLU’s atrofiëren en involueren [12].
- 37 -
4.2 γ-H2AX foci analyse
Voor het betrouwbaar te kunnen uitvoeren van de γ-H2AX foci test was optimalisatie vereist. Om
deze reden werden een aantal verdunningen (figuur 14), verschillende chromogene substraten
(figuur 15) en verschillende tegenkleuringen (figuur 16) uitgetest. Op die manier kwam een
geoptimaliseerde indirecte, enzymatische immunohistochemische kleuring tot stand (figuur 17).
In de meeste studies, uitgevoerd op celpreparaten, werd gekozen voor een fluorescente
immunohistochemische kleuring om het aantal γ-H2AX foci te kwantificeren [1, 18, 32]. In dit
onderzoek, uitgevoerd op weefselcoupes, wordt echter gekozen voor een enzymatische
immunohistochemische kleuring waarbij het signaal via lichtmicroscopie kan worden
gevisualiseerd en waaraan enkele voordelen verbonden zijn. Bij de gebruikte (HRP-DAB-NiCl2)
kleuring heeft men namelijk geen probleem met autofluorescentie van het weefsel, kan de
structuur van het weefsel beter zichtbaar worden gemaakt en zal geen fading van het signaal
optreden. Dit zorgt ervoor dat de γ-H2AX foci stabiel blijven, door meerdere personen kunnen
worden geteld en langer kunnen worden bewaard [63].
Aangezien in dit onderzoek met hele lage dosissen wordt gewerkt (0-100mGy) en op zoek wordt
gegaan naar hele kleine verschillen, moeten de γ-H2AX foci betrouwbaar en uniform kunnen
worden geteld. De γ-H2AX foci worden in deze studie enkel gescoord in de luminaire epitheliale
laag van de TDLU’s, aangezien deze het meest betrokken zijn bij het ontstaan van borstkanker en
de myoepitheliale, basale cellen van de klierbuizen soms vacuolen vertonen [13]. Deze vacuolen
komen enkel voor in de myoepitheliale cellen tijdens de vroege en late luteale fase van de
menstruele cyclus (zie 1.2) [11, 12]. Op sommige weefselcoupes werd een vrij groot verschil
waargenomen in het aantal γ-H2AX foci tussen de verschillende klierbuisgroepen van eenzelfde
coupe. Verschillende oorzaken kunnen echter aan de basis liggen van een minder goede
immunohistochemische kleuring waaronder: te veel achtergrondkleuring ten gevolge van
aspecifieke bindingen, slechte morfologie van de klierbuizen, verschillen in proliferatiegraad
tussen de klierbuizen, inname van hormonen,…[11]. In dit onderzoek werden de coupes waarop
de enzymatische immunohistochemische kleuring niet optimaal gelukt was, niet gebruikt voor het
scoren van γ-H2AX foci.
- 38 -
Per coupe werden de γ-H2AX foci gescoord in gemiddeld 4 klierbuisgroepen, zodat ongeveer
200cellen/coupe/scorer en dus ongeveer 400 cellen/preparaat in het totaal werden geteld (figuur
12). Depuydt et al. en Beels et al. scoorden de γ-H2AX foci in respectievelijk 100
lymfocyten/slide en 200-250 lymfocyten/slide via fluorescentie microscopie. In beide studies
verloopt de scoring van de γ-H2AX foci manueel. Bij Beels et al. wordt de telling, eveneens zoals
in dit onderzoek, door 2 onafhankelijke personen uitgevoerd [1, 32]. Birkelbach et al. en
Simonsson et al. voerden de γ-H2AX foci test uit op weefselcoupes [60, 64]. In de studie
uitgevoerd door Birkelbach et al. onderzocht men in vitro het aantal stralingsgeïnduceerde DSB
in
longtumorweefsel,
na bestraling met
10Gy X-stralen
of
behandeling met
een
chemotherapeuticum (cisplatin). De γ-H2AX foci werden gescoord in 200-400 cellen/coupe via
fluorescentie microscopie [64]. Simonsson et al. examineerde in vivo de hypersensitiviteit in
huidbiopsies van prostaatkanker patiënten, na bestraling met 100, 200, 450 en 1100mGy Xstralen. γ-H2AX foci werden automatisch gescoord met een CCD camera en fluorescentie
microscoop [60].
4.3 Dosis-respons curve
In een dosis-responscurve wordt een biologisch effect in functie van de dosis weergegeven.
Aangezien DNA een cruciaal target is voor straling, zal het biologische effect op dit niveau
worden onderzocht. Rogakou et al. waren de eersten die konden aantonen dat het fosforyleren
van het H2AX histon een zeer snelle en sensitieve reactie is van de cel op de aanwezigheid van
DNA DSB [18]. Daarom werd in dit onderzoek de γ-H2AX foci test gebruikt om in vitro de
effecten van X- en 60Co γ-stralen na te gaan in het lage dosis gebied.
Gezien het beperkte aantal stalen die we in onze studie konden verzamelen (zie 4.1), werden de
data van alle gezonde stalen samengevoegd voor verdere analyse (figuur 18, 19). Voor het
opstellen van de dosis-respons curve werd een postbestralingstijd van 30min gekozen omdat in
vele in vitro studies een maximaal aantal γ-H2AX wordt gevormd 15 à 30min na bestraling [32,
56, 60].
- 39 -
Eerste resultaten uit dit onderzoek tonen aan dat het aantal foci in borstweefsel, 30min na
bestraling, hoger ligt voor 30kV X- dan voor
60
Co γ-stralen, uitgezonderd voor 20 en 100mGy
30kV X-stralen (figuur 18, 19). Een hoger aantal foci komt voornamelijk voor in het lage dosis
gebied van 0-10mGy en wijst op een lage dosis hypersensitiviteit (supra-lineariteit; zie 1.4.3,
figuur 18, 19). Voor 60Co γ-stralen is deze lage dosis hypersensitiviteit minder duidelijk en strekt
de lineariteit zich eerder uit over de volledige dosis-respons regio (figuur 18, 19). De
hypersensitiviteit wordt gevolgd door een lineaire respons met lagere helling voor de hogere
dosissen (20-100mGy), dewelke vergelijkbaar is voor beide stralingskwaliteiten. Het hoger aantal
foci dat wordt waargenomen bij 30kV X-stralen voor alle dosispunten, uitgezonderd bij 20 en
100mGy, kan verklaard worden door een densere ionisatie track van 30kV X-stralen in
vergelijking met 60Co γ-stralen [1]. Het lager aantal foci bij 20 en 100mGy 30kV X- dan bij 60Co
γ-stralen, kan te wijten zijn aan het beperkt aantal datapunten. Het negatief aantal foci bij 2mGy
30kV X-stralen kan eveneens te wijten zijn aan een te beperkt aantal datapunten, waardoor
uitschieters beter zichtbaar worden.
Lage dosis hypersensitiviteit (supra-lineariteit) wordt in verscheidene artikels verklaard aan de
hand van het bystander effect (zie 1.4.3). Ojima et al. onderzochten het bystander effect aan de
hand van een inhibitor voor intercellulaire gap juncties (lindaan). In deze studie werd vastgesteld
dat de hypersensitiviteit in het lage dosis gebied wegviel na het toedienen van lindaan. Volgens
Ojima et al. impliceerde deze reactie dat het bystander effect verantwoordelijk is voor de
hypersensitiviteit in het lage dosis gebied [36]. Simonsson et al. daarentegen brachten ook nog 2
andere plausibele oorzaken naar voren om de hypersensitiviteit te verklaren. Enerzijds zou
hypersensitiviteit het effect kunnen zijn van een dosis-afhankelijke repair ratio, zodat bij hele
lage dosissen de herstelmechanismen niet voldoende getriggerd worden om efficiënt de schade te
herstellen. Anderzijds zou hypersensitiviteit ook het resultaat kunnen zijn van een efficiëntere
defosforylatie of moeilijkere fosforylatie bij hogere dosissen [60].
Preliminaire resultaten uit dit onderzoek zijn overeenkomstig met deze van Beels et al. [32]. In
laatstgenoemde in vitro studie werd een lage dosis hypersensitiviteit waargenomen (0-10mGy) bij
100kVp X-stralen en niet bij 60Co γ-stralen voor γ-H2AX foci. Deze hypersensitiviteit was hoger
- 40 -
bij bestraling van bloedstalen dan bij bestraling van geïsoleerde T-lymfocyten. De bloedstalen
waren afkomstig van 3 gezonde donoren, die niet rookten en geen radiotherapie achtergrond
hadden en werden bestraald met dosissen van 1-500mGy X- of
60
Co γ-stralen. De
hypersensitiviteit die werd waargenomen in het lage dosis gebied is volgens Beels et al. te wijten
aan het bystander effect [32].
Onze resultaten zijn niet in overeenstemming met deze van Simonsson et al. en Löbrich et al.,
waar de respons echter werd bekeken na in vivo bestraling [38, 60]. Simonsson et al.
onderzochten de inductie en repair van γ-H2AX foci in huidbiopten, afkomstig van 5
prostaatkanker patiënten die radiotherapie ondergingen. Na de eerste therapeutische behandeling
werden, 30min later, 4 huidbiopten van 3mm dik genomen. Deze huidbiopten kregen een dosis
van 100, 200, 450 of 1100mGy X-stralen. Er kon een hypersensitiviteit worden aangetoond in het
lage dosis-gebied van 50-300mGy. Het lange-termijn effect van de herhaaldelijke DNA schade
werd geanalyseerd aan de hand van de hoeveelheid celdood (apoptose). Hieruit kon worden
geconstateerd dat apoptose (0,026%) geen overheersende rol speelt bij de in vivo respons in het
lage dosis gebied en dus niet verantwoordelijk is voor de vastgestelde hypersensitiviteit [60].
Aangezien in ons onderzoek wordt gewerkt met dosissen die lager zijn (0-100mGy), kan
apoptose ook in onze studie niet aan de basis liggen van de waargenomen hypersensitiviteit.
Löbrich et al. daarentegen namen een lineaire dosis-respons waar, nadat patiënten een CT
onderzoek van de thorax en/of abdomen hadden ondergaan. Deze lineaire-dosis respons curve,
voor γ-H2AX foci, werd waargenomen over het dosis gebied van 3-30mGy 120 kVp X-stralen
[38].
Net zoals in ons onderzoek, simuleerden Colin et al. een mammografie, waar de in vitro inductie
en repair van DNA DSB werden onderzocht aan de hand van geïsoleerde primaire
borstepitheelcellen [18]. Deze epitheelcellen, afkomstig van 30 vrouwelijke patiënten met een
hoge of lage familiale belasting, werden gefractioneerd blootgesteld aan lage energie X-stralen
(2+2mGy, 28kVp) en ook eenzijdig blootgesteld aan lage energie X-stralen (2, 4mGy). Enerzijds
stelden Colin et al. vast dat het spontaan aantal DSB significant hoger ligt bij personen met een
hoge familiale belasting in vergelijking met personen met een lage familiale belasting. Er wordt
- 41 -
gesuggereerd dat dit een teken zou kunnen zijn van de impact van voorafgaande radiotherapie of
genetische achtergrond (of beiden) van de patiënten met een hoge familiale belasting. Anderzijds
namen Colin. et al. een significant dosis effect waar in het lage dosis gebied ongeacht de
risicostatus. Dit is in overeenstemming met onze resultaten, dewelke echter enkel gelden voor
gezond borstweefsel van niet-mutatiedragers en niet significant konden worden aangetoond
wegens een gebrek aan voldoende data. In onze studie blijkt een duidelijke verhoging van het
aantal γ-H2AX foci te kunnen worden gedetecteerd bij een dosis van 2+2 en 4mGy (figuur 18,
19). Colin et al. stelden eveneens vast dat minder DSB werden geïnduceerd bij een enkele dosis
van 2 of 4mGy 28kVp X-stralen dan bij een gefractioneerde blootstelling (2+2mGy), ongeacht de
risicostatus. Er wordt gesuggereerd door Colin et. al dat een groter aantal stralingsgeïnduceerde
DSB, bij 2 opeenvolgende views van de borst, teweeggebracht zou kunnen worden door
interferentie van de schade verworven tijdens de 2de blootststelling aan X-stralen met het herstel
van baseschade en SSB veroorzaakt tijdens de 1ste blootstelling. Dit kan verklaard worden door
de halfwaardetijd die nodig is voor het herstel van baseschade en SSB. Deze bedraagt 1-5min
voor het herstel van baseschade en 5-10min voor het herstel van SSB (zie 1.4.1). Deze effecten
waren steeds meer uitgesproken voor personen met een hoge familiale belasting [18]. Resultaten
uit onze studie bevestigen dat een gefractioneerde blootstelling aan 2+2mGy schadelijker is dan
een eenzijdige blootstelling aan 2 en 4mGy, voor zowel 30kV X- als
60
Co γ-stralen (figuur 18,
19).
Naast γ-H2AX foci kunnen ook gefosforyleerde ATM foci gebruikt worden als biomerker om het
effect van straling in het lage dosis gebied na te gaan. Deze laatstgenoemde foci test werd
aangewend door Ojima et al. en Suzuki et al., omdat deze minder aanleiding gaf tot achtergrond
foci in prolifererende cellen. γ-H2AX foci komen namelijk eveneens voor in delende cellen
tijdens de S-fase van de celcyclus [36, 65]. Tijdens de synthese van het DNA wordt de
dubbelstreng helix ontwonden door een enzym helicase. Hierdoor ontstaat op de plaats van de
replicatie een spanning op de DNA streng. Deze spanning wordt opgegeven door het knippen van
de helix, waardoor een DSB ontstaat [25]. Preliminaire resultaten uit onze studie zijn in
overeenstemming met deze van Ojima et al. en Suzuki et al. [36, 65]. De in vitro studie
uitgevoerd door Ojima et al. ging de sensitiviteit van de primaire normale humane
- 42 -
fibroblastencellijn (MRC-5) na bij blootstelling aan 90kVp X-stralen. Resultaten uit deze studie
bevestigen een hypersensitieve dosis-respons bij dosissen van 1,2-5mGy. Een lineaire dosisrespons curve werd gevonden bij dosissen van 10mGy-200mGy [36]. Suzuki et al. onderzochten
in vitro de gevoeligheid van exponentieel groeiende normale humane diploïde cellen aan 150kVp
X-stralen. Er werd eveneens een lineaire dosis respons vastgesteld bij dosissen van 10-1000mGy
[65]. Naast het voordeel van minder ATM foci als achtergrond in prolifererende cellen, moet
worden in acht genomen dat de incidentie van Ataxia Telangiectasia wereldwijd 1/40 000 tot
1/100 000 bedraagt. Ataxia Telangiectasia is een autosomaal recessieve genetische aandoening,
die wordt gekenmerkt door een overgevoeligheid aan IR en verlies van controle van de celcyclus,
met een sterk verhoogd kankerrisico tot gevolg [66]. Echter, 0,5-1% van de wereldbevolking is
heterozygoot voor ATM (ATM+/-) [67]. Dit maakt het gebruik van de γ-H2AX foci test
geschikter dan de gefosforyleerde ATM foci test om stralingsschade na te gaan. Aangezien
borstepitheelcellen enkel tijdens de late luteale fase frequent prolifereren, zal de fractie aan
achtergrond foci in dit onderzoek miniem zijn [12].
Om het verschil in inductie van DNA DSB te bepalen tussen 30kV X-en 60Co γ-stralen, wordt de
RBE bepaald. Uit de dosis-respons curve wordt een RBE van 2,34 afgeleid voor γ-H2AX foci, in
het lage dosis gebied van 0-10mGy (figuur 19). Voor hogere dosissen (20-100mGy) wordt een
vergelijkbare lineaire respons (RBE) waargenomen voor beide stralingskwaliteiten (figuur 18).
Het ICRP beschouwd echter nog steeds een RBE van 1 voor alle lage LET straling (zie 1.4.3) [1,
35, 39]. Data uit onze studie zijn echter zeer beperkt en moeten verder uitgebreid worden.
Resultaten uit onze studie zijn gedeeltelijk in overeenstemming met deze bekomen door Depuydt
et al. [1]. In laatstgenoemde in vitro studie werden de PBL, afkomstig van 5 gezonde donoren,
bestraald met dosissen van 5-500 mGy 30kV X- en
60
Co γ-stralen. Voor de volledige dosis-
respons curve kon worden aangetoond dat 30kV X-stralen meer DSB induceren dan
60
Co γ-
stralen (1,22MeV). Dit schadelijker effect uit zich in een RBE van 1,4 voor de γ-H2AX foci test,
wat impliceert dat 30kV X-stralen schadelijker zijn dan
60
Co γ-stralen. Bij Depuydt et al. uitte
deze hogere LET waarde zich tevens in een lagere drempeldosis vanaf wanneer γ-H2AX foci
konden worden gedetecteerd. Deze bedroeg 10mGy voor 30kV X-stralen en 50mGy voor 60Co γ-
- 43 -
stralen [1]. In onze studie blijken γ-H2AX foci reeds detecteerbaar te zijn bij een dosis van 2+2
en 4mGy 30kV X-stralen (figuur 18, 19). Colin et al. namen reeds een significant dosis effect
waar vanaf 4mGy, wat erop zou kunnen wijzen dat epitheliale cellen van de borst gevoeliger zijn
aan straling dan lymfocyten [1, 18]. Heyes et al. daarentegen vonden een RBE van 4.42 +/- 2.02
voor in vitro cel transformaties van de CGL-1 cellijn, bij 29kVp X-stralen in vergelijking met
60
Co γ-stralen en 2.2 MeV elektronen van een strontium90/yttrium90 radioactieve bron [68].
Resultaten uit ons onderzoek en deze bekomen door Depuydt et al., zijn niet in overeenstemming
met deze bekomen door Beyreuther et al [39]. Laatgenoemde studie onderzocht in vitro het
verband tussen de inductie van chromosoom aberraties in borstepitheel cellijnen (184A1 en
MCF12A) en de energie-afhankelijkheid ervan aan X-stralen. De RBE werd bepaald aan de hand
van de fractie acentrische ringen en dicentrische chromosomen. Uit deze studie volgde een RBE
van 1,31 en 1,70 voor de cellijn 184A1 en 1,08 en 1,43 voor de cellijn MCF12A voor
respectievelijk 25kV en 10kV X-stralen, met 200kV X-stralen als referentie. Hieruit kan worden
vastgesteld dat lagere energie X-stralen zorgen voor een hogere RBE. Echter, voor de 25kV Xstralen die aanleunen bij de 30kV X-stralen uit ons onderzoek, bekomt Beyreuther et al. een RBE
van ongeveer 1, zoals het ICRP het voorschrijft [1, 39].
Verschillende resultaten uit bovenstaande studies kunnen worden toegeschreven aan het gebruik
van verschillende stralingskwaliteiten, dosissen, celtypes, cellijnen, biomerkers en/of eindpunten.
Voorzichtigheid bij het vergelijken van de data is dus aangewezen.
4.4 Repair kinetiek
De γ-H2AX foci test werd eveneens gebruikt om de repair kinetiek van DNA DSB, in gezond
borstweefsel van niet-mutatiedragers, te bestuderen. Volgens verschillende literatuurgegevens
zou de defosforylatie en bijgevolg het verdwijnen van de γ-H2AX foci overeenstemmen met het
herstel van DSB [38, 61].
Om in dit onderzoek de repair kinetiek van γ-H2AX foci na te gaan, werden stalen bestraald met
4 en 40mGy en vervolgens 30min en 24uur geïncubeerd na bestraling (37°C, 5% CO2). Na deze
- 44 -
postbestralingstijden werden de stalen op ijs geplaatst en gefixeerd in 4% NGF. Door in dit
onderzoek niet-bestraalde stralen als controle mee te nemen, werd er rekening gehouden met γH2AX foci die spontaan kunnen optreden na 30min en 24uur incubatie en waarvan het aantal kan
afhangen van de individuele gevoeligheid voor onder andere oxidatieve stress [18]. Figuur 20
toont aan dat het aantal geïnduceerde γ-H2AX foci daalt na 24 uur zowel voor 30kV X- als voor
60
Co γ-stralen. Het hoger aantal residuele dan geïnduceerde foci bij 40mGy 60Co γ-stralen en het
hoger aantal geïnduceerde foci bij 4mGy dan bij 40mGy 60Co γ-stralen, kan te wijten zijn aan een
te beperkt aantal datapunten. Het aantal geïnduceerde foci reduceert na 24 uur naar
achtergrondwaarden bij 4mGy 60Co γ-stralen. Dit is echter niet het geval bij 4 en 40mGy 30kV
X-stralen, waar het aantal residuele foci na 24 uur boven de achtergrondwaarden blijft. Het
residueel aantal foci blijkt eveneens hoger te liggen bij 40mGy dan bij 4mGy na bestraling met
30kV X-stralen.
Preliminaire resultaten uit onze studie zijn in overeenstemming met deze van Depuydt et al.,
Beels et al. en gedeeltelijk in overeenstemming met deze van Löbrich et al. en Rothkamm et al.
[1, 32, 38, 61]. Depuydt et al stelden vast dat 30kV X-stralen voor meer geclusterde DNA schade
zorgen dan 60Co γ-stralen en daarom moeilijker worden hersteld [1]. Om deze reden worden meer
residuele foci na 24 uur verwacht bij 30kV X- dan bij
60
Co γ-stralen. Beels et al. toonden een
verschil in repair aan, wanneer bloedstalen werden bestraald met 5 en 200mGy 100kVp Xstralen of
60
Co γ-stralen. Uit deze studie stelde men vast dat het aantal stralingsgeïnduceerde γ-
H2AX foci, na bestraling met 5 en 200mGy X-stralen, niet werd gereduceerd naar
achtergrondwaarden na 24uur incubatie. Echter, 40% residuele γ-H2AX foci bleven over, voor
beide dosissen (5 en 200mGy). Wanneer T-lymfocyten werden bestraald met 200mGy X-stralen,
bleef slechts 10% van de initiële foci over na 24 uur. Wanneer daarentegen bloedstalen en
geïsoleerde T-lymfocyten werden bestraald met 200mGy
60
Co γ-stralen, werden wel
achtergrondwaarden van γ-H2AX foci waargenomen na 24 uur. Bij de bloedstalen bestraald met
5mGy
60
Co γ-stralen werd geen significante stijging van het aantal stralingsgeïnduceerde γ-
H2AX foci aangetroffen, waardoor geen conclusies konden worden getrokken. Beels et al.
veronderstelden uit deze resultaten dat er 2 types van DSB bestaan. Enerzijds bestaan er DSB met
een vertraagde herstelcapaciteit, te wijten aan de gebruikte stralingskwaliteit, en anderzijds
- 45 -
bestaan er DSB die herstellen met een halfwaardetijd van 3 à 4 uur [32]. Löbrich et al. namen
eveneens een verschil in herstelcapaciteit waar, wanneer PBL in vitro werden bestraald met
dosissen van 5 en 500mGy 90kV X-stralen. Hieruit bleek dat het aantal stralingsgeïnduceerde γH2AX foci na 24 uur voor respectievelijk 50% en 90% waren hersteld. Dit was echter niet het
geval voor de in vivo situatie, waar na 24 uur incubatie achtergrondwaarden van de γ-H2AX foci
werden bekomen, voor zowel 5 als 500mGy X-stralen [38]. Rothkamm et al. onderzochten in
vitro het effect van 1-2000 mGy 90kV X-stralen op onder andere de MRC-5 cellijn. In deze
studie werd vastgesteld dat het herstel van DSB minder efficiënt verliep bij lage dosissen (1,25mGy) of zelfs uitbleef bij dosissen lager dan 1,2mGy na 24 uur, in tegenstelling tot de efficiënte
repair bij hogere dosissen (20-2000mGy), waarbij het aantal stralingsgeïnduceerde foci naar
achtergrondwaarden reduceerde [61].
Preliminaire resultaten uit onze studie zijn echter niet in overeenstemming met deze van Colin et
al. en Simonsson et al. [18, 60]. Colin et al. stelden een hoger aantal γ-H2AX foci vast na 24 uur
dan na 10min postbestralingstijd, ongeacht de risicostatus [18]. Uit de in vivo resultaten van
Simonsson et al. kon geen verschil worden vastgesteld tussen het aantal stralingsgeïnduceerde en
residuele γ-H2AX foci in huidepitheelcellen, na bestraling met 450 en 1100mGy X-stralen en een
postbestralingstijd van 30min en 2uur [60]. Verschillende resultaten uit bovenstaande studies in
vergelijking met onze resultaten zouden kunnen worden toegeschreven aan het gebruik van
verschillende postbestralingstijden, cellen, stralingskwaliteit en/of dosis.
5. Algemeen besluit
In deze in vitro studie werd de inductie en het herstel van DNA DSB onderzocht in gezond
borstweefsel aan de hand van de γ-H2AX foci test. Gezien het beperkt aantal stalen werden de
data van de verschillende individuen samengevoegd. In onze studie werd er dus geen rekening
gehouden met interindividuele verschillen die het gevolg kunnen zijn van 1. het al dan niet gehad
hebben van borstkanker, 2. de fase van de menstruele cyclus waarin de vrouwen zaten tijdens het
uitvoeren van de borstreductie of de mastectomie, 3. eventueel lopende hormoon-therapieën, 4.
leeftijd,…Resultaten uit onze studie geven dus slechts een eerste indicatie weer over het effect
- 46 -
van straling op gezond borstweefsel in het lage dosis gebied en het herstel van de DNA DBS.
Enerzijds tonen preliminaire resultaten uit onze studie aan dat 30kV X-stralen schadelijker zijn in
het lage dosis gebied (0-10mGy) dan
60
Co γ-stralen (RBE: 2,34). Tevens kan een biologisch
effect worden waargenomen bij reeds zeer lage dosissen van 2+2 en 4mGy 30kV X-stralen, zoals
gegeven bij een mammografie. Gegevens over de RBE zijn van groot belang voor het opstellen
van richtlijnen, zoals vanaf welke leeftijd er mag worden gescreend (DIR), voornamelijk voor
risicopatiënten. Anderzijds tonen preliminaire resultaten over de repair kinetiek van DNA DSB,
in gezond borstweefsel van niet-mutatiedragers, aan dat er een daling van het aantal
stralingsgeïnduceerde γ-H2AX foci optreedt na 24 uur, ongeacht de stralingskwaliteit. Echter, het
aantal residuele foci geïnduceerd door 30kV X-stralen blijft na 24 uur boven de
achtergrondwaarden in tegenstelling tot het aantal residuele foci na bestraling met 4mGy 60Co γstralen. Uitbreiding van de studie, met meer stalen, is noodzakelijk om significante resultaten te
bekomen.
6. Referenties
1.
Depuydt J, Baert A, Vandersickel V, Thierens H, Vral A (2013). Relative biological effectiveness of
mammography X-rays at the level of DNA and chromosomes in lymphocytes. International journal of radiation
biology 89: 532-8.
2.
Bray F, McCarron P, Parkin DM (2004). The changing global patterns of female breast cancer incidence
and mortality. Breast cancer research : BCR 6: 229-39.
3.
Jemal A, Center MM, DeSantis C, Ward EM (2010). Global patterns of cancer incidence and mortality rates
and trends. Cancer epidemiology, biomarkers & prevention : a publication of the American Association for Cancer
Research, cosponsored by the American Society of Preventive Oncology 19: 1893-907.
4.
htpp://kankerregister.org/Statistieken.
5.
Hofvind S, Ursin G, Tretli S, Sebuodegard S, Moller B (2013). Breast cancer mortality in participants of the
Norwegian Breast Cancer Screening Program. Cancer 119: 3106-12.
6.
Ferlay J, Autier P, Boniol M, Heanue M, Colombet M, Boyle P (2007). Estimates of the cancer incidence
and mortality in Europe in 2006. Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology
/ ESMO 18: 581-92.
7.
Young B LJ, Stevens A, Heath JW (2006). Wheater's functional histology. Elsevier.
8.
Ross M H WP (2010). Histology: A Text and Atlas.
9.
Crombez R PK (2006). Borstkanker. Wolters Kluwer Belgium NV.
10.
Petersen OW, Ronnov-Jessen L, Howlett AR, Bissell MJ (1992). Interaction with basement membrane
serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 89: 9064-8.
11.
Ramakrishnan R, Khan SA, Badve S (2002). Morphological changes in breast tissue with menstrual cycle.
Modern pathology : an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc 15: 1348-56.
12.
https://www.inkling.com/read/practical-breast-pathology-diagnostic-atkins-1st/chapter-1/normal-histology.
- 47 -
13.
Lim S, Yu JH, Park HK, Moon B, Ko B, Suh YJ (2014). A comparison of the clinical outcomes of patients
with invasive lobular carcinoma and invasive ductal carcinoma of the breast according to molecular subtype in a
Korean population. World journal of surgical oncology 12: 56.
14.
http://www.tegenkanker.be.
15.
Heyes GJ, Mill AJ, Charles MW (2006). Enhanced biological effectiveness of low energy X-rays and
implications for the UK breast screening programme. The British journal of radiology 79: 195-200.
16.
Drukker CA, Schmidt MK, Rutgers EJ, Cardoso F, Kerlikowske K, Esserman LJ, et al. (2014).
Mammographic screening detects low-risk tumor biology breast cancers. Breast cancer research and treatment 144:
103-11.
17.
Frankenberg D, Kelnhofer K, Bar K, Frankenberg-Schwager M (2002). Enhanced neoplastic transformation
by mammography X rays relative to 200 kVp X rays: Indication for a strong dependence on photon energy of the
RBEM for various end points (vol 157, pg 99, 2002). Radiat Res 157: 99-105.
18.
Colin C, Devic C, Noel A, Rabilloud M, Zabot MT, Pinet-Isaac S, et al. (2011). DNA double-strand breaks
induced by mammographic screening procedures in human mammary epithelial cells. International journal of
radiation biology 87: 1103-12.
19.
Suzuki K, Yamashita S (2012). Low-dose radiation exposure and carcinogenesis. Japanese journal of
clinical oncology 42: 563-8.
20.
Thierry-Chef I, Simon SL, Weinstock RM, Kwon D, Linet MS (2012). Reconstruction of absorbed doses to
fibroglandular tissue of the breast of women undergoing mammography (1960 to the present). Radiation research
177: 92-108.
21.
Klein R, Aichinger H, Dierker J, Jansen JT, Joite-Barfuss S, Sabel M, et al. (1997). Determination of
average glandular dose with modern mammography units for two large groups of patients. Physics in medicine and
biology 42: 651-71.
22.
https://kce.fgov.be.
23.
Heyes GJ, Mill AJ, Charles MW (2009). Mammography-oncogenecity at low doses. Journal of radiological
protection : official journal of the Society for Radiological Protection 29: A123-32.
24.
Foulkes WD (2014). BRCA1 and BRCA2 - update and implications on the genetics of breast cancer: a
clinical perspective. Clinical genetics 85: 1-4.
25.
Bracke M LF, Vandenberghe P, Vanderkerken K (2013). Kanker, biomedisch bekeken. Standaard uitgeverij
professional.
26.
Tubiana M DJ, Wambersie A (1990). Introduction to radiobiology.
27.
Cervelli T, Borghini A, Galli A, Andreassi MG (2012). DNA damage and repair in atherosclerosis: current
insights and future perspectives. International journal of molecular sciences 13: 16929-44.
28.
Grudzenski S, Raths A, Conrad S, Rube CE, Lobrich M (2010). Inducible response required for repair of
low-dose radiation damage in human fibroblasts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America 107: 14205-10.
29.
Goodarzi AA, Jeggo PA (2012). Irradiation induced foci (IRIF) as a biomarker for radiosensitivity.
Mutation research 736: 39-47.
30.
Frankenberg D, Kelnhofer K, Bar K, Frankenberg-Schwager M (2002). Enhanced neoplastic transformation
by mammography X rays relative to 200 kVp X rays: indication for a strong dependence on photon energy of the
RBE(M) for various end points. Radiation research 157: 99-105.
31.
Pastink A, Eeken JC, Lohman PH (2001). Genomic integrity and the repair of double-strand DNA breaks.
Mutation research 480-481: 37-50.
32.
Beels L, Werbrouck J, Thierens H (2010). Dose response and repair kinetics of gamma-H2AX foci induced
by in vitro irradiation of whole blood and T-lymphocytes with X- and gamma-radiation. International journal of
radiation biology 86: 760-8.
33.
EL T (2000). Primer of medical radiobiology.
34.
http://www.bbc.co.uk.
35.
Hill MA (2004). The variation in biological effectiveness of X-rays and gamma rays with energy. Radiation
protection dosimetry 112: 471-81.
36.
Ojima M, Ban N, Kai M (2008). DNA double-strand breaks induced by very low X-ray doses are largely
due to bystander effects. Radiation research 170: 365-71.
37.
http://www.ehs.washington.edu/rsotrain/sealedsources/cancerrisk.
- 48 -
38.
Lobrich M, Rief N, Kuhne M, Heckmann M, Fleckenstein J, Rube C, et al. (2005). In vivo formation and
repair of DNA double-strand breaks after computed tomography examinations. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America 102: 8984-9.
39.
Beyreuther E, Dorr W, Lehnert A, Lessmann E, Pawelke J (2009). Relative biological effectiveness of 25
and 10 kV X-rays for the induction of chromosomal aberrations in two human mammary epithelial cell lines.
Radiation and environmental biophysics 48: 333-40.
40.
Beyreuther E, Lessmann E, Pawelke J, Pieck S (2009). DNA double-strand break signalling: X-ray energy
dependence of residual co-localised foci of gamma-H2AX and 53BP1. International journal of radiation biology 85:
1042-50.
41.
International Atomic Energy Agency (2011). Cytogenic dosimetry: applications in preparedness for and
response to radiation emergencies. IAEA Austria.
42.
Khanna KK, Jackson SP (2001). DNA double-strand breaks: signaling, repair and the cancer connection.
Nature genetics 27: 247-54.
43.
Rothkamm K, Kuhne M, Jeggo PA, Lobrich M (2001). Radiation-induced genomic rearrangements formed
by nonhomologous end-joining of DNA double-strand breaks. Cancer research 61: 3886-93.
44.
Mahaney BL, Meek K, Lees-Miller SP (2009). Repair of ionizing radiation-induced DNA double-strand
breaks by non-homologous end-joining. The Biochemical journal 417: 639-50.
45.
Hartlerode AJ, Scully R (2009). Mechanisms of double-strand break repair in somatic mammalian cells. The
Biochemical journal 423: 157-68.
46.
Bracke M LF, Vandenberghe P, Vanderkerken K (2013). Kanker, biomedisch bekeken. Standaard uitgeverij
professional.
47.
Kavanagh JN, Redmond KM, Schettino G, Prise KM (2013). DNA double strand break repair: a radiation
perspective. Antioxidants & redox signaling 18: 2458-72.
48.
Jeggo PA, Geuting V, Lobrich M (2011). The role of homologous recombination in radiation-induced
double-strand break repair. Radiotherapy and oncology : journal of the European Society for Therapeutic Radiology
and Oncology 101: 7-12.
49.
Lee JH, Goodarzi AA, Jeggo PA, Paull TT (2010). 53BP1 promotes ATM activity through direct
interactions with the MRN complex. The EMBO journal 29: 574-85.
50.
O'Donovan PJ, Livingston DM (2010). BRCA1 and BRCA2: breast/ovarian cancer susceptibility gene
products and participants in DNA double-strand break repair. Carcinogenesis 31: 961-7.
51.
Foulkes WD, Shuen AY (2013). In brief: BRCA1 and BRCA2. The Journal of pathology 230: 347-9.
52.
Dever SM, White ER, Hartman MC, Valerie K (2012). BRCA1-directed, enhanced and aberrant
homologous recombination: mechanism and potential treatment strategies. Cell cycle 11: 687-94.
53.
Huszno J, Budryk M, Kolosza Z, Nowara E (2013). The influence of BRCA1/BRCA2 mutations on toxicity
related to chemotherapy and radiotherapy in early breast cancer patients. Oncology 85: 278-82.
54.
www.nature.com.
55.
Beels L, Bacher K, De Wolf D, Werbrouck J, Thierens H (2009). gamma-H2AX foci as a biomarker for
patient X-ray exposure in pediatric cardiac catheterization: are we underestimating radiation risks? Circulation 120:
1903-9.
56.
Rogakou EP, Pilch DR, Orr AH, Ivanova VS, Bonner WM (1998). DNA double-stranded breaks induce
histone H2AX phosphorylation on serine 139. The Journal of biological chemistry 273: 5858-68.
57.
West AG, van Attikum H (2006). Chromatin at the crossroads. Meeting on signalling to chromatin
epigenetics. EMBO reports 7: 1206-10.
58.
MacPhail SH, Banath JP, Yu TY, Chu EH, Lambur H, Olive PL (2003). Expression of phosphorylated
histone H2AX in cultured cell lines following exposure to X-rays. International journal of radiation biology 79: 3518.
59.
Paull TT, Rogakou EP, Yamazaki V, Kirchgessner CU, Gellert M, Bonner WM (2000). A critical role for
histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Current biology : CB 10: 886-95.
60.
Simonsson M, Qvarnstrom F, Nyman J, Johansson KA, Garmo H, Turesson I (2008). Low-dose
hypersensitive gammaH2AX response and infrequent apoptosis in epidermis from radiotherapy patients.
Radiotherapy and oncology : journal of the European Society for Therapeutic Radiology and Oncology 88: 388-97.
61.
Rothkamm K, Lobrich M (2003). Evidence for a lack of DNA double-strand break repair in human cells
exposed to very low x-ray doses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
100: 5057-62.
- 49 -
62.
www.encyclo.nl/begrip.
63.
Kumar LG, Zucker MR (Editors) (2009). Immunohistochemical (IHC) Staining Methods. Dako North
America, California, 172p.
64.
Birkelbach M, Ferraiolo N, Gheorghiu L, Pfaffle HN, Daly B, Ebright MI, et al. (2013). Detection of
impaired homologous recombination repair in NSCLC cells and tissues. Journal of thoracic oncology : official
publication of the International Association for the Study of Lung Cancer 8: 279-86.
65.
Suzuki K, Okada H, Yamauchi M, Oka Y, Kodama S, Watanabe M (2006). Qualitative and quantitative
analysis of phosphorylated ATM foci induced by low-dose ionizing radiation. Radiation research 165: 499-504.
66.
Shiloh Y, Kastan MB (2001). ATM: genome stability, neuronal development, and cancer cross paths.
Advances in cancer research 83: 209-54.
67.
www.ntvg.nl/publicatie/van-gen-naar-ziekte-ataxia-teleangiectasia/.
68.
Heyes GJ, Mill AJ (2004). The neoplastic transformation potential of mammography X rays and atomic
bomb spectrum radiation. Radiation research 162: 120-7.
- 50 -
7. Bijlagen
Bijlage 1: Samenstelling ringer.
Producten
Natriumchloride (NaCl)
Calciumchloride (CaCl2)
Kaliumchloride (KCl)
Firma
Catalogusnummer
Hoeveelheid
Sigma-Aldrich®
(Bornem,België)
VWR® (Leuven,
België)
VWR®
S-9888
9,00 g
766948
0,42 g
1.04936
0,24 g
Bijlage 2: Samenstelling cultuurmedium MCF10A.
Producten
Firma
Gibco®
DMEM/Glutamax
(Thermo Scientific)
Gibco®
F12/Glutamax
Gibco®
FCS
EGF (recombinant humaan)*
Hydrocortison**
Insuline***
Penicilline/Streptavidine
PeproTech (HalleZoersel, België)
Sigma-Aldrich®
Sigma-Aldrich®
Gibco®
Catalogusnummer
61965
Hoeveelheid
250 ml
31765
10270-106
250 ml
25,0 ml
AF-100-15
100 µl
H0888
I1882
15140-122
250 µl
500 µl
2,50 ml
* EGF : oplossen in 100 µg/ml in steriel water,aliquoteren en bij -20°C bewaren.
** hydrocortison : oplossen in 1 mg/ml absolute ethanol, aliquoteren en bij -20°C bewaren (eerst 10X aliquoteren
en pas indien nodig verder verdunnen naar 1X).
*** insuline : oplossen in 10 mg/ml in steriel water met 1% ijsazijn. Laat staan gedurende ongeveer 10-15 min,
aliquoteren en bewaren bij 4°C.
Bijlage 3: Samenstelling 4% NGF.
Producten
Formaldehyde 40%
Firma
®
VWR
VWR®
Dinatriumhygrogenfosfaat
(Na2HPO4 )
VWR®
Kaliumdihydrogenfosfaat
(KH2PO4 )*
*KH2PO4 toevoegen tot pH 6,9.
**Gedestilleerd H2O toevoegen tot 1000 ml.
Catalogusnummer
Hoeveelheid
UN.2209
100 ml
1.06580
1,78 g
1.04873
0,42 g
Bijlage 4: Protocol manuele inbedding paraffine.
Producten
Firma
Catalogusnummer
Tijd
CL00.1807.2500
1uur
Disolol® 50%
Chem-lab,
Zedelgem, België
Chem-lab
CL00.1807.2500
1uur
Disolol® 70%
Chem-lab
CL00.1807.2500
1uur
Disolol 96%
Chem-lab
CL00.1807.2500
1uur
Isopropyl alcohol
Chem-lab
CL00.0901.5000
1uur
Isopropyl alcohol / toluol
(1:1)
Toluol
Chem-lab
CL00.0901.5000/CL00.2001.5000
1uur
Chem-lab
CL00.2001.5000
30min
Paraffine op 60°C (onder
vacuüm)
Thermo Scientific
/
Overnacht
®
Disolol 30%
®
Bijlage 5: HE protocol van het kleurtoestel Microm HMS 740.
Bad 1
Bad 1 tolueen
Bad 2
Bad 2 tolueen
Bad 3
Bad 3 tolueen
Bad 4
isopropanol
Bad 5
isopropanol
Bad 6
alcohol 96%
Bad 7
alcohol 96%
Bad 29
leidingwater
Bad 19
aqua dest
Bad 15
haematox.
Bad 29
leidingwater
Bad 16
clarifier I
Bad 29
leidingwater
Bad 17
bluing reagent
Bad 29
leidingwater
Bad 19
aqua dest
Bad 18
eosine+phloxine
Bad 29
leidingwater
Bad 20
alcohol 96%
Bad 21
alcohol 96%
Bad 22
isopropanol
Bad 8
isopropanol
Bad 9
tolueen
Bad 23
tolueen
Bad 8
tolueen
5min
5min
5min
2min
2min
2min
2min
2min
1min
15sec
2min
1min
1min
1min
1min
1min
30sec
2min
2min
2min
2min
2min
2min
2min
1min
Bijlage 6: Deparaffineringsprotocol van het kleurtoestel Microm HMS 740.
Bad 1
tolueen
Bad 2
tolueen
Bad 3
tolueen
Bad 4
isopropanol
Bad 5
isopropanol
Bad 6
alcohol 96%
Bad 7
alcohol 96%
Bad 29
leidingwater
Bad 19
aqua dest
Bad 40
aqua dest
5min
5min
5min
2min
2min
2min
2min
2min
1min
1min

DNA test - Goodheart Mastiffs

Figurenlijst (74 kB, 10 januari 2013)

SYMPOSIUM GENETICA VOOR DE FOKKERIJ Op 18 juni jl

140.000

Financieel eindverslag en slotuitdelingslijst in het

1. 1. A s 2. z Blauwe Sluis Aan de Noor steiger

Humane biologische sporen en DNA - Nederlands Forensisch Instituut

Met DNA voor lage bloeddruk word je oud

Deze 19 DNA testen zijn toegepast bij BACTEROIDES

Amsterdam DNA: Street Art