Gecombineerde analysemethoden voor de routinematige

Cocaïne HCl; benzoylecgonine; HPLC; UV-spectrofotom
A
Extr ct
INLEIDING
Cocaïne HCl wordt als oplossing toegepast bij oppervla
van Horner [1]. De stabiliteit van cocaïne HCl in oploss
onderhevig. De mate van hydrolyse is sterk afhankelijk
oplossingen treedt bij een pH > 5,5 snelle hydrolyse op
hydrolyse. Deze vorm van hydrolyse resulteert in het o
lichaam wordt benzoylecgonine gevormd door zowel en
Daarnaast vindt in het lichaam door enzymatische hydr
methylecgonine en benzoëzuur en norcocaïne [3].
Gecombineerde analysemethoden voor
de routinematige bepaling van cocaïne en
benzoylecgonine in cocaïne oplossingen.
F. Smit*, S. Koopmans en J.P. Yska
Klinisch Farmaceutisch Laboratorium
Medisch Centrum Leeuwarden
Postbus 888, 8901 BR Leeuwarden
* Correspondentie
Samenvatting
Een UV-spectrofotometrische bepalingsmethode, gecombineerd met een immunoassay, is opgezet als sneller en
minder milieubelastend alternatief voor een RP-HPLC
methode, voor de bepaling van cocaïne HCl en het ontledingsproduct benzoylecgonine in oplossingen.
De opgezette UV-spectrofotometrische bepalingsmethode,
gecombineerd met een immunoassay is geschikt bevonden
voor de kwaliteitscontrole van cocaïne HCl en benzoylecgonine in cocaïne oplossingen.
Sleutelwoorden
Cocaïne HCl; benzoylecgonine; HPLC; UV-spectrofotometrie; immunoassay; methodevergelijking.
Inleiding
Cocaïne HCl wordt als oplossing toegepast bij oppervlakteanesthesie en als diagnosticum bij het syndroom van
Horner [1]. De stabiliteit van cocaïne HCl in oplossing
is uitgebreid onderzocht. Cocaïne is aan hydrolyse
onderhevig. De mate van hydrolyse is sterk afhankelijk van
pH en temperatuur. In waterige cocaïne HCl oplossingen
treedt bij een pH > 5,5 snelle hydrolyse op [2]. Het gaat
in dat geval om niet enzymatische hydrolyse. Deze
vorm van hydrolyse resulteert in het ontledingsproduct
benzoylecgonine (zie fig. 1). In het lichaam wordt
benzoylecgonine gevormd door zowel enzymatische, als
niet enzymatische hydrolyse. Daarnaast vindt in het lichaam
door enzymatische hydrolyse de vorming plaats van de
ontledingsproducten methylecgonine en benzoëzuur en
norcocaïne [3].
Tot 2004 werd in het laboratorium van de apotheek van het
Medisch Centrum Leeuwarden het gehalte aan cocaïne HCl
in waterige oplossingen bepaald door middel van een UVspectrofotometrische methode. Eventuele ontledingsproducten zijn daarbij echter niet afzonderlijk waar te nemen.
Aangenomen wordt dat de molaire absorptie van benzoylec-
32
Fig.1: Hydrolyse van cocaïne. In vivo vinden zowel
de enzymatische, als de niet enzymatische hydrolyse
plaats.
vitro vindtvan
alleen
de spontane
nietvinden
enzymatiFig.1: In
Hydrolyse
cocaïne.
In vivo
sche
hydrolyse
plaats. (overgenomen
zowel
de enzymatische,
als de nietuit [3])
enzymatische hydrolyse plaats. In vitro vindt
alleen de spontane niet enzymatische hydrolyse
gonine bij 232 nm ongeveer gelijk is aan die van cocaïne
plaats. (overgenomen uit [3])
HCl [4]. In die wetenschap is een HPLC methode ontwikkeld
om cocaïne HCl en haar eventuele ontledingsproducten te
kunnen kwalificeren en kwantificeren. Tijdens een intern
opgezet
houdbaarheidsonderzoek
in Cocaïne HCl
4%de
oogTot
2004
werd in het laboratorium
van
druppels is gebleken dat er na ontleding 2 pieken ontstaan
apotheek van het Medisch Centrum Leeuwarden
in het chromatogram.
het ge
bepaald door middel van een UV-spectrofotometrische
echter
nemen.
Aangenomen w
Op basis niet
van deafzonderlijk
wetenschap datwaar
in vitrote
enkel
spontane
bij
232 nm
ongeveer gelijk
is aanisdie
van cocaïne HCl [
hydrolyse
tot benzoylecgonine
kan optreden,
de extra
ontwikkeld
om
cocaïne
HCl
en
haar
eventuele
ontleding
piek naast de cocaïne HCl in het chromatogram toentertijd
Tijdens
een
intern
opgezet
houdbaarheidsonderzoek
in
gekwalificeerd als benzoylecgonine.
Doordat een gevalideerde
referentiestofinvoor
ontleding
2 pieken ontstaan
hetbenzoylecchromatogram.
gonine niet voorhanden was en zeer moeilijk verkrijgbaar,
werd het gehalte benzoylecgonine gekwantificeerd met
behulp van een immunoassay bepalingsmethode. De
gebruikte assay test specifiek op benzoylecgonine (bij
cocaïne gebruik de belangrijkste metaboliet in het lichaam),
en kan daarom prima worden gebruikt voor het bepalen van
benzoylecgonine in waterige oplossingen.
Tijdens het huidige onderzoek is met een oude, alleen voor
Tijdens het onderzoek is in 2 verschillende charges Cocaïne HCl 7
gemeten op tijdstippen verspreid tussen dag 0 en dag 15. De cha
kamertemperatuur en gedurende de nacht bij 80ºC. De laatste m
laatste periode stonden de charges alleen bij kamertemperatuur.
tijdstippen gehaltebepalingen gedaan met behulp van: HPLC (coc
en UV-spectrofotometrie (totaal cocaïne HCl en benzoylecgonine).
A
Extr ct
In figuur 2 zijn de gehaltebepalingen schematisch weergegeven.
research te gebruiken, referentiestof benzoylecgonine-D3
bevestigd dat de extra piek in het chromatogram inderdaad
benzoylecgonine is.
Gehaltebepalingen
methodes
Combinatie UV en
Immunoassay (IA)
HPLC
Bij een houdbaarheidsonderzoek dient gebruik te worden
gemaakt van een gevalideerde HPLC methode. In dit
onderzoek beschrijven wij echter de mogelijkheid om bij
voorraadbereidingen van cocaïne HCl oplossingen voor
de kwaliteitscontrole van het eindproduct een eenvoudige,
minder tijdrovende en minder milieubelastende UVspectrofotometrische bepaling voor het gehalte cocaïne HCl
te gebruiken, met daarnaast een immunoassay bepaling
voor het gehalte van ontledingsproduct benzoylecgonine.
Doel
Het vaststellen van de geschiktheid van een immunoassay
voor het volgen van de ontleding van cocaïne naar
benzoylecgonine in cocaïne HCl oplossingen, naast een
snelle gehaltebepaling van cocaïne HCl met behulp van UVspectrofotometrie.
Methode ontwikkeling
In de wetenschap dat ontleding van een cocaïne HCl
oplossing sneller gaat bij hogere pH en hogere temperatuur
[2], is als vooronderzoek een cocaïne HCl oplossing
geforceerd ontleed met behulp van buffer pH 7 en pH
9, bij kamertemperatuur en bij 80ºC. De ontleding ging
in alle combinaties echter te snel om voor dit onderzoek
geschikt te zijn. Voor dit onderzoek is daarom gekozen
voor geforceerd ontleden zonder buffer en alleen bij hogere
temperatuur. Hierdoor ontstond een geleidelijke ontleding
die goed te volgen was tot een omzetting van ca. 15%.
Verder ontleden heeft geen zin gezien het doel van het
onderzoek. De eis voor het gehalte cocaïne HCl is immers
90 – 110%.
Onderzoek
Tijdens het onderzoek is in 2 verschillende charges Cocaïne
HCl 7% oplossing de ontleding gevolgd. Er is gemeten op
tijdstippen verspreid tussen dag 0 en dag 15. De charges
stonden hierbij gedurende de dag bij kamertemperatuur en
gedurende de nacht bij 80ºC. De laatste meting is gedaan
na 4 maanden. Tijdens de laatste periode stonden de
charges alleen bij kamertemperatuur. Van beide charges
zijn op genoemde tijdstippen gehaltebepalingen gedaan
met behulp van: HPLC (cocaïne HCl), immunoassay
(benzoylecgonine) en UV-spectrofotometrie (totaal
cocaïne HCl en benzoylecgonine). In figuur 2 zijn de
gehaltebepalingen schematisch weergegeven.
De UV-spectra van cocaïne HCl en benzoylecgonine zijn
gelijk en de specifieke extincties van beide stoffen liggen
vlak bij elkaar (theoretisch E1% resp. ca. 390 [5] en ca.
UV: Gehalte Cocaïne HCl+
benzoylecgonine
Immunoassay (IA):
Gehalte benzoylecg.
benzoylecgonine
UV-IA
Gehalte Cocaïne HCl
Gehalte Cocaïne HCl
Fig.2: Schematisch overzicht gehaltebepalingen in
monsters
Fig.2: Schematisch overzicht gehaltebepalingen in monsters
376 [6]). Beide stoffen zullen daarom een vergelijkbare
De UV-spectra van cocaïne HCl en benzoylecgonine zijn gelijk en
bijdrage aan de extinctie in de oplossing leveren, waardoor
liggen vlak bij elkaar (theoretisch E1% resp. ca. 390 [5] en ca. 376
de totale extinctie
nagenoeg
hetzelfde
zal blijven.
vergelijkbare
bijdrage
aan
de extinctie
in deUitgaande
oplossing leveren, wa
van het feit dat 1 mmol cocaïne HCl ontleedt in 1 mmol
benzoylecgonine, is het, met immunoassay, gemeten
gehalte benzoylecgonine, berekend als percentage van het
totaal.
Het totaal, met UV-spectrofotometrie, gemeten gehalte,
verminderd met het percentage gevormde benzoylecgonine,
gemeten met immunoassay, (UV-IA) is het werkelijke gehalte
aan cocaïne HCl in de monsters. Dit berekende, werkelijke
gehalte moet gelijk zijn aan het gehalte cocaïne HCl bepaald
met HPLC (zie fig.2).
Om in de toekomst een snelle UV-spectrofotometrische
bepaling, samen met een immunoassay te kunnen gaan
uitvoeren, moeten we beide meetseries (UV-IA en HPLC)
met elkaar vergelijken. Voor die vergelijking maken we
gebruik van de gepaarde T-toets in EXCEL, dubbelzijdig,
met betrouwbaarheidsniveau α = 0,05 [7].
Als er geen significant verschillende resultaten gevonden
worden, kunnen we concluderen dat de gemiddelde
methodejuistheid niet significant van 0 afwijkt. De H0
hypothese wordt gesteld: de beide groepen metingen zijn
gelijk. H0 wordt geaccepteerd indien berekende waarde p>α.
Materialen / Methoden
Grondstoffen en oplossingen
Grondstoffen:
Cocaïne HCl: Duchefa 249246
Benzoylecgonine-D3: UMCG Groningen, oud, alleen voor
research/piek identificatie
Kaliumdiwaterstoffosfaat: Merck 1.04873
Fosforzuur 85%: Merck 1.00573
Triëthylamine: Merck 808352
Kaliumhydroxide: Merck 1.05033
Acetonitril (HPLC): Labscan C02C11X
Steriel water (water voor irrigatie): Baxter TKF7114
33
A
Extr ct
Oplossingen:
Buffer pH 3: Los 1,36 g Kaliumdiwaterstoffosfaat op in 900
ml water. Breng op pH 3 met Fosforzuur 85% en vul aan tot
1000 ml met water.
STIP buffer pH 3,3: Voeg aan 1060 ml water 1000 µl
Fosforzuur 85% en 300 µl Triëthylamine toe. Breng op pH
3,3 met Kaliumhydroxide 10% oplossing.
Immunoassay reagens:
COCAINE II reagens: Roche 03800130190
Standaard oplossingen
Voor HPLC:
Stockoplossing calibratie Cocaïne HCl (ca. 200 mg/l):
Ca. 50 mg (nauwkeurig afgewogen) Cocaïne HCl oplossen
en aanvullen met buffer pH 3 tot 250,0 ml.
Stockoplossing referentie Cocaïne HCl (ca. 200 mg/l):
Ca. 50 mg (nauwkeurig afgewogen) Cocaïne HCl oplossen
en aanvullen met buffer pH 3 tot 250,0 ml
Werkoplossing 1-puntscalibratie Cocaïne HCl
(ca. 0,014 mg/ml):
700 µl stockopl. calibratie aanvullen met eluens tot 10,0 ml.
Werkoplossing referentie Cocaïne HCl (ca. 0,010 mg/ml):
500 µl stockopl. referentie aanvullen met eluens tot 10,0 ml.
Voor immunoassaybepaling (COBAS INTEGRA 400):
Calibrator: Preciset DAT Plus I: Roche 03304671190
Controle: Liquicheck Urine Toxicology Control S2 low
opiate: BIORAD 467
Werkoplossingen monsters
Opl.a: monster Cocaïne HCl 7% 400 x verdunnen met buffer
pH 3 voor immunoassaybepaling.
Opl.b: opl.a 20 x verdunnen in eluens voor HPLC bepaling.
Opl.c: opl.a 10 x verdunnen in buffer pH 3 voor UVspectrofotometrische bepaling.
Apparatuur en methoden
34
HPLC bepaling:
Apparatuur: Waters Alliance 2695 HPLC system met
Waters 2998 Photodiode Array detector
Software: Waters Empower Pro
Methode: Kolom: 125-4 Lichrospher® 100 RP 18e (5 µm),
Merck 50734
Eluens: STIP buffer pH 3,3: Acetonitril met als verhouding
81:19 (mengen op de pomp)
Detectie: PDA detector, λ=235 nm
Gehaltebepaling cocaïne HCl in opl.b berekend met calibratie en t.o.v. referentie.
Immunoassaybepaling benzoylecgonine:
Apparatuur: Roche COBAS INTEGRA 400
Assay: COBAS INTEGRA COCII
Methode: KIMS (Kinetic Interaction of Micro particles in a
Solution)
Gehaltebepaling benzoylecgonine in opl.a berekend t.o.v.
controle.
UV-spectrofotometrische bepaling:
Apparatuur: Shimadzu UV-1700 UV-VIS Spectrofotometer
Methode: Absorbance, Slit Width: 1,0 nm.
Maxima bij 232 en 275 nm
Extinctiebepaling in opl.c t.o.v. buffer pH 3 bij maximum
232 nm.
Gehalteberekening aan de hand van E1%.
Resultaten en discussie
HPLC:
De pieken gevonden in de HPLC chromatogrammen zijn
met behulp van standaarden geïdentificeerd als cocaïne
HCl en benzoylecgonine. Gedurende het onderzoek werd
zoals verwacht de piek van de cocaïne HCl steeds lager
en de piek van de benzoylecgonine, en dus de ontleding,
steeds hoger (zie fig.3a en fig.3b).
Fig. 3a: Chromatogram van Cocaïne HCl oplossing
direct na bereiding
hoger in de loop van het stabiliteitsonderzoek. Deze stijgi
benzoylecgonine piek in het bijbehorende HPLC chromato
De met de immunoassay gevonden concentratie benzoyle
benzoylecgonine piek in het bijbehorende chromatogram,
A
Extr ct
BENZOYLECGONIN
E(concentratie immunoassay t.o.v.
piekhoogte HPLC)
25000
20000
y = 2,6916x - 45,658
R=
0,998499
15000
10000
500
0
Geme
ten
conc.
Benz
oylec
gonin
e
Integr
a
(µg/l)
0
0
2000
▲Fig. 3b: Chromatogram van Cocaïne HCl oplossing na geforceerd ontleden bij 80ºC
4000
600
0
8000
Hoogte benzoylecgonine HPLC (µAU)
Fig. 4: Concentratie benzoylecgonine t.o.v. piekhoogte
Immunoassay
UV spectrofotometrie
De gebruikte immunoassay meet specifiek de benzoylecDe gemeten extinctie bij Emax (232 nm) en het daaruit
gonine in de oplossing. Deze waarde werd steeds hoger in
berekende
gehalte cocaïne HCl in de oplossing bleef
UV
spectrofotometrie:
de
loop
van
het
stabiliteitsonderzoek.
Deze
stijging
verliep
zoals
verwacht
gedurende het onderzoek constant en
Immunoassay:
De gemeten extinctie
bij Emax (232 nm) en het daaruit b
gelijk
aan
de
stijging
van
de
benzoylecgonine
piek
in
het
daalde
niet,
ondanks
de ontleding
gemeten
met de
De gebruikte immunoassay meet specifiek de benzoylecgonine in de oplossing. Deze
waarde
werd steeds
zoals
verwacht
gedurende
het
onderzoek constant en daa
bijbehorende
HPLC
chromatogram.
hoger
in de loop
van
het stabiliteitsonderzoek. Deze stijging verliep
gelijk aanDe
deUV-spectrofotometrische
stijging van de
andere methodes.
bepaling
andere methodes. De UV-spectrofotometrische bepaling a
De met de immunoassay
concentratie
benzoylecbenzoylecgonine
piek in gevonden
het bijbehorende
HPLC
chromatogram.
alleen is daarom niet geschikt voor het bepalen van
dedehoogte
vantegen
ontleding
in een
cocaïne
HClInoplossing. In
gonine,
uitgezet
tegen de hoogte
van deconcentratie
benzoylecgonine
De
met de
immunoassay
gevonden
benzoylecgonine,
uitgezet
de
van HCl
de oplossing.
hoogte
van ontleding
in hoogte
een cocaïne
na
de
bereiding
opgenomen.
benzoylecgonine
piek inchromatogram,
het bijbehorende
chromatogram,
geeft
een5 lineair
beeld
(zie fig.4).
piek in het bijbehorende
geeft een
lineair
figuur
is het UV
spectrum
van een oplossing direct
beeld (zie fig.4).
na de bereiding opgenomen
BENZOYLECGONIN
E(concentratie immunoassay t.o.v.
piekhoogte HPLC)
BENZOLECGONIN
(concentratie immunoassay t.o.v.
piekhoogte HPLC)
25000
25000
y = 2,6916x - 45,658
R=
0,998499
20000
20000
15000
15000
10000
10000
500
5000
Geme
ten
conc.
Benz
oylec
gonin
e
Integr
a
(µg/l)
0
00
0
0
2000
2000
4000
4000
6000
600
0
8000
8000
Hoogte benzoylecgonine HPLC (µAU)
▲Fig. 4: Concentratie benzoylecgonine t.o.v. piekhoogte
Fig. 4: Concentratie benzoylecgonine t.o.v. piekhoogte
▲Fig. 5: UV spectrum van Cocaïne HCl 7% oplossing
direct na de bereiding (T=0)
UV spectrofotometrie:
De gemeten extinctie bij Emax (232 nm) en het daaruit berekende gehalte cocaïne HCl in de oplossing bleef 35
zoals verwacht gedurende het onderzoek constant en daalde niet, ondanks de ontleding gemeten met de
andere methodes. De UV-spectrofotometrische bepaling alleen is daarom niet geschikt voor het bepalen van
de hoogte van ontleding in een cocaïne HCl oplossing. In figuur 5 is het UV spectrum van een oplossing direct
na de bereiding opgenomen.
(15 dgn)
T=7
(4 mnd)
103,3
13,59
Gehalte UV
%
Percentage
benzoylecgonine
(IA) %
A
Extr ct
Charge 2:
Tijdstip
T=0
102,4
1,32
Fig. 5: UV spectrum van Cocaïne HCl 7% oplossing direct na de bereiding (T=0)
In tabel
Tabel 2: Gehalte cocaïne HCl op bepaalde tijdstippen:
T=11 zijn de, met UV-spectrofotometrie berekende,
101,4
2,46
berekende gehaltes UV-Benzoylecgonine (BE) en
totale
gehaltes
van
de
oplossing
weergegeven
geduren(7
dgn)
In tabel 1 zijn de, met UV-spectrofotometrie berekende, totale
gehaltes
van de gehaltes
oplossingmet
weergegeven
gemeten
en berekende
HPLC.
degedurende
de
tijd van het
alsmede
het percentage
T=2
de onderzoek
tijd
van het
onderzoek
alsmede het percentage
▼ benzoylecgonine, gemeten met de
101,9
2,36
(10
dgn)
benzoylecgonine,
gemeten met de immunoassay.
immunoassay.
T=3
101,9
3,81
(11 dgn)
Charge 1:
Gehalte
Percentage
T=4
UV
benzoylecgonine
Charge 1:
Gehalte
Gehalte
102,5
10,47
(4 mnd)
Tijdstip
%
(IA) %
tijdstip
UV-IA (%)
HPLC (%)
Tabel 1: Gehalte cocaïne HCl gedurende het
T=0
103,1
0,11
onderzoek in beide charges gemeten en berekend
T=0
103,0
104,4
T=1
met UV-spectrofotometrie
en het
102,4
1,47 bijbehorend
T=1
(1 dag)
100,9
100,2
percentage
benzoylecgonine
gemeten
met
(1 dag)
T=2
immunoassay.
100,8
3,75
T=2
(3 dgn)
97,0
96,7
Methodevergelijking
(3
dgn)
T=3
In tabel
2 staan de resultaten
102,1 van de verschillende
5,67
T=3
(4 dgn)
96,4
96,7
gehaltebepalingen
van cocaïne HCl weergegeven. Op
(4 dgn)
T=4
verschillende
tijdstippen
worden
de
resultaten,
verkregen
100,5
6,89
T=4
(11 dgn)
93,7
96,3
met UV-spectrofotometrie
verminderd met het percentage
(11 dgn)
T=5
benzoylecgonine
(UV-IA), vergeleken met die van de HPLC
T=5
101,5
6,63
94,9
93,7
(14 dgn)
methode
(14 dgn)
T=6
T=6
101,6
8,51
93,0
92,1
Tabel(15
2: dgn)
Gehalte cocaïne HCl op bepaalde tijdstippen:
(15 dgn)
berekende
T=7 gehaltes UV-Benzoylecgonine (BE) en
T=7
103,3
89,7
85,9
gemeten
en berekende
gehaltes met13,59
HPLC
(4 mnd)
(4 mnd)
Percentage
Vergelijking
van beide
meetmethoden
op basis van de
Charge 2:
Gehalte
UV
benzoylecgonine
meetwaarden
Tijdstip (gepaarde%T-toets) levert op: p=0,92.
(IA)
Omdat p > α (0,05), wordt de hypothese
dat%
beide series
meetwaarden
gelijk
zijn,
geaccepteerd.
T=0
102,4
1,32
T=1
101,4
2,46
(7 dgn)
CONCLUSIE
T=2
101,9
2,36
(10 dgn)
T=3
101,9
3,81
(11 dgn)
T=4
102,5
10,47
(4 mnd)
Charge 2:
tijdstip
T=0
T=1
(7 dgn)
T=2
(10 dgn)
T=3
(11 dgn)
Charge 1:
T=4
tijdstip
(4 mnd)
Gehalte
UV-IA (%)
Gehalte
HPLC (%)
101,1
102,7
99,0
101,0
99,6
99,4
98,1
Gehalte
92,0 (%)
UV-IA
98,5
38
Gehalte
91,4 (%)
HPLC
Tabel 1: 1:
Gehalte
HCl hetgedurende
het
▲Tabel
Gehalte
cocaïne cocaïne
HCl gedurende
onderonderzoek
in beide
charges
gemeten
zoek
in beide charges
gemeten
en berekend
met en
UV- berekend
T=0
103,0
104,4
met UV-spectrofotometrie
het bijbehorend
spectrofotometrie
en het bijbehorend en
percentage
T=1
100,9
100,2
benzoylecgonine
met immunoassay.
percentage gemeten
benzoylecgonine
gemeten
met
Conclusie
(1 dag)
immunoassay.
T=2
Met dit onderzoek hebben wij97,0
vastgesteld dat een
gehalte96,7
Methodevergelijking
(3 dgn)
bepaling van een cocaïne HCl oplossing goed uitvoerbaar
In tabel 2 staan de resultaten van de verschillende
T=3
96,4
96,7
is met behulp
van een UV-spectrofotometrische
methode
gehaltebepalingen van cocaïne HCl weergegeven. Op
(4 dgn)
verschillende tijdstippen worden de resultaten, verkregensamen metT=4
een specifieke immunoassay voor het bepalen
Methodevergelijking
93,7
96,3
met UV-spectrofotometrie verminderd met het percentage
van het ontledingsproduct
benzoylecgonine.
Aangetoond
is
(11 dgn)
benzoylecgonine
(UV-IA),
vergeleken
met
die
van
de
HPLC
In tabel 2 staan de resultaten van de verschillende gehaltedat de waarden
T=5 van de benzoylecgonine gemeten met de
94,9
93,7
methodevan cocaïne HCl weergegeven. Op verschilbepalingen
immunoassay
een lineair verband hebben met de piek(14 dgn)
T=6HPLC chromatogram. Daarnaast is aanlende tijdstippen worden de resultaten, verkregen met
hoogte in een
93,0
92,1
Tabel 2: Gehalte cocaïne HCl op bepaalde tijdstippen:
dgn)
UV-spectrofotometrie verminderd met het percentage
getoond (15
dat de
concentratie cocaïne HCl bepaald met
berekende gehaltes UV-Benzoylecgonine (BE) en
T=7
benzoylecgonine
(UV-IA), vergeleken
met die
vanHPLC
de HPLC
UVspectrofotometrie,
verminderd
89,7met het percentage
85,9
gemeten en berekende
gehaltes
met
(4
mnd) met de immunoassay, gelijk is aan de
methode.
ontleding gemeten
concentratie cocaïne HCl bepaald met behulp van de HPLC.
Vergelijking van beide meetmethoden op basis van de
Charge
2:
Gehalte
Vergelijking
van beide
meetmethoden
oplevert
basis van
Hiermee
is een snellere
en,Gehalte
door het ontbreken
van
meetwaarden
(gepaarde
T-toets)
op: de
p=0,92.
tijdstip
UV-IA
(%)
HPLC
(%)
Omdat p >(gepaarde
α (0,05),T-toets)
wordt de
hypothese
dat beide seriesorganische
meetwaarden
levert
op: p=0,92.
oplosmiddelen,
milieuvriendelijker
bepaling
meetwaarden
gelijk
geaccepteerd.
Omdat
p > α (0,05),
wordtzijn,
de hypothese
dat beide series
mogelijk als gehaltebepaling van een voorraadbereiding
meetwaarden gelijk zijn, geaccepteerd.
cocaïne HCl
oplossing.
T=0
101,1
102,7
CONCLUSIE
36
T=1
(7 dgn)
T=2
(10 dgn)
T=3
(11 dgn)
T=4
(4 mnd)
99,0
101,0
99,6
99,4
98,1
92,0
98,5
91,4
38
A
Extr ct
Voor het uitvoeren van uitgebreid houdbaarheidsonderzoek
in cocaïne HCl oplossingen is deze methode niet geschikt
en zal moeten worden uitgeweken naar de uitgebreide
HPLC bepaling.
Dit onderzoek moet worden gezien als een pilot. Na
evaluatie kan vervolgens de methode worden gevalideerd
en opgenomen worden in het analysepakket van het
laboratorium.
Gebaseerd op onderzoek van F. Smit in het kader van
haar opleiding tot Specialist Klinische-Farmaceutische en
-Toxicologische Analyse
Literatuur/Referenties
1. Monograﬁe Informatorium Medicamentorum,
www.kennisbank.knmp.nl , geraadpleegd 17-06-2011
2. LNA-mededeling cocaïnechloride oogdruppels
5% LNA, februari 2011, www.kennisbank.knmp.nl ,
geraadpleegd 17-06-2011
3. Warner, A., Norman, A.B., “Mechanisms of Cocaine
Hydrolysis and Metabolism in Vitro and in Vivo:
A Clariﬁcation.” Therapeutic Drug Monitoring,
2000;22:266-70
4. Das Gupta, V., “Stability of cocaine hydrochloride
solutions at various pH values as determined by
high-pressure liquid chromatography.” International
Journal of Pharmaceutics, 1982;10:249-57+
5. European Pharmacopoeia 7.0, Council of Europe,
Strasbourg, 2010, p1738
6. Clarke’s Analysis of Drugs and Poisons, Third ed,
Pharmaceutical Press, London-Chicago, 2010, p687
7. Dr. J.W.A. Klaessens, “Statistiek in het laboratorium
met EXCEL”, Syntax Media, Arnhem, 2009, p52-55
37

Download Report