Signalisatie in de neurovasculaire
eenheid: een focus op
inflammatoire, endothelio-gliale
interacties
Bart Vanderborght
Verhandeling ingediend tot
het verkrijgen van de graad van
Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: Prof. Dr. Luc Leybaert
Begeleidster: Dr. Marijke De Bock
Vakgroep Medische Basiswetenschappen
Academiejaar 2013-2014
Signalisatie in de neurovasculaire
eenheid: een focus op
inflammatoire, endothelio-gliale
interacties
Bart Vanderborght
Verhandeling ingediend tot
het verkrijgen van de graad van
Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: Prof. Dr. Luc Leybaert
Begeleidster: Dr. Marijke De Bock
Vakgroep Medische Basiswetenschappen
Academiejaar 2013-2014
“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar
te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder
de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting
uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.”
Datum
(handtekening student)
(Naam student)
(handtekening promotor)
(Naam promotor)
VOORWOORD
Het is gelukt. Ik heb een thesis geschreven. Wat begon als een uitzichtloze situatie, en maar
niet wou vlotten, heeft uiteindelijk dan toch vorm gekregen, en dat gelukkig voor de deadline
van het indienen. Versta mij niet verkeerd, ik ben geen enkele dag met tegenzin naar het labo
vertrokken, en ik ben blij dat ik mijn eerste echte ervaring in het onderzoeksveld op de derde
verdieping van blok B heb mogen opdoen.
Ik bedank mijn promotor Prof. Dr. Luc Leybaert om mij de kans te geven mijn masterproef in
zijn labo te verrichten. Zijn kennis en inzicht in dit vakgebied zijn enorm inspirerend.
Een heel erg dikke merci gaat uit naar mijn begeleidster Dr. Marijke De Bock. Je hebt mij de
ene na de andere techniek aangeleerd, en mij heel wat wetenschappelijke kennis en inzicht
bijgebracht. Je geduld was eindeloos. Hoe vaak heb ik wel niet aan je deur gestaan met een
vraag die voorafgegaan werd door ‘Ik weet dat het misschien een domme vraag is’? Je deed
dit bovendien allemaal met een lach, en je enthousiasme en positieve ingesteldheid waren zeer
aanstekelijk. Ik vond het kortom heel plezant om met jou te mogen samenwerken.
Verder zou ik ook al de andere mensen die deel uit maken van de onderzoeksgroep Fysiologie
willen bedanken voor het creëren van een sfeer waarin het zeer aangenaam werken is, en voor
de hulp die geboden werd wanneer ik daar om vroeg.
Charlotte en Hanne, mijn medestudentjes, jullie ben ik uiteraard niet vergeten. Het was mij
een waar genoegen om jullie het voorbije jaar beter te leren kennen. Jullie zorgden ervoor dat
de sfeer in de studentenkamer altijd goed was. Bedankt voor al de hulp en steun die jullie het
voorbije jaar geboden hebben, en bedankt voor de talloze leuke babbels en momenten.
Tot slot zou ik ook mijn ouders en vrienden willen bedanken voor de steun en afleiding die ik
van hen ontvangen heb gedurende deze stressvolle periode.
INHOUDSTAFEL
LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN .............................................................................
SAMENVATTING .................................................................................................................... 1
SUMMARY ............................................................................................................................... 2
1. INLEIDING ........................................................................................................................... 3
1.1 De structuur en functie van de bloed-hersenbarrière........................................................ 3
1.1.1 Fysische, metabole en transportbarrière .................................................................... 3
1.1.2 Tight juncties ............................................................................................................. 6
1.2.1 Cel-cel interacties ter hoogte van de bloed-hersenbarrière ....................................... 9
1.2.2 Inductie van de bloed-hersenbarrière eigenschappen .............................................. 10
1.2.3 Modulatie van de bloed-hersenbarrière eigenschappen .......................................... 11
1.3 Endothelio-gliale interacties in inflammatoire omstandigheden .................................... 14
1.3.1 Neuroinflammatie .................................................................................................... 14
1.3.2 Onderzoekshypothese/ Doel van het onderzoek ..................................................... 15
2. MATERIALEN EN METHODEN ...................................................................................... 17
2.1 In vivo experimenten ...................................................................................................... 17
2.1.1 Nagaan van de mate van BHB disruptie ................................................................. 17
2.1.2 Nagaan van astrogliale activatie .............................................................................. 19
2.1.3 Nagaan van de rol van connexine kanalen .............................................................. 20
2.1.4 Nagaan van de rol van interastrocytaire Ca2+-signalisatie ...................................... 21
2.2 Celcultuur ....................................................................................................................... 21
2.2.1 Celcultuur opstarten ................................................................................................ 22
2.2.2 Cellen splitsen en uitzaaien ..................................................................................... 22
2.2.3 Cellen invriezen....................................................................................................... 22
2.2.4 Primaire, capillaire endotheelcelcultuur opstarten .................................................. 23
2.3 Gelelektroforese/Western blot en gelatine zymografie .................................................. 24
2.3.1 Cellysaten ................................................................................................................ 25
2.3.2 Hersenlysaten .......................................................................................................... 25
2.3.3 Eiwitconcentratie bepalen ....................................................................................... 25
2.3.4 Western blot ............................................................................................................ 26
2.3.5 Gelatine zymografie ................................................................................................ 28
2.4 Ca2+ imaging................................................................................................................... 29
2.5 Statistische analyse ......................................................................................................... 30
3. RESULTATEN .................................................................................................................... 31
3.1 In vivo ziektekarakteristieken ........................................................................................ 31
3.2 BHB permeabiliteit ........................................................................................................ 32
3.3 Astrogliale activatie ........................................................................................................ 35
3.4 In vitro endotheliale activatie ......................................................................................... 36
3.5 De rol van connexine kanalen ........................................................................................ 37
3.5.1 Endotheliale connexine expressie ........................................................................... 37
3.5.2 Invloed van inhibitie van connexine kanalen op BHB permeabiliteit .................... 38
3.6 De rol van Ca2+-signalisatie ........................................................................................... 40
3.6.1 Inflammatoire, endotheliale en astrogliale Ca2+-signalisatie .................................. 40
3.6.2 Invloed van intracellulaire Ca2+ chelator op BHB permeabiliteit ........................... 40
4. DISCUSSIE .......................................................................................................................... 42
4.1 Doel van het onderzoek .................................................................................................. 42
4.2 Inflammatie .................................................................................................................... 42
4.2.1 Systemische inflammatie......................................................................................... 42
4.2.2 Neuroinflammatie .................................................................................................... 43
4.3 Inflammatoire, endothelio-gliale interacties................................................................... 45
4.3.1 De rol van connexine kanalen ................................................................................. 45
4.3.2 De rol van Ca2+-signalisatie .................................................................................... 46
4.4 Conclusie/Toekomstperspectieven ................................................................................. 47
REFERENTIES ........................................................................................................................ 48
ADDENDUM ...............................................................................................................................
LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN
ABC
aCSF
AM
ANG1
aPKC
AQP4
BCIP
bFGF
BHB
BSA
CREB
CVO
Cx
DAPI
dH2O
DMEM
DMSO
DLG1
ESAM
ET-1
FBS
GADPH
GDNF
GFAP
GK
IκB
IFNγ
IL-1β
IP
IP3
IRF3
IV
JACOP
JAM
LBP
LIF
LPA
LPS
MIP
ATP-binding cassette
artificial cerebrospinal fluid
acetoxymethyl
angiopoetin 1
atypisch proteïne kinase C
aquaporine 4
5-bromo-4-chloro-3-indolyl fosfaat
basic fibroblast growth factor
bloed-hersenbarrière
bovine serum albumin
cAMP respons element-bindend proteïne
circumventriculair orgaan
connexine
4’,6-diamidino-2-fenylindool
gedestilleerd water
dulbecco’s modified eagle medium
dimethylsulfoxide
discs large homolog 1
endotheelcel-selectieve adhesiemolecule
endotheline-1
Fetal Bovine Serum
glyceraldehyde 3-fosfaat dehydrogenase
glial-derived neurotrophic factor
glial fibrillary acidic protein
guanylyl kinase
inhibitor van κB
interferon gamma
interleukine-1 beta
intraperitoneaal
inositol-1,4,5-trifosfaat
interferon regulatie factor 3
intraveneus
junction-associated coiled-coil protein
junctionele adhesiemolecule
LPS-bindend proteïne
leukaemia inhibitory factor
lysophosphatidic acid
lipopolysaccharide
macrophage-inhibitory protein
MMP
NBT
NF-κB
NGS
NO
NVE
PAF
PBS
PDZ-1
PKC
PSD-95
OAP
SDS-PAGE
SH3
TBS
TGFβ
TLCK
TLR4
TNFα
VE
WBA
WBB
ZO
matrixmetalloproteïnase
nitro blauw tetrazolium chloride
nucleaire factor-κB
normal goat serum
stikstofoxide
neurovasculaire eenheid
platelet activating factor
phosphate buffered saline
post synaptic density protein 95, discs large homolog 1 and ZO-1 protein
proteïne kinase C
post synaptic density protein 95
orthogonal array of particles
sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
SRC Homology 3
tris buffered saline
transforming growth factor-β
tosyl lysin chloromethyl ketone
toll-like receptor 4
tumornecrosefactor-alfa
vasculair endotheliaal
washing Buffer A
washing Buffer B
zonula occludens
SAMENVATTING
Cel-cel interacties tussen het cerebraal capillair endotheel van de bloed-hersenbarrière (BHB)
en de verschillende celtypes die deel uitmaken van de neurovasculaire eenheid (NVE) zorgen
enerzijds voor de inductie en het behoud van de BHB, en anderzijds voor de modulatie van
bepaalde eigenschappen van de BHB. Perivasculaire astrocyten, die door middel van hun
eindvoetjes in nauw contact staan met het BHB endotheel, spelen een belangrijke rol in de
modulerende signalisatie. Een groot aantal neuropathieën zal, naast de aanwezigheid van
modulerende, endothelio-gliale interacties, ook gepaard gaan met neuroinflammatie. Daarom
werd in dit onderzoek nagegaan waarop de inflammatoire, endothelio-gliale interacties precies
gebaseerd zijn. In de experimenten werd er gebruik gemaakt van lipopolysaccharide (LPS)
om de cerebrale endotheelcellen te activeren, en disruptie van de BHB te induceren. De
inflammatie werd steeds 3, 6 en 24 uur na de LPS-behandeling nagegaan. Muizen werden, na
eventuele toediening van een connexine mimetisch peptide of een Ca2+-chelator, behandeld
met LPS en nadien geïnjecteerd met fluorescent-gelabelde probes, waarvan de fluorescentieintensiteit in het hersenweefsel bepaald werd, om een beeld te krijgen van de LPSgeïnduceerde BHB disruptie. Verder werd via immunohistochemie de GFAP-expressie in
cryosecties nagegaan, en werd de expressie van Cx37, Cx40, Cx43, albumine, GFAP, NF-κB
en MMP’s in endotheelcel- en hersenlysaten onderzocht door middel van western blotting en
gelatine zymografie. De Ca2+-signalisatie werd in vitro nagegaan via intracellulaire Ca2+concentratiemetingen. De LPS injectie in muizen leidde tot een tijdsafhankelijke stijging van
de BHB permeabiliteit, en astrogliale activatie op het 6h en 24h tijdspunt. De activatie van het
BHB endotheel werd in vitro bevestigd via een LPS-geïnduceerde stijging van het gehalte aan
MMP-9 en geactiveerd NF-κB. Het connexine mimetisch peptide Gap19 zorgde enkel op het
6h tijdspunt voor een daling van de LPS-geïnduceerde BHB disruptie, terwijl Gap27 dit op
alle tijdstippen deed. In vitro werd er zowel astrocytaire als endotheliale, inflammatoire Ca2+signalisatie gedetecteerd, en BAPTA-AM was in vivo in staat om, via Ca2+-chelatie, de LPSgeïnduceerde BHB disruptie tegen te gaan. LPS zal voornamelijk zorgen voor de inductie van
de cerebrale ‘innate’ immuunrespons, terwijl het verdere verloop van de neuroinflammatoire
signalisatie eerder gebaseerd zal zijn op pro-inflammatoire cytokines, geproduceerd door
LPS-gestimuleerde cellen. De neuroinflammatoire, endothelio-gliale signalisatie is gebaseerd
op de intercellulaire propagatie van Ca2+-golven via connexine kanalen. Dit gebeurt enerzijds
via gap junctionele diffusie van IP3 en anderzijds via hemikanaal-gemedieerde paracriene
signalisatie.
SAMENVATTING
1
SUMMARY
BACKGROUND: Intercellular interactions between endothelial cells of the blood-brain
barrier (BBB) and other components of the neurovascular unit are responsible for the
induction and maintenance as well as the modulation of the blood-brain barrier properties.
Perivascular astrocytes play an important role in the modulating signaling in the brain. Two
characteristics that a lot of neuropathologies have in common, are the presence of modulating
endothelial-glial interactions and neuroinflammation. This study will investigate these
inflammatory endothelial-glial interactions.
METHODS: Lipopolysaccharide (LPS) was used to induce neuroinflammation, which was
analyzed 3h, 6h and 24h after treatment with LPS. BBB disruption was visualized through the
injection of fluorescent probes in LPS-treated mice. Connexin mimetic peptides and BAPTAAM were injected to analyze the connexin channels and Ca2+-signaling respectively.
Immunohistochemistry, western blotting and gelatin zymography were used to detect Cx37,
Cx40, Cx43, albumin, GFAP, NF-κB and MMPs. The Ca2+-signaling of endothelial and glial
cells were measured to investigate which inflammatory mediators can stimulate them.
RESULTS: LPS injection in mice led to a time-dependent BBB disruption, together with
astrogliosis. An increased endothelial content of MMP-9 and activated NF-κB confirmed the
activation of the BBB endothelium. Connexin mimetic peptides and BAPTA-AM showed that
connexin channels and Ca2+-signaling play an important role in inflammatory, endothelialglial interactions.
CONCLUSIONS: LPS mainly induces the cerebral innate immune response, while the further
course of neuroinflammation will be mediated by proinflammatory cytokines, produced by
LPS-stimulated cells. Inflammatory endothelial-glial interactions are based on intercellular
Ca2+-signaling through gap junctions and hemichannels.
SUMMARY
2
1. INLEIDING
1.1 De structuur en functie van de bloed-hersenbarrière
De bloed-hersenbarrière (BHB) is een selectieve barrière tussen het bloed en de interstitiële
vloeistof in het centrale zenuwstelsel, en wordt voornamelijk gevormd door cerebraal capillair
endotheel. De voornaamste verschillen tussen dit endotheel en het capillair endotheel in de
periferie zijn de aanwezigheid van zeer hechte tight juncties tussen de endotheelcellen, de
afwezigheid van fenestraties in de endotheliale plasmamembraan, de minimale pinocytotische
activiteit en het hoge gehalte aan mitochondriën, die energie leveren voor de vele transporters
en enzymen die deel uitmaken van de BHB [1-2].
1.1.1 Fysische, metabole en transportbarrière
De barrièrefunctie van de BHB bestaat uit de combinatie van een fysische, metabole en
transportbarrière. Er is sprake van een fysische barrière doordat de intercellulaire ruimten
tussen de endotheelcellen van de BHB ongeveer 50 tot 100 keer nauwer zijn dan in het
capillair endotheel in de periferie, door de aanwezigheid van tight juncties. Deze vernauwing
van de intercellulaire ruimten tussen de endotheelcellen van de BHB zorgt voor een sterke
reductie van de paracellulaire diffusie van hydrofiele moleculen doorheen deze intercellulaire
ruimten [3-4]. Zelfs de passieve diffusie van kleine ionen, zoals Na+ en Ca2+, wordt
grotendeels verhinderd, waardoor de transendotheliale elektrische weerstand, die in perifere
capillairen typisch een waarde aanneemt tussen 2 en 20 ohm.cm2, stijgt tot een waarde groter
dan 1.000 ohm.cm2 over de BHB [5].
Bepaalde gassen die in het bloed aanwezig zijn, zoals O2 en CO2, kunnen echter wel nog
passief diffunderen doorheen de BHB, in de richting van hun concentratiegradiënt. De O2aanvoer en CO2-afvoer in de hersenen is dus afhankelijk van de bloedtoevoer naar de
hersenen, en is adequaat zolang de cerebrale bloedtoevoer tussen bepaalde fysiologische
grenzen gelegen is. Ook een groot aantal vetoplosbare moleculen kunnen de hersenen op een
passieve wijze binnentreden, doordat ze vrij kunnen diffunderen doorheen de lipide
celmembraan van de cerebrale capillaire endotheelcellen [6]. Doordat de paracellulaire route
voor kleine hyfrofiele moleculen sterk gereduceerd is, zal het transport van een groot aantal
essentiële polaire nutriënten, zoals glucose en aminozuren, voornamelijk transcellulair
gebeuren. De aanwezigheid van specifieke transportsystemen op zowel de luminale als de
abluminale zijde van het cerebraal capillair endotheel maakt deel uit van het transportbarrière
aspect van het BHB endotheel. Een deel van die transportsystemen zal zorgen voor de
INLEIDING
3
aanvoer van nutriënten die noodzakelijk zijn voor het goed functioneren van de hersenen,
zoals de GLUT-1 glucose transporter, verschillende aminozuurtransporters, transporters voor
nucleosiden en nucleobasen,… [3-4,6]. Een ander deel van de transportmechanismen van de
BHB zal zorgen voor de afvoer van componenten die potentieel schadelijk zijn voor het
centrale zenuwstelsel. Deze neurotoxische substanties kunnen endogene metabolieten of
eiwitten zijn, of xenobiotica, die niet door het lichaam worden aangemaakt. Een groot aantal
van deze substanties wordt actief uit de hersenen gepompt door energie-afhankelijke ATPbinding cassette (ABC) efflux transporters, aangezien eventuele neuronale schade, aangericht
door neurotoxines, permanent is en dus niet meer hersteld kan worden in volwassen hersenen.
De belangrijkste efflux transporter aan de luminale zijde van het cerebraal capillair endotheel
is het energie-afhankelijke P-glycoproteïne. Deze ABC efflux transporter heeft een brede
specificiteit, pompt meerdere lipofiele moleculen actief uit de hersenen en speelt ook een
belangrijke rol in de bescherming van de hersenen tegen xenobiotica [3,6-7]. In de abluminale
membraan van het BHB endotheel gebeurt de afvoer voornamelijk door Na+-afhankelijke
transportsystemen, zoals bijvoorbeeld verschillende Na+-afhankelijke glutamaat transporters
[8]. Aan de hand van een aantal specifieke ionkanalen en -transporters, die het ionentransport
doorheen de BHB reguleren, wordt de samenstelling van de interstitiële vloeistof in de
hersenen geregeld, en wordt ervoor gezorgd dat deze een optimaal medium vormt voor
neurale functie en synaptische signalisatie. De ionensamenstelling van de interstitiële
vloeistof in de hersenen verschilt hierdoor van die van het bloedplasma. Zo zal de K+- en
Ca2+-concentratie hoger zijn in het bloedplasma, en zal de interstitiële vloeistof in de hersenen
een hogere Mg2+-concentratie hebben. De BHB zal zorgen voor homeostase van deze
optimale samenstelling van de interstitiële vloeistof, en zo de hersenen dus beschermen tegen
fluctuaties in de samenstelling van het bloedplasma, die bijvoorbeeld optreden na maaltijden
en fysieke inspanningen [4,6]. Buiten de aanwezigheid van tight juncties, verschilt het
cerebraal capillair endotheel van het capillair endotheel in de periferie door zijn veel lagere
endocytotische en transcytotische activiteit. Grote hydrofiele moleculen, zoals peptiden en
lipoproteïnen, zullen dus over het algemeen niet opgenomen worden door het endotheel van
de BHB. Hierdoor is de eiwitconcentratie van de interstitiële vloeistof in de hersenen veel
lager is dan die van het bloedplasma. Dit is nodig, aangezien een aantal plasma-eiwitten, zoals
pro-trombine en plasminogeen, schadelijk zijn voor het zenuwweefsel, doordat ze via
cellulaire activatie tot apoptose kunnen leiden [6]. Toch kunnen bepaalde proteïnen, zoals
insuline en transferrine, specifiek opgenomen worden door middel van receptor-gemedieerde
transcytose, en treedt er in zekere mate ook minder specifieke absorptie-gemedieerde
INLEIDING
4
transcytose op [3-4]. Bij receptor-gemedieerde transcytose zorgt de binding van een
macromoleculair ligand op een specifieke receptor op de luminale zijde van het cerebraal
capillair endotheel voor endocytose van het macromolecule, gevolgd door exocytose aan de
abluminale zijde van het endotheel. Bij absorptie-gemedieerde transcytose zal de interactie
van een sterk positief geladen macromolecule met negatief geladen bindingsplaatsen op het
celoppervlak leiden tot transcytose van het macromolecule [6] (Figuur 1).
De aanwezigheid van intracellulaire en extracellulaire enzymen ter hoogte van het cerebraal
capillair endotheel zorgt ervoor dat de BHB ook een metabole barrière is, met als
voornaamste rol de protectie en detoxificatie van het centrale zenuwstelsel. Zo zullen ectoenzymen zoals peptidasen en nucleotidasen respectievelijk zorgen voor de metabolisatie van
peptiden en ATP, terwijl de intracellulaire enzymen, zoals onder andere monoamino-oxidase
en cytochroom P450, de inactivatie van een groot aantal neuroactieve en toxische substanties
voor hun rekening nemen [3-4].
Figuur 1: Mogelijke transportroutes doorheen de BHB. Schematische weergave van de BHB endotheelcellen
en de astrocytaire perivasculaire eindvoetjes. Moleculair transport doorheen de BHB kan op verschillende
manieren verlopen. a) In normale omstandigheden, zorgen de tight juncties voor een sterke reductie van de
paracellulaire diffusie van hydrofiele moleculen. b) Het transport van lipofiele moleculen gebeurt voornamelijk
aan de hand van transcellulaire diffusie. c) Het endotheel bevat een groot aantal transporteiwitten, voor onder
andere glucose, aminozuren en nucleosiden. d) Bepaalde eiwitten, zoals insuline en transferrine, worden
opgenomen door middel van receptor-gemedieerde transcytose. e) Een aantal positief geladen plasma-eiwitten,
waaronder albumine, worden opgenomen door middel van absorptie-gemedieerde transcytose [4].
INLEIDING
5
1.1.2 Tight juncties
Ter hoogte van de BHB is er slechts een minimale paracellulaire diffusie van hydrofiele
moleculen doorheen de intercellulaire ruimten, door de aanwezigheid van tight juncties. Deze
structuren komen ook voor in endotheel in de periferie, maar ter hoogte van het cerebraal
endotheel zijn ze meer complex en sluiten ze de intercellulaire ruimte beter af [4]. Tight
juncties zijn dynamische complexen, gevormd door de interactie van ankereiwitten en
integrale membraaneiwitten. De integrale membraaneiwitten die deel uitmaken van de tight
junctie-complexen zijn occludine, claudines, junctionele adhesiemoleculen (JAM) en
endotheelcel-selectieve adhesiemoleculen (ESAM). Bij de ankereiwitten kan een onderscheid
gemaakt worden tussen eiwitten die direct interageren met de integrale membraaneiwitten,
zoals zonula occludens eiwitten ZO-1, ZO-2 en ZO-3, en eiwitten die op een indirecte wijze
interageren met de integrale membraaneiwitten, zoals cinguline, paracinguline en het
‘junction-associated coiled-coil protein’ (JACOP) [9,10]. Occludine heeft een moleculaire
massa van 65kDa en kent een hoge expressie in het endotheel van het centrale zenuwstelsel.
De cytoplasmatische C-terminus van occludine bindt aan het guanylyl kinase (GK) domein
van ZO-1 en ZO-2, waardoor het indirect verbonden is met het cytoskelet. Door de
aanwezigheid van meerdere serine/threonine fosforylatieplaatsen, het feit dat occludine niet
geëxpresseerd wordt in foetussen en pasgeborenen, en de ontdekking dat occludine-deficiënte
muizen normale tight juncties ontwikkelen, lijkt occludine eerder een rol te spelen in de
regulatie van de tight juncties, dan in de assemblage ervan [9,11-14]. Van een ander integraal
membraaneiwit, claudine, zijn er meer dan 20 isovormen bekend, met een moleculaire massa
variërend van 20 tot 27kDa. De extracellulaire lussen van dit eiwit maken het mogelijk om
claudines op aangrenzende endotheelcellen te binden en de intracellulaire C-terminus bindt
het PDZ-1 (post synaptic density protein 95 (PSD-95), discs large homolog 1 (DLG1), and
ZO-1 protein) domein van ZO eiwitten. De cerebrale endotheelcellen expresseren claudine-1,
-2, -3, -5, -11 en -12, en de aanwezigheid van deze verschillende isovormen maakt modulatie
van de BHB permeabiliteit mogelijk. De voornaamste functie van claudine is namelijk de
assemblage van tight juncties, en de daarmee gepaard gaande restrictie van de permeabiliteit
[2,9]. De integrale JAM eiwitten, JAM-A, -B en -C, hebben een moleculaire massa van
40kDa en hebben een immunoglobuline-achtige structuur. Deze eiwitten zouden betrokken
zijn bij de regulatie van leukocyt-endotheelcel interactie tijdens inflammatie enerzijds en bij
cel-cel adhesie van naast elkaar gelegen endotheelcellen anderzijds [2,9,15]. De effectiviteit
van de tight juncties wordt gereguleerd door de cytoplasmatische ZO eiwitten, die de integrale
membraaneiwitten via cinguline verbinden met het cytoskelet [6]. ZO-1 is de belangrijkste
INLEIDING
6
isovorm, en is opgebouwd uit een GK domein, drie PDZ domeinen en een SH3 (SRC
Homology 3) domein. Het GK domein staat in verbinding met occludine en katalyseert de
ATP-afhankelijke omzetting van GMP naar GDP, het PDZ-1 domein is verbonden met
claudine-5 en de PDZ-2 en -3 domeinen interageren met de JAM eiwitten. De intracellulaire
C-terminus van ZO-1 is verbonden met de actinefilamenten van het cytoskelet, waardoor het
eiwit een belangrijke rol speelt in de functie en stabiliteit van het tight junctie-complex.
Verder zou ZO-1 ook dienst kunnen doen als signaalmolecule, in de regulatie van stevigheid
van de tight juncties. De ZO-2 isovorm speelt ook een rol in tight juncties, en kan de functie
van ZO-1 overnemen in ZO-1 deficiënte cellen, dankzij de hoge sequentiehomologie tussen
beide eiwitten. De ZO-3 isovorm wordt niet geëxpresseerd ter hoogte van de BHB [2,9,16]
(Figuur 2).
Figuur 2: Moleculaire structuur van tight juncties van de BHB. Tight juncties worden gevormd door de
interactie van integrale membraaneiwitten en ankereiwitten. De voornaamste integrale membraaneiwitten die
deel uitmaken van de tight juncties zijn occludine, claudines en junctionele adhesiemoleculen (JAM). De
extracellulaire lussen van deze eiwitten interageren met de extracellulaire lussen van integrale membraaneiwitten
van naburige endotheelcellen, en overspannen zo de intercellulaire ruimte. De intracellulaire lussen van de
integrale membraaneiwitten interageren met de cytoplasmatische ZO eiwitten, die deze op directe of indirecte
(via cinguline) wijze verankeren aan de actinefilamenten van het cytoskelet [2].
INLEIDING
7
Buiten de tight juncties komt er nog een ander junctioneel complex voor tussen de cerebrale
capillaire BHB endotheelcellen, namelijk adherente juncties. De belangrijkste component van
deze complexen is het vasculair endotheliaal (VE)-cadherine, een Ca2+-gereguleerd eiwit dat
cel-cel adhesie medieert door interactie van zijn extracellulair domein met het extracellulair
domein van een VE-cadherine geëxpresseerd op een aangrenzende endotheelcel. Door middel
van zijn cytoplasmatische staart bindt VE-cadherine aan β-catenine en plakoglobine, die via
α-catenine, α-actinine en vinculine verbonden zijn met het cytoskelet. Adherente juncties
zorgen voor de structurele ondersteuning van het weefsel, en zijn essentieel voor de vorming
van tight juncties, aangezien VE-cadherine zorgt voor de opregulatie van het gen coderend
voor het tight junctionele eiwit claudine-5 [2,6,10,17].
De tight juncties hebben niet enkel een ‘gate functie’ die zorgt voor de restrictie van de
paracellulaire permeabiliteit, ze hebben ook een ‘fence functie’, aangezien ze zorgen voor de
segregatie van de apicale en basale domeinen van de celmembraan, waardoor het endotheel
dus een bepaalde polariteit kan aannemen. Het PAR3-atypisch proteïne kinase C (aPKC)PAR6 complex blijkt een rol te spelen in de regulatie van de tight junctie vorming en in het
bewerkstelligen van deze polariteit [4]. Een aantal lokaal geproduceerde en circulerende
factoren zijn in staat om de eigenschappen van de tight juncties, en daardoor dus ook de
paracellulaire permeabiliteit, op korte termijn te moduleren. Een groot aantal celtypes die
geassocieerd zijn met cerebraal capillair endotheel, zoals astrocyten, microglia en neuronen,
zijn in staat om deze modulerende agentia te secreteren [4,6].
De verschillende structurele en functionele eigenschappen van de BHB, zorgen ervoor dat het
zowel een statische als een dynamische barrière vormt. Enerzijds dient de BHB een stabiele
structuur te zijn, om homeostase van het centrale zenuwstelsel te garanderen, en anderzijds
moet de BHB ook een bepaalde plasticiteit hebben, om een snelle adaptatie aan veranderende
condities mogelijk te maken [3,14].
1.2 De neurovasculaire eenheid: inductie en modulatie van de bloed-hersenbarrière
Het cerebraal capillair endotheel bouwt samen met neuronen, astrocyten, pericyten, microglia
en de extracellulaire matrix de neurovasculaire eenheid (NVE) op [2]. De interactie van
neuronen met niet-neuronale cellen is verantwoordelijk voor de vorming van de BHB, die
instaat voor de regulatie van de micro-omgeving van de neuronen, en dus een invloed heeft op
signaaltransductie, remodellering, angiogenese en neurogenese [18]. Complexe cel-cel
interacties tussen het endotheel van de BHB en de verschillende andere componenten van de
INLEIDING
8
NVE zorgen enerzijds voor de inductie en het behoud van de BHB, en anderzijds voor de
modulatie van bepaalde eigenschappen van de BHB, zoals de paracellulaire permeabiliteit en
de expressie en activiteit van bepaalde transporters en enzymen, zowel in fysiologische als in
pathologische omstandigheden [3-4,6].
1.2.1 Cel-cel interacties ter hoogte van de bloed-hersenbarrière
De inductie en modulatie van de BHB komt tot stand door de cel-cel interacties tussen het
cerebraal capillair endotheel en de omgevende celtypes van de NVE. Elke component van dit
complex van cel-cel interacties speelt een essentiële rol in de structuur en functie van de BHB.
De pericyten vormen de nauwste interactie met het endotheel van de BHB, en spelen onder
andere een rol in de vorming van de endotheliale tight juncties. Het endotheel en de pericyten
worden omgeven door de basale membraan, die continu is met de plasmamembraan van de
astrocytaire eindvoetjes. Deze astrocytaire uitlopers staan in nauw contact met het cerebraal
capillair endotheel, en zijn onder andere in staat om de BHB permeabiliteit te moduleren.
Dankzij de nauwe interactie van de pericyten en perivasculaire astrocytaire eindvoetjes met
het endotheel van de BHB, kunnen deze structuren in fysiologische omstandigheden bijdragen
tot de barrièrefunctie van de BHB en kunnen ze dienen als tweedelijns verdediging bij BHB
disruptie. Andere celtypes in de perivasculaire ruimte die ook interageren met het endotheel
van de BHB zijn onder andere de neuronen en microglia [2,4,6,13] (Figuur 3).
Figuur 3: Cel-cel interacties ter hoogte van de BHB. Het cerebraal capillair endotheel van de BHB wordt
beïnvloed door verschillende agentia, afkomstig uit het bloed of van de omgevende celtypes van de NVE,
waaronder pericyten, astrocyten, neuronen en microglia. Via interactie met hun overeenkomstige receptor, staan
deze agentia in voor de inductie of modulatie van de eigenschappen van het BHB endotheel. De activatie van
bepaalde receptoren is gekoppeld aan een stijging van de intracellulaire Ca 2+-concentratie, en kan op zijn beurt
leiden tot de vrijstelling van inducerende of modulerende agentia door het endotheel [4].
INLEIDING
9
1.2.2 Inductie van de bloed-hersenbarrière eigenschappen
De mogelijkheid van het cerebraal capillair endotheel om de BHB te vormen is geen
intrinsieke eigenschap van dit endotheel, maar wordt geïnduceerd door de interacties die de
endotheelcellen aangaan met omgevende celtypes [13]. Vanwege de dichte appositie van de
astrocytaire eindvoetjes tegen het endotheel van de BHB wordt vermoed dat de astrocyten een
inducerende invloed zouden kunnen hebben op het endotheel, en dat ze zouden kunnen
zorgen voor de ontwikkeling van het gespecialiseerde BHB fenotype [3-4]. Ondertussen is uit
talrijke studies gebleken dat astrocyten inderdaad een groot aantal van de BHB eigenschappen
kunnen opreguleren. Zo zal de interactie van het cerebraal capillair endotheel met de
astrocytaire eindvoetjes leiden tot nauwere tight juncties (fysische barrière), de expressie en
gepolariseerde lokalisatie van specifieke transporters, waaronder GLUT-1, P-glycoproteïne en
verschillende aminozuurtransporters (transportbarrière), en gespecialiseerde enzymsystemen
(metabole barrière) [4]. De inductie van deze BHB eigenschappen vereist een correcte
apicale-basale polariteit tussen het endotheel en de astrocytaire eindvoetjes, en zou bekomen
kunnen worden door middel van paracriene signalisatie via de extracellulaire matrix,
afkomstig van astrocyten en inwerkend op de abluminale endotheliale membraan [3].
Karakteristiek voor de perivasculaire eindvoetjes van astrocyten is dat ze een groot aantal
‘orthogonal arrays of particles’ (OAPs) hebben. Deze structuren bevatten aquaporine 4
(AQP4) waterkanalen en Kir4.1 K+-kanalen, via welke ze de ionen- en volumeregulatie ter
hoogte van de BHB reguleren. De polariteit van deze structuren correleert met de expressie
van agrine op de basale membraan, waardoor deze dus een belangrijke rol blijkt te spelen in
de inductieve signalisatie tussen de astrocyten en het cerebraal capillair endotheel [4,14].
Astrocyten zorgen ook voor de inductie van een aantal specifieke eigenschappen van het BHB
fenotype, door de secretie van een aantal inductiefactoren, zoals ‘transforming growth factorβ’ (TGFβ), ‘glial-derived neurotrophic factor’ (GDNF), ‘basic fibroblast growth factor’
(bFGF) en ‘angiopoetin 1’ (ANG1). Het endotheel heeft echter ook een inducerende invloed
op de perivasculaire astrocyten. Zo zal bijvoorbeeld de ‘leukaemia inhibitory factor’ (LIF),
afkomstig van het endotheel, zorgen voor de inductie van astrocytaire differentiatie. De
inductieve signalisatie tussen het endotheel van de BHB en de perivasculaire astrocyten is dus
bidirectioneel van aard. De inductie en het behoud van het BHB fenotype vereist continue
uitwisseling van inductieve signalen tussen de astrocyten en het endotheel, en verstoring van
deze signalisatie zou kunnen leiden tot verschillende neuropathologieën die gepaard gaan met
dysfunctie van de BHB, zoals bepaalde hersentumoren en multiple sclerose [3-4].
INLEIDING
10
Astrocyten zijn niet het enige celtype met inductieve invloeden op het endotheel van de BHB.
Ook de andere celtypes van de NVE dragen bij tot het bekomen en het behoud van de mature
BHB. Zo zal bijvoorbeeld angiopoiëtine, afkomstig van pericyten, de endotheliale expressie
van occludine induceren, en kunnen bepaalde matrixeiwitten van de basale membraan de
expressie van endotheliale tight junctionele eiwitten beïnvloeden [19-20]. De BHB ontwikkelt
zich tijdens de foetale periode, en is reeds goed gevormd bij de geboorte. Aangezien de
vorming van de tight juncties reeds zeer vroeg van start gaat, namelijk tijdens de cerebrale
angiogenese, en de gliogenese pas later optreedt, zal de ontwikkeling van de BHB in eerste
instantie voornamelijk geïnduceerd worden door signalen afkomstig van neuronen, pericyten
en progenitorcellen, eerder dan van astrocyten [21,22]. Het behoud van de eigenschappen van
de mature BHB daarentegen wordt wel in belangrijke mate geregeld door inductieve signalen
afkomstig van astrocyten [3].
1.2.3 Modulatie van de bloed-hersenbarrière eigenschappen
Ondanks het feit dat de term barrière de indruk geeft dat het om een statisch systeem gaat,
kunnen een groot aantal eigenschappen van het BHB fenotype gemoduleerd worden [4,23].
Het past zich aan naargelang lokale veranderingen en behoeftes, en kan gereguleerd worden
door een groot aantal mechanismen en celtypes, zowel in fysiologische als in pathologische
omstandigheden. De expressie en activiteit van de tight juncties, de transportsystemen en de
enzymen zullen dus in bepaalde omstandigheden gemoduleerd worden, opdat de BHB zijn
verschillende functies optimaal zou kunnen vervullen en de hersenen steeds optimaal zouden
kunnen functioneren [6]. Zo zal de paracellulaire BHB permeabiliteit bijvoorbeeld stijgen in
inflammatoire omstandigheden, en zal bij uithongering en hypoxie de expressie van GLUT-1
worden opgereguleerd [4]. In tegenstelling tot inductie van het BHB fenotype, dat een lange
termijn proces is, gebaseerd op regulatie van genexpressie en eiwitsynthese, is modulatie van
de BHB eigenschappen eerder een korte termijn proces (seconden/minuten), gebaseerd op
receptor-gemedieerde signalisatie [3-4]. Een groot aantal chemische agentia, circulerend in
het bloed of gesecreteerd door verschillende cellen van de NVE, zijn in staat om de
permeabiliteit van de BHB te moduleren. Bepaalde agentia zullen zorgen voor een verhoogde
BHB permeabiliteit en een verstoring van de transport- en metabole functies, terwijl een
aantal andere agentia de permeabiliteit zullen verlagen en zullen zorgen voor het beter
functioneren van de BHB [4,24] (Tabel 1). Modulerende agentia die de BHB permeabiliteit
verhogen doen dit door middel van transiënte opening van de paracellulaire pathway, door in
te spelen op de tight juncties en het geassocieerde cytoskelet [3]. De eiwitten die de tight
INLEIDING
11
juncties opbouwen zijn namelijk onderhevig aan veranderingen in expressie, subcellulaire
lokalisatie, post-translationele modificatie en eiwit-eiwitinteracties [2,25]. De regulatie van
deze veranderingen gebeurt aan de hand van een aantal signaaltransductiecascaden in de
cerebrale capillaire endotheelcellen, die, via modulerende agentia, geactiveerd worden door
receptor-gemedieerde processen [3]. De intracellulaire signaalpathways die de organisatie en
functie van de tight juncties ter hoogte van de BHB reguleren zijn voornamelijk gebaseerd op
Ca2+, fosforylatie en G-eiwitten, en verschillende chemische agentia kunnen meerdere
pathways tegelijk activeren [2]. Zowel extracellulaire Ca2+-depletie als een abnormaal hoge of
lage intracellulaire Ca2+-concentratie kunnen aanleiding geven tot BHB disruptie. Eerder
onderzoek suggereert dat de verhoogde paracellulaire permeabiliteit ten gevolge van een lage
extracellulaire Ca2+-concentratie veroorzaakt wordt door een gedaalde ZO-1, ZO-2 en
occludine expressie ter hoogte van de endotheliale celmembraan, en dat proteïne kinase C
(PKC) een rol speelt in deze Ca2+-afhankelijke regulatie van de organisatie van tight juncties.
BHB disruptie ten gevolge van een abnormaal hoge of lage intracellulaire Ca2+-concentratie
gebeurt aan de hand van een gedaalde expressie en/of verstoorde eiwit-eiwit interacties van de
tight junctionele eiwitten. Naast Ca2+-influx, speelt ook de vrijstelling van Ca2+ uit
intracellulaire Ca2+-opslagplaatsen een belangrijke rol, en zal de resulterende stijging van de
intracellulaire Ca2+-concentratie een aantal kinase-gemedieerde signaalcascades activeren,
leidend tot de activatie van een aantal transcriptiefactoren die de expressie van tight
junctieproteïnes reguleren, waaronder nucleaire factor-κB (NF-κB), cAMP respons elementbindend proteïne (CREB) en c-Fos [2,26]. Een ander belangrijk regulatoir mechanisme van
zowel de integrale als de ankereiwitten van de tight juncties is fosforylatie. Zo wordt de
subcellulaire lokalisatie van occludine bijvoorbeeld gereguleerd door middel van serine
fosforylatie, en zijn serine en threonine fosforylatie van occludine sterk gecorreleerd met de
heropbouw van de tight juncties na BHB disruptie. Aangezien de tight junctionele eiwitten, en
in het bijzonder occludine en ZO-1, meerdere fosforylatieplaatsen hebben, bestaat er
waarschijnlijk een complexe relatie tussen de serine, tyrosine en threonine fosforylatie
enerzijds en de structurele en functionele effecten van het fosforylatiepatroon anderzijds [2].
Ook G-eiwitten zijn betrokken bij de modulatie van tight juncties. Zo zullen heterotrimere Geiwitten ter hoogte van het cerebraal capillair endotheel de migratie van T-lymfocyten naar
het hersenweefsel mediëren, zullen Rho-GTPasen, geactiveerd door G-proteïnegekoppelde
receptoren voor lysophosphatidic acid (LPA) en prostaglandine E2, de paracellulaire
permeabiliteit beïnvloeden via interacties met het actine cytoskelet, en is de activatie van Ras
geassocieerd met een disruptie van de endotheliale cel-cel interacties, een verlies van ZO-1 ter
INLEIDING
12
hoogte van het junctionele complex en bijgevolg een verhoogde paracellulaire permeabiliteit
[2,27]. Doordat de opening van de paracellulaire pathway transiënt is, niet gepaard gaat met
celdood en een sterk gereguleerd proces is, kan ze ook optreden onder normale fysiologische
omstandigheden, als respons op lokaal vrijgestelde agentia. In bepaalde situaties kan een korte
reversibele opening van de BHB zelfs een fysiologisch voordeel opleveren, aangezien het
bloedplasma een aantal stoffen bevat die noodzakelijk zijn in de normale herstelprocessen van
de hersenen, zoals groeifactoren die leiden tot neurietengroei in regio’s van neuronale schade
en celdood. Verder zouden de neuronen ook gebruik kunnen maken van de transiënte opening
van de BHB om de samenstelling van het bloedplasma te samplen, opdat de hersenen de
regulatoire controle van het lichaam beter zouden kunnen uitvoeren. Het zou ook kunnen dat
er onder normale fysiologische omstandigheden een cyclisch openen en sluiten optreedt van
de BHB in een klein percentage van de hersencapillairen. Deze cyclische activiteit zou slechts
een verwaarloosbaar effect hebben op de algemene homeostase van het centrale zenuwstelsel,
maar zou er wel voor kunnen zorgen dat er aan de lokale noden, die tot de BHB opening
hebben geleid, voldaan kan worden [3]. Ook het transport van onder andere glucose en
aminozuren doorheen het endotheel van de BHB wordt beïnvloed door een aantal regulatoire
mechanismen, waaronder mogelijks een vorm van neurobarrière koppeling, waarbij de
astrocyten het glucosetransport doorheen de BHB zullen moduleren, onder invloed van
neuronale activiteit [4,28-29].
Tabel 1: Agentia die de BHB permeabiliteit en functie kunnen moduleren. [3-4]
Agentia die zorgen voor verhoogde BHB permeabiliteit en verstoorde BHB functie:
- Bradykinine, histamine, serotonine, glutamaat
- Purine nucleotiden: ATP, ADP, AMP
- Endotheline-1 (ET-1)
- Substantie P
- Adenosine, Platelet activating factor (PAF)
- Phospholipase A2, arachidonzuur, prostaglandines, leukotriënen
- Interleukines: IL-1α, IL-1β, IL-6
- Tumor necrosis factor-α (TNFα), macrophage-inhibitory proteins MIP1 en MIP2
- Complement-derived polypeptide C3a-desArg
- Vrije radicalen, stikstofoxide (NO)
Agentia die zorgen voor verlaagde BHB permeabiliteit en verbeterde BHB functie:
- Steroïden, verhoogd intracellulair cyclisch AMP, adrenomeduline en noradrenerge agentia
Alle cellen van de NVE zullen in bepaalde mate bijdragen tot de modulatie van de BHB. Ook
het endotheel zelf is in staat modulerende agentia vrij te stellen, die dan vervolgens op
endotheliale receptoren zullen binden. Een voorbeeld van deze endotheliale autocriene
signalisatie is de vrijstelling van endotheline-1 (ET-1) en ATP, die respectievelijk zullen
INLEIDING
13
inwerken op de ETA- en de nucleotidereceptoren. [3,13]. In pathologische omstandigheden
kunnen mastcellen en perivasculaire microglia inflammatoire agentia, die op het cerebraal
capillair endotheel inwerken, vrijstellen [3]. Ook de basale membraan is betrokken bij de
verhoogde BHB permeabiliteit in pathologische condities, door disruptie van de interactie van
laminine en andere matrixeiwitten met de endotheliale integrinereceptoren [2]. Naast de reeds
aangehaalde neurobarrière koppeling, bestaan er nog andere communicatievormen tussen de
neuronen, de perivasculaire astrocyten en het cerebraal capillair endotheel, om aan de
metabole noden van de lokale neuronale activiteit tegemoet te kunnen komen, zoals metabole
en neurovasculaire koppeling [2,29]. Astrocyten spelen, net als bij de inductie en het behoud
van de BHB, ook een belangrijke rol in de modulatie van de BHB eigenschappen. Aan de
hand van een groot aantal modulerende agentia hebben ze een invloed op de paracellulaire
permeabiliteit, de expressie en polarisatie van de transportsystemen, en de activiteit van de
enzymen die de metabole barrière opbouwen [3,19]. Verder kunnen astrocyten het effect van
bepaalde modulerende agentia versterken, zodat, wanneer deze agentia in een te lage
concentratie voorkomen om de BHB te openen, ze eventueel toch zullen leiden tot BHB
disruptie [3].
1.3 Endothelio-gliale interacties in inflammatoire omstandigheden
Bepaalde pathologieën, waaronder multiple sclerose, de ziekte van Alzheimer, epilepsie en
verschillende hersentumoren, zullen gepaard gaan met een verstoord functioneren van de
BHB, meestal onder invloed van modulerende, endothelio-gliale communicatie [4]. Een ander
kenmerk dat deze neurale aandoeningen vaak gemeenschappelijk hebben is dat het ontstaan
en/of verloop ervan gepaard gaat met inflammatie [30-33]. Onderzoek naar de onderlinge
interacties tussen astrocyten en het endotheel van de BHB, in inflammatoire omstandigheden,
kunnen dus een dieper inzicht genereren in de biologische basis van deze neuropathieën, en
zou bovendien kunnen leiden tot het ontstaan van een aantal nieuwe effectieve therapeutische
strategieën.
1.3.1 Neuroinflammatie
In normale omstandigheden, zorgt het gespecialiseerd endotheel van de BHB voor een
scheiding tussen de hersenen en de circulerende cellen van het immuunsysteem, waardoor er
slechts een gelimiteerde toegang is voor mononucleaire cellen tot het hersenweefsel. De lage
expressie van major histocompatibility complex antigenen, het beperkt aantal antigeenpresenterende cellen in het gezonde centrale zenuwstelsel en het feit dat het niet echt
gedraineerd wordt door het lymfatisch systeem, maken van de hersenen een immunologisch
INLEIDING
14
gepriviligeerd orgaan [1]. Een groot aantal neuropathieën zal echter, door het optreden van
BHB disruptie, gepaard gaan met een toegenomen migratie van leukocyten naar de hersenen.
In het hersenweefsel, zullen de gemigreerde leukocyten de BHB dan nog verder verstoren,
door een aantal signaaltransductiecascaden, die leiden tot een gedaalde expressie van
bepaalde tight junctionele eiwitten, waaronder occludine en ZO-1, in gang te zetten [13].
Astrocyten en microglia spelen een belangrijke rol in zowel de verdediging tegen, als de
pathogenese van een groot aantal aandoeningen die gepaard gaan met neuroinflammatie. In
pathologische omstandigheden zullen deze cellen, onder invloed van het immuunsysteem, dan
ook zorgen voor een amplificatie van de reeds bestaande inflammatie, en disruptie van de
BHB, onder andere door de productie van neurotoxines en neurotrofines [13,34]. De
inflammatoire mediatoren die zorgen voor de initiële stijging van de BHB permeabiliteit en de
toegenomen migratie van leukocyten naar de hersenen, kunnen afkomstig zijn uit het
hersenweefsel zelf, maar ze kunnen eventueel ook vanuit perifere inflammatiehaarden naar
het cerebraal capillair endotheel gecirculeerd zijn. Bepaalde inflammatoire mediatoren die
zorgen voor een verhoogde capillaire permeabiliteit in de periferie, zoals histamine en
bradykinine, hebben namelijk ook effecten op de tight junctionele eiwitten van de BHB, al
zijn er in de hersenen over het algemeen hogere concentraties nodig, en zijn de effecten meer
gelokaliseerd en van kortere duur [4,24].
1.3.2 Onderzoekshypothese/ Doel van het onderzoek
Er zijn verschillende manieren waarop het cerebraal capillair endotheel en de perivasculaire
astrocyten met elkaar zouden kunnen communiceren in inflammatoire omstandigheden. De
inflammatoire mediatoren, afkomstig uit het bloed of het geïnflammeerde hersenweefsel,
zullen het endotheel en/of de astrocyten activeren, door op hun overeenkomstige receptoren
op de plasmamembraan te binden [24]. Dit zal gepaard gaan met de activatie van bepaalde
intracellulaire signaalcascades, die gebaseerd kunnen zijn op onder andere Ca2+-signalisatie,
en fosforylatie. Ter hoogte van de endotheelcellen zal dit leiden tot een wijziging van de
eigenschappen van de BHB, waaronder een stijging van de paracellulaire permeabiliteit, door
veranderingen ter hoogte van de tight juncties [2]. Geactiveerde astrocyten kunnen naburige
astrocyten activeren, aan de hand van Ca2+-signalisatie. Een stijging van de astrocytaire
intracellulaire Ca2+-concentratie leidt namelijk tot de diffusie van inositol-1,4,5-trifosfaat
(IP3), doorheen gap juncties, naar naburige astrocyten, en zou zo het Ca2+-signaal kunnen
verspreiden en de activiteit van de andere astrocyten kunnen moduleren [4,35-36]. In vitro
onderzoek heeft aangetoond dat ook endotheelcellen met elkaar kunnen communiceren via
INLEIDING
15
intercellulaire gap juncties, waardoor geactiveerde cerebrale capillaire endotheelcellen
naburige endotheelcellen dus ook zouden kunnen beïnvloeden door middel van Ca2+signalisatie [4]. Verder zal de activatie van zowel endotheelcellen als astrocyten leiden tot de
lokale vrijstelling van een aantal modulerende agentia. Vanwege de nauwe anatomische
relatie tussen de perivasculaire astrocytaire eindvoetjes en het cerebraal capillair endotheel, en
aangezien het endotheel van de BHB receptoren bevat voor een groot aantal astrocytgesecreteerde agentia, zou paracriene transmissie van deze modulatoren een belangrijke vorm
van endothelio-gliale communicatie kunnen zijn tijdens neuroinflammatie [3-4]. Bovendien
zou de paracriene signalisatie van ATP, net als gap juncties, kunnen bijdragen tot de
interendotheliale en interastrocytaire Ca2+-signalisatie, aangezien deze molecule zowel door
het cerebraal capillair endotheel als door de perivasculaire astrocyten wordt vrijgesteld, en
beide celtypes eveneens purinerge ATP receptoren bevatten [4,37].
Om te onderzoeken hoe de inflammatoire, endothelio-gliale signalisatie ter hoogte van de
BHB precies verloopt, worden er enerzijds een aantal in vivo experimenten uitgevoerd,
waarbij de muis als diermodel wordt gebruikt, en worden er anderzijds een aantal in vitro
experimenten verricht, waarbij voornamelijk gebruik wordt gemaakt van geïmmortaliseerde
cerebrale endotheelcellen van muizen.
Om de cerebrale endotheelcellen te activeren, dienen ze in contact te komen met een
inflammatoire trigger. Deze moet voldoende sterk zijn, zodat de disruptie van de BHB
voldoende lang aangehouden blijft. Een aantal mogelijke kandidaten zijn onder andere
bradykinine en de pro-inflammatoire cytokines interleukine-1 beta (IL-1β), interferon gamma
(IFNγ) en tumornecrosefactor-alfa (TNFα) [23,38]. Deze inflammatoire mediatoren worden
echter ook door verschillende celtypes in het lichaam geproduceerd, zoals onder andere door
geactiveerde leukocyten, microglia en astrocyten, wat de interpretatie van de resultaten zou
bemoeilijken, wanneer deze moleculen als inflammatoire trigger zouden worden gebruikt
[4,24]. Lipopolysaccharide (LPS) echter, is een lichaamsvreemd endotoxine, dat ook een
sterke immuunrespons veroorzaakt [39]. Het bindt op Toll-like receptor 4 (TLR4), dat onder
andere geëxpresseerd wordt door het endotheel van de BHB [40]. Deze molecule zal dan ook
in de in vivo en in vitro experimenten gebruikt worden om de cerebrale endotheelcellen te
activeren, en disruptie van de BHB te induceren.
INLEIDING
16
2. MATERIALEN EN METHODEN
2.1 In vivo experimenten
Voor het in vivo onderzoek wordt er gebruik gemaakt van mannelijke FVB muizen, aangezien
de menstruele cyclus bij vrouwelijke exemplaren een invloed heeft op de connexine 43 (Cx43)
expressie in de hersenen [41]. Het gewicht van de muizen varieert tussen de 25 en de 30 gram,
en ze worden onder gecontroleerde omstandigheden gehuisvest, met ad libitum toegang tot
voedsel en water.
2.1.1 Nagaan van de mate van BHB disruptie
2.1.1.1 Inductie van systemische inflammatie
Om de mate van BHB disruptie doorheen de tijd te kunnen onderzoeken, worden de muizen
op verschillende tijdstippen na LPS (25mg/kg; Sigma-Aldrich) injectie geëuthanaseerd. De
gekozen tijdstippen zijn 3, 6 en 24 uur na de injectie. LPS wordt opgelost in 200µl 0,9% NaCl
(Braun), en wordt intraperitoneaal (IP) geïnjecteerd door middel van een 0,3ml insulinespuitje.
Ter controle, wordt ook steeds een sham-behandeling uitgevoerd, waarbij er 0,9% NaCl wordt
geïnjecteerd in plaats van LPS, en de muis 24h nadien geëuthanaseerd wordt.
Alternatief wordt systemische inflammatie geïnduceerd door een mix van pro-inflammatoire
cytokines waarvan de serumconcentratie gestegen is bij LPS-behandelde muizen (muis
recombinant IL-1β, IFNγ en TNFα; 40µg/kg elk; Invitrogen). De cytokines worden opgelost
in 200µl 0,9% NaCl, en de injectie gebeurt intraveneus (IV; in de staartvene).
2.1.1.2 Injectie van fluorescent-gelabelde probes
Na injectie van de inflammatoire stimulus, wordt er 3, 6 of 24 uur gewacht vooraleer de
fluorescent-gelabelde probes te injecteren. Ongeveer een halfuur voordien worden de muizen
verdoofd door middel van IP injectie van een ketamine/xylazine oplossing. Deze mix bestaat
voor 20% uit Ketamine 1000 (100 mg/ml ketamine; Ceva), voor 5% uit Rompun (2%
xylazine; Bayer) en voor 75% uit 0,9% NaCl. De injectie gebeurt door middel van een 0,3ml
insulinespuitje. De graad van anesthesie wordt aangeduid door een totale afwezigheid van de
staart- en teenknijpreflex.
Om de mate van BHB disruptie te kunnen onderzoeken, wordt er gebruik gemaakt van
fluorescent-gelabelde probes van verschillende moleculaire gewichten, namelijk 3kDa
dextraanfluoresceïne (30mg/kg; Molecular Probes®, Invitrogen), 10kDa dextraan-Texas Red
(100mg/kg; Molecular Probes®, Invitrogen) en 70kDa FITC-albumine (660mg/kg; SigmaMATERIALEN EN METHODEN
17
Aldrich). Rekening houdende met het bloedvolume van de muis (8% van het lichaamsgewicht)
komt dit voor alle kleurstoffen neer op een concentratie van 200µM in het bloed. De
fluorescente kleurstoffen worden opgelost in 200µl HBSS-Hepes (Tabel 2, zie addendum), en
door middel van een 0,3ml insulinespuitje in de staartvene van de muizen geïnjecteerd.
2.1.1.3 Transcardiale perfusie
Een kwartier na de injectie van de fluorescent-gelabelde probes wordt er een pectorale incisie
gemaakt om het sternum zichtbaar te maken. Vervolgens worden de huid, spieren en ribben
van de linker en rechter thoraxholte doorgesneden door een incisie te maken vanaf het
sternum naar de linker en rechter axilla, waardoor het hart toegankelijk wordt voor verdere
ingrepen. Om stolling van het bloed en dus de vorming van bloedklonters te voorkomen,
wordt er, net voor de transcardiale perfusie, 0,01ml heparine (50 units; Sigma-Aldrich) in de
apex van het hart geïnjecteerd. Vervolgens wordt er een incisie gemaakt in het rechter atrium
en wordt de transcardiale perfusie met 20ml ‘phosphate buffered saline’ (PBS; Tabel 3, zie
addendum) via de apex van het hart, gestart. Dit wordt gedaan om het bloed, met de
circulerende fluorescent-gelabelde probes, uit de bloedvaten te verwijderen. Onmiddellijk na
de transcardiale perfusie worden de muizen gedecapiteerd en de hersenen geïsoleerd. Hiertoe
wordt de huid van de schedel verwijderd, worden er twee knipjes gegeven zijdelings van het
cerebellum naar voren toe, wordt de schedel opengeklapt en worden de hersenen door middel
van een spatel geïsoleerd.
2.1.1.4 Meten van de fluorescentie-intensiteit
Aangezien de mate waarin de fluorescent-gelabelde probes in het hersenweefsel voorkomen
bepaald wordt door de permeabiliteit van de BHB, zal het meten van de fluorescentie een
beeld geven van de mate van BHB disruptie, geïnduceerd door de inflammatoire stimulus.
Een eerste manier om dit te doen is door het hersenweefsel overnacht in formamide (12ml/g
hersenweefsel; Sigma-Aldrich) te laten incuberen. Formamide onttrekt water en fluorescentie
uit het weefsel, waarna de fluorescentie-intensiteit in de oplossing gemeten kan worden met
behulp van een plaatlezer (Victor3 1420 Multilabel Counter, PerkinElmer) [42]. De incubatie
gebeurt al schuddend, bij een temperatuur van 37ºC. Vooraleer de fluorescentie-intensiteit van
de stalen gemeten wordt, worden ze gedurende 15 minuten gecentrifugeerd (15.000g). Voor
elke conditie wordt de fluorescentie van verschillende fluorescent-gelabelde probes in 200µl
van het supernatant gemeten.
MATERIALEN EN METHODEN
18
Een alternatieve manier om de fluorescentie van de verschillende fluorescente kleurstoffen te
meten is door vriescoupes te maken van de geïsoleerde hersenen, en deze coupes vervolgens
te analyseren, met behulp van de BD Pathway 435 (BD Biosciences). Hiervoor moeten de
hersenen meteen na de isolatie, met behulp van vloeibare stikstof bevroren worden in
isopentaan (VWR International). De geïsoleerde hersenen kunnen vervolgens worden ingebed
(KP Cryocompound, Klinipath) en gestockeerd bij -80ºC. De cryosecties worden gemaakt
door middel van een vriesmicrotoom (Leica CM 3050S, Leica Biosystems). De temperatuur
in de cryostaatkamer bedraagt -20ºC, en er worden coronale coupes (50µm) gemaakt. De
coupes worden op draagglaasjes (SuperFrost® Plus, Thermo Scientific) gelegd en gemonteerd
door middel van ‘Vectashield Mounting Medium with DAPI’ (Vector Laboratories) en een
dekglaasje. Met behulp van de BD Pathway 435 worden er beeldjes opgenomen met een x10
objectief. Van deze beeldjes wordt een montage gemaakt die de volledige hersencoupe
afbeeldt. In dit overzichtsbeeld wordt vervolgens de fluorescentie-intensiteit, afkomstig van
de fluorescent-gelabelde probes, geanalyseerd ter hoogte van 20 punten in de corticale regio
(10 in de linker- en 10 in de rechterhemisfeer). Hiervoor wordt er gebruik gemaakt van het
beeldverwerkingsprogramma ImageJ.
2.1.2 Nagaan van astrogliale activatie
Door middel van immunohistochemie wordt nagegaan of de injectie van een inflammatoire
stimulus leidt tot activatie van astrocyten. Astrogliale activatie gaat namelijk gepaard met een
verhoogde expressie van ‘glial fibrillary acidic protein’ (GFAP), dat met behulp van een antiGFAP antilichaam gedetecteerd kan worden [43]. De muizen eerst geïnjecteerd met LPS of
0,9% NaCl, en er wordt, 3, 6 en 24 uur na de injectie, een transcardiale perfusie uitgevoerd,
zonder vooraf fluorescent-gelabelde probes te injecteren. Na isolatie van de hersenen worden
er vriescoupes, met een dikte van 30µm, gemaakt, waarop vervolgens een immuunkleuring
wordt uitgevoerd.
De hersencoupes worden eerst 3x 5min gespoeld met PBS (10x verdunde stockoplossing in
dH2O; Gibco®, Life Technologies™). De coupes worden dan afgegrensd met een toluolstift
(Novolab), waarna ze gedurende 10min geïncubeerd worden in 0,1% Sudan Black B (SigmaAldrich), opgelost in 70% ethanol, die zorgt voor een reductie van de autofluorescentie.
Daarna worden ze weer 3x 5min gespoeld met PBS, en worden ze gedurende 2h in
permeabilisatiebuffer, bestaande uit 0,2% Triton X-100 (BDH Chemicals) in PBS, geplaatst.
Vervolgens worden de hersencoupes gedurende 20min gewassen in wasbuffer, bestaande uit
0,05% Triton X-100 in PBS. Om aspecifieke binding van het antilichaam te verhinderen,
MATERIALEN EN METHODEN
19
worden de coupes ook nog gedurende 2h geïncubeerd in blokbuffer, bestaande uit 10%
‘normal goat serum’ (NGS; Invitrogen) en 0,05% Triton X-100 in PBS. Daarna wordt het
primaire anti-GFAP antilichaam (konijn; abcam®) opgelost (1/500) in een mengeling van
was- en blokbuffer (1/1), en wordt het weefsel er overnacht in geïncubeerd bij 4ºC. De dag
nadien worden de coupes 30min gewassen met blokbuffer, en vervolgens 2h geïncubeerd met
een secundair antilichaam, gekoppeld aan een fluorescente probe (Alexa Fluor® 488 geit antikonijn IgG antilichaam; Molecular Probes®, Invitrogen) en 200x verdund in een mengeling
van was- en blokbuffer (1/1), bij een temperatuur van 37ºC. De secties worden dan 30min
gewassen met blokbuffer en 3x 5min gespoeld met PBS. Vervolgens wordt een kernkleuring
uitgevoerd door het weefsel 10min in 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI; 1µg/ml; SigmaAldrich), dat bindt aan dubbelstrengig DNA, te incuberen. De coupes worden dan nog een
laatste maal 3x 5min gespoeld met PBS, alvorens ze in te bedden met ‘Vectashield Mounting
Medium’ (Vector Laboratories) en een dekglaasje. Beeldvorming en analyse gebeuren op een
analoge manier als deze beschreven voor de cryosecties bij de kleurstofextravasatie.
2.1.3 Nagaan van de rol van connexine kanalen
Connexine mimetische peptiden of gap peptiden zijn eiwitten met een sequentie die identiek
is aan een korte aminozuursequentie in de extracellulaire lussen of cytoplasmatische lus van
welbepaalde connexines. Hierdoor zijn ze in staat om gap juncties en/of hemikanalen, die
opgebouwd zijn uit bepaalde connexines, te blokkeren, en kunnen ze dus gebruikt worden om
het belang van deze connexine kanalen in de inflammatoire, endothelio-gliale signalisatie te
bestuderen [44]. Gap27 (SRPTEKTIFII; 25mg/kg; Pepnome) is een connexine mimetisch
peptide dat bindt op de extracellulaire domeinen van Cx37 en Cx43, en dat zowel gap juncties
als hemikanalen bestaande uit deze connexines blokkeert. Het mimetische peptide Gap19
(KQIEIKKFK; 25mg/kg; Pepnome), inhibeert selectief Cx43 hemikanalen op basis van een
interactie met intracellulaire domeinen van Cx43 [45-47]. Om de intracellulaire translocatie
van Gap19 te bevorderen wordt dit peptide gekoppeld aan een internalisatiesequentie (TAT,
YGRKKRRQRRR). De peptiden worden opgelost in 200µl 0,9% NaCl, en in de staartvene
van de muizen geïnjecteerd, door middel van een 0,3ml insulinespuitje. Meteen na de injectie
van het connexine mimetisch peptide wordt er LPS of 0,9% NaCl geïnjecteerd, en wordt de
mate van BHB disruptie, 3, 6 en 24 uur na injectie, onderzocht, aan de hand van extravasatie
van fluorescent-gelabelde probes, door vriescoupes te maken van de geïsoleerde hersenen, en
de fluorescentie-intensiteit te bepalen (zie 2.1.1 Nagaan van de mate van BHB disruptie).
MATERIALEN EN METHODEN
20
2.1.4 Nagaan van de rol van interastrocytaire Ca2+-signalisatie
Om het belang van interastrocytaire Ca2+-signalisatie in het verloop van BHB disruptie te
bestuderen, wordt er gebruik gemaakt van de Ca2+ chelator BAPTA-AM (Molecular Probes®,
Invitrogen), die, na het uitvoeren van een craniotomie, op het hersenoppervlak van de muizen
geïncubeerd wordt. BAPTA-AM verhindert een stijging van de astrocytaire Ca2+-concentratie,
waardoor er geen gebruik gemaakt kan worden van Ca2+-signalisatie tijdens de inflammatoire,
endothelio-gliale interacties [48]. Voor het uitvoeren van de craniotomie, worden de muizen
geanestheseerd via IP ketamine/xylazine injectie. Eens de staart- en teenknijpreflex afwezig
zijn, worden de muizen geïmmobiliseerd op een stereotactisch frame. De ogen worden tegen
uitdroging beschermd door middel van een laagje Terramycine oogzalf (Pfizer). Met behulp
van een scalpel wordt een incisie gemaakt ter hoogte van de craniale middenlijn. Vervolgens
wordt er een kleine opening geboord in de rechter schedelhelft, net anterieur ten opzichte van
het punt van bregma, en wordt de dura mater zeer voorzichtig van het hersenoppervlak
verwijderd. Er wordt een BAPTA-AM oplossing (25µl) in het craniaal venster gedruppeld.
Deze oplossing bestaat uit een stockoplossing van BAPTA-AM (33mM; Molecular Probes®,
Invitrogen) en Pluronic F-127 (0,16%; Molecular Probes®, Invitrogen), in Dimethylsulfoxide
(DMSO; Sigma-Aldrich), 16 maal verdund in ‘artificial cerebrospinal fluid’ (aCSF; Tabel 4,
zie addendum) met sulforhodamine 101 (1/100; Sigma-Aldrich). De uiteindelijke concentratie
van BAPTA-AM op het hersenoppervlak is 2mM. Na 1h wordt de oplossing weggewassen
met aCSF. Er wordt dan meteen LPS of 0,9% NaCl geïnjecteerd, en de craniale incisie wordt
toegemaakt. Ook hier wordt de mate van BHB disruptie, 3, 6 en 24 uur na de injectie van LPS,
nagegaan, door de fluorescentie-intensiteit van de fluorescent-gelabelde probes in vriescoupes
te bepalen (zie 2.1.1 Nagaan van de mate van BHB disruptie). De sulforhodamine wordt
tijdens de analyse van de hersencoupes gebruikt om de behandelde zone te kunnen lokaliseren.
2.2 Celcultuur
Onder celcultuur wordt het gecontroleerd laten groeien van cellen buiten hun normale in vivo
omstandigheden verstaan. De celculturen waarvan in deze studie gebruik gemaakt wordt zijn
een muis-afkomstige geïmmortaliseerde cerebrale endotheelcellijn (bEnd.3), een C6 cellijn,
afkomstig van een rat glioma, getransfecteerd met DNA coderend voor Cx43 (C6Cx43) en
een primaire, capillaire endotheelcelcultuur, geïsoleerd uit muis-afkomstig hersenweefsel.
Alle handelingen aangaande het opstarten en onderhouden van celculturen dienen in steriele
omstandigheden te gebeuren, en worden daarom uitgevoerd in een type II veiligheidskabinet.
MATERIALEN EN METHODEN
21
De lucht aanwezig in het kabinet wordt continu gefilterd, en dankzij de aanwezigheid van een
scherm tussen het kabinet en de operator, worden zowel de operator als de cellen beschermd
tegen contaminatie.
2.2.1 Celcultuur opstarten
De ampules met ingevroren b.End3 cellen worden uit de stikstoftank gehaald en ontdooid in
een warmwaterbad bij 37°C. De inhoud wordt overgebracht in 10ml celmedium (Tabel 5, zie
addendum) en 1min gecentrifugeerd (500g). Dan wordt het supernatans geaspireerd, wordt er
5ml vers celmedium toegevoegd aan de cellen en wordt de celsuspensie overgebracht in een
25cm2 falcon, gecoat met gelatine (1,5%; Sigma-Aldrich). De celcultuur wordt onderhouden
in een 10% CO2 incubator.
2.2.2 Cellen splitsen en uitzaaien
Eens de celcultuur confluent is, wordt ze gesplitst en uitgezaaid in 25cm 2 of 75cm2 falcons.
Hierbij wordt eerst het celmedium uit de oude falcon geaspireerd, wordt er Trypsine-EDTA
(1,5ml voor een 25cm2 falcon en 3ml voor een 75cm2 falcon; Invitrogen) gepipetteerd op de
cellen en worden ze gedurende 2min geïncubeerd bij 37ºC. Trypsine is een protease dat celcel en cel-substraat contacten verbreekt, en zal in combinatie met EDTA, dat een Ca2+
chelator is, ervoor zorgen dat de bEnd.3 cellen loskomen van de bodem van de falcon.
Vervolgens wordt de Trypsine-EDTA geneutraliseerd door celmedium toe te voegen (3,5ml
voor een 25cm2 falcon en 7ml voor een 75cm2 falcon), en wordt de celsuspensie een aantal
keer geresuspendeerd. De cellen worden dan overgebracht in nieuwe falcons naargelang de
gewenste densiteit, en aangevuld met celmedium.
2.2.3 Cellen invriezen
Net als bij het splitsen van cellen, wordt ook hier het celmedium geaspireerd, worden de
cellen in Trypsine-EDTA geïncubeerd en wordt er celmedium toegevoegd om de TrypsineEDTA te neutraliseren. De celsuspensie wordt dan vervolgens 1min gecentrifugeerd (500g),
waarna het supernatans verwijderd wordt en de celpellet wordt geresuspendeerd in 900µl
celmedium. Deze celsuspensie wordt overgebracht in een ampule, waaraan ook 100µl DMSO
wordt toegevoegd. Dit cryoprotectant zorgt ervoor dat de cellen niet beschadigd worden
tijdens het invriezen. De ampules worden overnacht, bij -80ºC, geïncubeerd in isopropanol
(VWR International), waarna ze overgebracht worden in een stikstofcontainer (-196ºC).
MATERIALEN EN METHODEN
22
2.2.4 Primaire, capillaire endotheelcelcultuur opstarten
Om contaminatie te vermijden, wordt er zo steriel mogelijk gewerkt. Scharen, spatels en
andere dergelijke materialen worden net voor gebruik gesteriliseerd door ze eerst in ethanol te
dompelen, ze dan kort in een vlam te houden en ze vervolgens af te spoelen met PBS. Er
wordt ook zoveel mogelijk in een type II veiligheidskabinet gewerkt.
Er worden 10 muizen gedecapiteerd. Hun hersenen worden geïsoleerd en vervolgens op ijs
bewaard in PBS. De hersenen worden dan gespoeld, door ze over te brengen in een
petrischaaltje, gevuld met verse PBS. Vervolgens worden ze op een steriel gaasje geplaatst, en
wordt de witte stof, zijnde het cerebellum, de corpora striata, de optische zenuwen en de
hersenstam, door middel van een pincet verwijderd. De hersenen worden dan over het gaasje
gerold, om de meningen en de daarin vervatte grote bloedvaten te verwijderen. Vervolgens
wordt het hersenweefsel overgebracht in een petrischaaltje, gevuld met ‘Washing Buffer B’
(WBB; Tabel 6, zie addendum), en gespoeld door het weer over te brengen in een nieuw
petrischaaltje, gevuld met verse WBB.
Om het weefsel te homogeniseren, wordt het overgebracht in een ‘Dounce Homogenizer’
(VWR International) met een volume van 15ml. Er wordt 10ml verse WBB toegevoegd, en
het hersenweefsel wordt gehomogeniseerd door 55 keer op en neer te bewegen met een losse
stamper, deze in de homogenisator af te spoelen met een klein volume WBB, vervolgens 25
keer op en neer te bewegen met een nauwere stamper en deze ook met een klein volume WBB
af te spoelen. Het homogenaat wordt vervolgens verdeeld over twee centrifugatietubes (50ml)
en de homogenisator wordt afgespoeld met 10ml verse WBB, die ook verdeeld wordt over de
tubes, waarna er 18ml 30% dextraan oplossing wordt toegevoegd (Tabel 6, zie addendum).
Het homogenaat wordt vier keer 25min gecentrifugeerd (3000g), bij 4ºC. Het supernatans en
de vetlaag, die myeline en gliale cellen bevat, worden hierbij steeds overgebracht in twee
nieuwe centrifugatietubes en de pellet wordt bewaard bij 4ºC, na toevoeging van 1ml koude
WBB. Na de vierde centrifugatie wordt het supernatans verwijderd, wordt er 10ml WBB
toegevoegd aan de pellet, en wordt er nog 9ml extra WBB toegevoegd aan de pellets van de
eerdere centrifugaties.
Er wordt zes keer een dissociatiestap uitgevoerd, voor een verdere isolatie van de bloedvaten,
en om aggregatie van capillairen onderling te vermijden. Eerst wordt er geresuspendeerd, om
de pellet los te maken van de bodem van de tube. Vervolgens worden de geresuspendeerde
bloedvaten opgezogen en met een kracht terug in de tube gepipetteerd. De inhoud van de
MATERIALEN EN METHODEN
23
verschillende tubes wordt verdeeld over twee nieuwe tubes, en de tubes worden nog eens
gespoeld met 10ml WBB, die vervolgens ook overgebracht wordt in de twee nieuwe tubes.
Vervolgens wordt de celsuspensie gefiltreerd doorheen een 60µm nylon membraan, om het
grootste deel van de resterende grote bloedvaten te verwijderen, en wordt het filtraat bewaard
in een centrifugatietube. Omdat hierbij ook een deel van de capillairen verloren gaat, wordt de
membraan afschraapt in petrischaaltje met WBB, en wordt het schraapsel nog eens gefiltreerd.
Het filtraat wordt 7min gecentrifugeerd (1000g), bij 37ºC. Vervolgens wordt het supernatans
geaspireerd, en wordt er een voorverwarmde enzymoplossing (Tabel 6, zie addendum) aan de
pellets toegevoegd. Dit zorgt voor afbraak van de basale membraan, waardoor endotheelcellen
uit de bloedvaten kunnen groeien. Er wordt geresuspendeerd en de inhoud van de tubes wordt
samengevoegd. Vervolgens wordt de celsuspensie 33min opgewarmd in een warmwaterbad,
bij 37ºC. De enzymreactie wordt stopgezet door 20ml vers WBB toe te voegen, en er wordt
7min gecentrifugeerd (1000g), bij kamertemperatuur. Het supernatans wordt geaspireerd en er
wordt 10ml vers WBB toegevoegd aan de pellet, waarna er geresuspendeerd wordt. De reeds
eerder uitgevoerde dissociatiestap wordt vervolgens nog eens zes keer herhaald, en er wordt
weer 7min gecentrifugeerd (1000g), bij kamertemperatuur. Het supernatans wordt geaspireerd
en er wordt 3,3ml celmedium (Tabel 6, zie addendum) toegevoegd aan de pellet. Er wordt
390µl van deze celsuspensie, samen met 1,95µl ‘basic fibroblast growth factor’ (bFGF;
200ng/ml stockoplossing; Tabel 6, zie addendum), toegevoegd aan elk van de vooraf gecoate
petrischaaltjes (Tabel 6, zie addendum).
Het celmedium en de bFGF dienen de dag na het opstarten van de celcultuur, en daarna om de
twee dagen, ververst te worden. Dit dient ook te gebeuren 12h voor manipulatie van de cellen.
De primaire, capillaire endotheelcelcultuur is vijf dagen na het opstarten van de cultuur klaar
voor manipulatie.
2.3 Gelelektroforese/Western blot en gelatine zymografie
Door middel van western blotting worden eiwitten gescheiden op basis van hun moleculaire
massa, waarna ze gedetecteerd kunnen worden aan de hand van immunodetectie. De stalen
waarvan gebruik zal worden gemaakt zijn LPS-behandelde bEnd.3 cellen, primaire, capillaire
endotheelcellen en hersenweefsel van FVB muizen. Vooraleer deze stalen op de gel geladen
kunnen worden, dienen ze te worden gelyseerd en dient de eiwitconcentratie in het lysaat te
worden bepaald. Het scheiden van de eiwitten gebeurt vervolgens door middel van ‘sodium
dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis’ (SDS-PAGE). Tijdens het blotten worden
MATERIALEN EN METHODEN
24
de eiwitten vanuit de gel getransfereerd naar een nitrocellulosemembraan, waardoor bepaalde
eiwitten nadien via antilichamen gedetecteerd kunnen worden. De aanwezigheid van bepaalde
matrixmetalloproteïnasen (MMP’s) wordt onderzocht door middel van gelatine zymografie,
waarbij MMP’s, na gelelektroforese, worden gerenatureerd, waardoor ze terug actief gelatine
afbreken. MMP detectie gebeurt in LPS-behandelde bEnd.3 cellysaten, geconditioneerd
medium en plasmastalen van FVB muizen.
2.3.1 Cellysaten
Voor het lyseren van de endotheelcelculturen, worden deze 3, 6 of 24h voordien geïncubeerd
in LPS (1µg/ml), opgelost in HBSS-Hepes. Ter controle, zal er ook lysaat worden gemaakt
van een celcultuur die niet behandeld werd met LPS. Eerst wordt het geconditioneerd medium
verwijderd, en bewaard bij -80ºC. De celcultuur wordt dan drie keer gewassen met PBSD+
(Tabel 7, zie addendum), en er wordt lysebuffer (Laemmli of RIPA; Tabel 8, zie addendum)
toegevoegd. De cellen worden vervolgens, met behulp van een celschraper (Sigma-Aldrich),
van de bodem van de falcon geschraapt, en overgebracht in een epje. Door middel van
sonificatie (30 pulsen; Labsonic U, B. Braun) worden de cellen blootgesteld aan ultrasone
golven, waardoor ze volledig worden gelyseerd. De cellysaten worden bewaard bij -20ºC.
2.3.2 Hersenlysaten
De hersenen zijn afkomstig van mannelijke FVB muizen die, 3, 6 of 24h voor de isolatie van
de hersenen, behandeld werden met LPS. Net voor de isolatie van het hersenweefsel, wordt
het bloed, via de apex van het hart, gecollecteerd, en wordt er een transcardiale perfusie
uitgevoerd. Het bloed wordt dan 10min gecentrifugeerd (2000g), waarna het supernatans of
bloedplasma bewaard wordt bij -20ºC. De geïsoleerde hersenen worden, in een tube, op ijs
geplaatst, en worden geïncubeerd in voorgekoelde RIPA buffer (3,33ml/g). Het hersenweefsel
wordt vervolgens 15min gehomogeniseerd (2000rpm) en 20min gecentrifugeerd (1500g), bij
4ºC, alvorens het supernatans bij -80ºC te bewaren.
2.3.3 Eiwitconcentratie bepalen
Om van elk van de stalen evenveel eiwit te kunnen laden op de elektroforesegel, wordt de
eiwitconcentratie in elk staal gemeten met behulp van de ‘DC Protein Assay Kit’ (Bio-Rad)
en de plaatlezer. Er wordt 5µl van de stalen geladen in een multititerplaat, samen met 25µl
van een mengsel bestaande uit 1ml reagens A (alkalische koper tartraat oplossing) en 20µl
reagens S (SDS), en 200µl reagens B (foline reagens). Er zal een colorimetrische reactie
optreden, door interactie van de eiwitten uit de stalen met het alkalische koper tartraat en het
MATERIALEN EN METHODEN
25
foline reagens. Hierdoor zullen de stalen een blauwkleuring vertonen, waarvan de intensiteit
recht evenredig is met de eiwitconcentratie. Reagens S zal ervoor zorgen dat de absorbanties
van de verschillende stalen, gemeten door de plaatlezer bij 509nm, niet met elkaar interfereren.
Door tegelijkertijd de absorbantie van een standaardreeks met gekende concentraties BSA te
meten, wordt er een standaardcurve opgesteld. Ten gevolge van het lineair verband tussen de
absorbantie en de eiwitconcentratie, kan de eiwitconcentratie in de stalen rechtstreeks afgeleid
worden aan de hand van de absorbantie, door gebruik te maken van deze standaardcurve.
2.3.4 Western blot
2.3.4.1 SDS-PAGE
Om de eiwitten uit de stalen op basis van moleculaire massa te scheiden, wordt er gebruik
gemaakt van SDS-PAGE. Door binding aan natriumdodecylsulfaat (SDS), worden de eiwitten
negatief geladen, en migreren ze vervolgens, onder invloed van een elektrische stroom, van de
negatieve naar de positieve pool. De gelmatrix van de polyacrylamide gel functioneert tijdens
de migratie als een soort van moleculaire zeef, waardoor kleinere eiwitten sneller kunnen
migreren dan grote eiwitten.
Eerst worden de stalen verdund, door 2µl reducerend agens (10x; Invitrogen) en 4µl NuPAGE
LDS sample buffer (5x; Invitrogen) aan elk staal toe te voegen, en het mengsel met lysebuffer
aan te vullen tot een volume van 20µl. De eindmassa eiwit die geladen wordt op de gel is
50µg. Vooraleer de stalen geladen worden, worden ze 5min verhit tot een temperatuur van 7090ºC, en enkele seconden gecentrifugeerd. De gel (NuPAGE Bis-Tris 4-12% Precast Gel,
Invitrogen) wordt in de gelhouder (Invitrogen) geplaatst, waarna het binnenste compartiment
van het elektroforesetoestel (XCell SureLock™, Novex®, Invitrogen) opgevuld wordt met
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x verdund in dH2O; Invitrogen), aangelengd met
NuPAGE antioxidant (500µl/200ml; Invitrogen). Het buitenste compartiment wordt gevuld
met de rest van de ‘running buffer’. De stalen worden vervolgens in de slotjes van de gel
geladen (20µl per slotje). Eén slotje wordt geladen met 20µl merker (SeeBlue® Plus2 Prestained Protein Standard; Invitrogen), die een aantal eiwitten met een gekende moleculaire
massa bevat, waardoor de moleculaire massa van de te detecteren eiwitten eenvoudig kan
worden nagegaan (Figuur 4). Vervolgens wordt er een spanning van 100V aangelegd. Eens de
stalen zich in de overgang van de ‘stacking gel’ naar de ‘running gel’ bevinden, wordt de
spanning opgedreven naar 120V. De elektroforese vindt plaats op ijs, opdat de gel niet zou
smelten, en wordt beëindigd eens de te visualiseren eiwitten voldoende gescheiden zijn in de
‘running gel’, wat op basis van de merker wordt bepaald.
MATERIALEN EN METHODEN
26
Figuur 4: SeeBlue® Plus2 Pre-stained Protein Standard. Elk van de bandjes van de merker op de NuPAGE
Bis-Tris 4-12% Gel komt overeen met een bepaalde moleculaire massa, waardoor de moleculaire massa van de
te detecteren eiwitten eenvoudig kan worden nagegaan.
2.3.4.2 Western blotting
Om de gescheiden eiwitten te visualiseren, dienen ze eerst overgebracht te worden naar een
nitrocellulosemembraan. Dit gebeurt eveneens onder invloed van een elektrisch veld, waarbij
de negatief geladen eiwitten naar de positieve pool migreren, maar tegengehouden worden
door het membraan. De blotcassette (XCell II™ Blot Module, Novex®, Invitrogen) wordt van
de anode (+) naar de kathode (-) opgevuld met een sponsje (Invitrogen), twee 1MM
Whatmann papiertjes (Bio-Rad), een nitrocellulosemembraan (Thermo Scientific), de gel,
twee Whatmann papiertjes en een sponsje, nadat al deze elementen doordrenkt werden met
blotting buffer, bestaande uit 100ml Tris-Glycine SDS Running Buffer (10x; Bio-Rad), 700ml
dH2O en 200ml methanol (Vel). De blotcassette wordt dan in het blottingtoestel geklemd,
waarna deze gevuld wordt met de blotting buffer, en er gedurende 90min een spanning van
30V wordt aangelegd. Om de gel niet te doen smelten, gebeurt ook de blotting op ijs.
2.3.4.3 Immunodetectie
Bepaalde eiwitten op de nitrocellulosemembraan worden gevisualiseerd door het membraan te
incuberen met een primair antilichaam, specifiek gericht tegen het te detecteren eiwit, en het
dan te incuberen met een alkalisch fosfatase-gelabeld secundair antilichaam, gericht tegen het
primair antilichaam. Eerst dient de nitrocellulosemembraan gedurende 60min in blokbuffer te
worden geïncubeerd. Dit zorgt ervoor dat alle vrije plaatsen op de nitrocellulosemembraan
geblokkeerd worden, zodat er geen aspecifieke binding van het primaire antilichaam kan
MATERIALEN EN METHODEN
27
optreden. De samenstelling van deze blokbuffer is afhankelijk van het eiwit dat men wenst te
visualiseren (Tabel 9, zie addendum). Vervolgens wordt het membraan overnacht, bij 4ºC,
geïncubeerd met het primaire antilichaam, opgelost in blokbuffer (Tabel 10, zie addendum).
Het membraan wordt dan 3x 15min gewassen met verse blokbuffer, en gedurende 60min, bij
kamertemperatuur, geïncubeerd met een alkalisch fosfatase-gekoppeld secundaire antilichaam,
opgelost in blokbuffer (Tabel 10, zie addendum). Vervolgens wordt het membraan 3x 15min
gewassen met blokbuffer, waaraan geen ‘blocking agens’ werd toegevoegd, en geïncubeerd in
3ml nitro blauw tetrazolium chloride (NBT) en 3ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl fosfaat
(BCIP) (NBT⁄BCIP Reagent Kit; Molecular Probes®, Invitrogen), verdund in 24ml dH2O.
Ter hoogte van de bindingsplaats van het alkalisch fosfatase-gelabeld secundair antilichaam,
zal er een paarse neerslag optreden, door enzymatische afsplitsing van een fosfaatgroep van
BCIP, gemedieerd door het alkalisch fosfatase, gevolgd door oxidatie van dit reactieproduct
door NBT. Deze kleurreactie leidt bijgevolg tot visualisatie van het gewenste eiwit. Tenslotte
wordt er nog een ladingscontrole uitgevoerd, door op dezelfde wijze een immunodetectie uit
te voeren voor β-tubuline, een bouwsteen van microtubuli, of glyceraldehyde 3-fosfaat
dehydrogenase (GADPH), een enzym dat een rol speelt tijdens de glycolyse (Tabel 10, zie
addendum). Beiden zijn huishoudeiwitten die continu aanwezig zijn in alle cellen, en zouden
bijgevolg in dezelfde mate aanwezig moeten zijn in elk van de geladen stalen. Voor de
analyse wordt er gebruik gemaakt van ImageJ, waarbij de intensiteit van het signaal gemeten
wordt in de bandjes van het gevisualiseerde eiwit, en deze waarde gecorrigeerd wordt door
hetzelfde te doen in een zone waar geen eiwit aanwezig is en vervolgens de oorspronkelijke
waarde met deze waarde te verminderen.
2.3.5 Gelatine zymografie
Om de invloed van de inflammatoire stimulus op de expressie van MMP’s na te gaan, wordt
er gebruik gemaakt van gelatine zymografie. MMP’s zijn enzymen die geproduceerd worden
door onder andere microglia en endotheelcellen, en waarvan de expressie in inflammatoire
omstandigheden, onder invloed van bepaalde cytokines en endotoxines, wordt opgedreven. Ze
leiden tot degradatie van de basale membraan, waardoor ze, tijdens neuroinflammatie, de
migratie van inflammatoire celtypes in het centrale zenuwstelsel zullen faciliteren [49].
De gel wordt bereid door 20ml vloeibare, gelatine-bevattende ‘running gel’ (Tabel 11, zie
addendum) in een lege gelcassette (Novex®, Invitrogen) te pipetteren, eventuele bubbels te
verwijderen met behulp van isobutanol (VWR International) en de gel te laten polymeriseren.
Vervolgens wordt de isobutanol weggespoeld met dH2O, wordt er 5ml vloeibare ‘stacking gel’
MATERIALEN EN METHODEN
28
(Tabel 11, zie addendum) op de ‘running gel’ gepipetteerd en wordt er, ter vorming van de
slotjes, een kam in de ‘stacking gel’ geplaatst. Voor elk van de stalen wordt een volume dat
overeenkomt met 20µg eiwit verdund in een zelfde volume Tris-Glycine SDS Sample Buffer
(2x; Bio-Rad) met 0,1% bromofenolblauw (Sigma-Aldrich). De gel wordt dan in de gelhouder
geplaatst en het elektroforesetoestel wordt gevuld met Tris-Glycine SDS Running Buffer (10x
verdund in dH2O; Bio-Rad). De stalen worden kort gecentrifugeerd en in de slotjes van de gel
geladen. Eén slotje wordt gevuld met 20µl merkervloeistof, en er wordt een spanning van
120V aangelegd. Tijdens de gelelektroforese worden de MMP’s gedenatureerd, en bijgevolg
ook geïnactiveerd. Daarom zal de gel, na het scheiden van de eiwitten, gedurende 1h
gewassen worden met 2,5% Triton X-100 in dH2O. Hierdoor wordt de SDS weggewassen,
waardoor de MMP’s renatureren, terug actief worden en de gelatine afbreken. De gel wordt
vervolgens gedurende 30min geïncubeerd in ontwikkelingsbuffer (Tabel 12, zie addendum),
en overnacht, bij 37ºC, geïncubeerd in verse ontwikkelingsbuffer. De volgende dag wordt de
gel 3x 5min gewassen met dH2O en gekleurd door middel van Coomassie blauw (0,2%; BioRad), opgelost in een oplossing bestaande uit 100ml azijnzuur (VWR International), 450ml
methanol en 400ml dH2O. Tenslotte wordt de gel terug ontkleurd, via de oplossing bestaande
uit azijnzuur, methanol en dH2O, waardoor de niet gekleurde laantjes, waar gelatine werd
afgebroken door de aanwezige MMP’s, contrasteren tegen de achtergrond van de blauw
gekleurde gel.
2.4 Ca2+ imaging
Om de inflammatoire Ca2+-signalisatie ter hoogte van het BHB endotheel en de perivasculaire
astrocyten te bestuderen, wordt er gebruik gemaakt van een confluente bEnd.3 en C6Cx43
celcultuur, gegroeid op dekglaasjes. De dekglaasjes worden gespoeld in HBSS-Hepes met
probenecid, dat wordt bereid door 0,285g probenecid (Sigma-Aldrich), opgelost in 1,5ml
NaOH (VWR International), toe te voegen aan 1l HBSS-Hepes, en de pH naar 7,3 te brengen,
door extra NaOH toe te voegen. Vervolgens worden ze gedurende 60min, in een donkere
ruimte, geïncubeerd in fluo3-AM (5mM, opgelost in DMSO; Molecular Probes®, Invitrogen)
en 0,5µl/ml Pluronic® F-127, opgelost in HBSS-Hepes met probenecid. Fluo3-AM is een
acetoxymethyl (AM) ester, en daardoor een substraat voor P-glycoproteïne, die het uit de cel
zal pompen voor het gekliefd kan worden door intracellulaire esterasen. Probenecid zorgt er
echter voor dat fluo3-AM toch lang genoeg in de cel blijft om gekliefd te worden, waardoor
het geen substraat meer vormt voor P-glycoproteïne, en de cel bijgevolg geladen wordt met
fluo3. De fluorescentie-intensiteit van fluo3 zal toenemen naarmate de intracellulaire Ca2+MATERIALEN EN METHODEN
29
concentratie toeneemt. Dit vormt de basis voor visualisatie van Ca2+-signalen. Na de incubatie
worden de dekglaasjes weer gespoeld en vervolgens, ter deësterificatie, gedurende 30min
geïncubeerd in HBSS-Hepes met probenecid. Daarna worden de cellen overgebracht naar een
omgekeerde epifluorescentiemicroscoop (Nikon Eclipse TE300, Nikon Belux) met een 40x
olie-immersie objectieflens. Elke seconde wordt er een beeld genomen door een elektronenmultiplicatie CCD-camera (Quantem 512SC, Photometrics). Om een excitatiegolflengte van
482nm te bekomen, wordt gebruik gemaakt van een Lambda DG-4 filterswitch (Sutter
Instrument Company), en het emissielicht wordt opgevangen door middel van een 505nm
longpass dichroïsche spiegel en een 535nm bandpass filter (35nm bandbreedte). Tijdens de
opname en analyse van de beelden wordt er gebruik gemaakt van QuantEMframes software.
De cellen worden gedurende 1min geïncubeerd in HBSS-Hepes met probenecid, waarna de
badoplossing, door middel van een superfusiesysteem, vervangen wordt door een
inflammatoire stimulus, opgelost in HBSS-Hepes met probenecid, die 10min op de cellen
wordt geïncubeerd. De beelden worden geanalyseerd door de fluorescentie-intensiteit van
fluo3 uit te zetten in functie van de tijd, en het aantal Ca2+-oscillaties, ontstaan na toediening
van de inflammatoire stimulus, te tellen, waarbij oscillerende cellen gedefinieerd wordt als
cellen waarin tenminste twee toenames van de intracellulaire Ca2+-concentratie worden gezien.
2.5 Statistische analyse
De bekomen data worden uitgedrukt als gemiddelde ± een standaardfout, waarbij n staat voor
het aantal onafhankelijke experimenten, en de controles worden gelijkgesteld aan 100%. De
statistische analyse gebeurt met behulp van het statistische programma GraphPad Instat 3,
waarbij de verschillende groepen met elkaar vergeleken worden door middel van ANOVA en
de parametrische Bonferroni post-test, en twee groepen onderling worden vergeleken met
behulp van een 'student's t-test' en 'two-tail' p-waarde. De resultaten worden als statistisch
significant beschouwd als p < 0,05 (* < 0,05; ** < 0,01; *** < 0,001).
MATERIALEN EN METHODEN
30
3. RESULTATEN
3.1 In vivo ziektekarakteristieken
Na de IP injectie van LPS (25mg/kg) in mannelijke FVB muizen, werden een aantal externe
ziektekarakteristieken geobserveerd. Deze werden 3h na de injectie zichtbaar, en werden
duidelijker naarmate het 24h tijdspunt naderde. De muizen vertoonden een daling in mobiliteit
en zaten vaak in elkaar gedoken, met een bolle rug en half dichtgeknepen ogen. Daarnaast
kregen ze ook een matte, plukkerige vacht, etterende ogen en diarree. De gebruikte LPS dosis
leidde, binnen het 24h observatievenster, niet tot een gestegen mortaliteit, aangezien de LPSbehandelde muizen, tot 24h na de injectie, zelfs een iets hogere overleving hadden dan de
controles, die met 0,9% NaCl werden geïnjecteerd (Figuur 5).
Figuur 5: Externe ziektekarakteristieken van LPS-geïnflammeerde FVB muizen. Mannelijke FVB muizen
werden IP geïnjecteerd met 25mg/kg LPS. De eerste ziektekarakteristieken werden 3h na de injectie zichtbaar
(verminderde mobiliteit), en werden duidelijker naarmate het 24h tijdspunt naderde (diarree, etterende ogen en
matte vacht). De overleving tot 24h na de injectie lag hoger bij de LPS-behandelde muizen dan bij de controles
(0,9% NaCl injectie).
De geobserveerde externe ziektekarakteristieken gaan gepaard met een gestegen concentratie
van MMP’s in bloedplasmastalen, aangetoond via gelatine zymografie. Het uitvoeren van een
western blot met specifieke antilichamen moet meer duidelijkheid geven over de identiteit van
deze MMP’s, maar op basis van de moleculaire massa zouden de bovenste bandjes overeen
kunnen komen met MMP-9 (92kDa), terwijl lager gelegen bandjes MMP-2 (72kDa) zouden
kunnen voorstellen (Figuur 6).
Figuur 6: MMP detectie in bloedplasma van FVB muizen. Gelatine zymografie op bloedplasmastalen van
FVB muizen gaf bij de LPS-behandelde stalen een bandje rond 72kDa en 92kDa, die mogelijk overeenkomen
met MMP-2 en MMP-9 respectievelijk.
RESULTATEN
31
3.2 BHB permeabiliteit
Na het induceren van systemische inflammatie, door middel van IP LPS injectie (25mg/kg),
werd het effect van deze inflammatoire stimulus op de permeabiliteit van de BHB nagegaan.
Dit werd gedaan door, 3, 6 en 24 uur na LPS injectie, een aantal fluorescent-gelabelde probes
met toenemende moleculaire massa (3kDa dextraanfluoresceïne, 10kDa dextraan-Texas Red
en 70kDa FITC-albumine) in de staartvene van de FVB muizen te injecteren, en de hersenen,
na transcardiale perfusie, te isoleren. Controle muizen kregen 0,9% NaCl geïnjecteerd, in
plaats van LPS, en werden 24h later ook geïnjecteerd met één van de fluorescente probes.
Een eerste manier waarop de fluorescentie-intensiteit van de verschillende fluorescente probes
in het hersenweefsel geanalyseerd werd, was door het weefsel overnacht in formamide te
incuberen en vervolgens de fluorescentie-intensiteit in de oplossing te meten door middel van
een plaatlezer. Dit experiment resulteerde in een gestegen fluorescentie-intensiteit voor elk
van de fluorescent-gelabelde probes in het hersenweefsel, en bijgevolg een toename van de
BHB permeabiliteit voor deze fluorescente kleurstoffen, 3, 6 en 24 uur na de injectie van LPS.
(Figuur 7). De enige uitzondering was de fluorescentie-intensiteit voor 10kDa dextraan-Texas
Red, die 3h na LPS injectie lager was dan de fluorescentie-intensiteit voor die kleurstof in de
controle. Mogelijk is dit te wijten aan een gefaalde IV injectie van deze fluorescente probe.
Figuur 7: Formamide: analyse van BHB permeabiliteit voor fluorescent-gelabelde probes na LPS injectie.
Overzicht van de relatieve fluorescentie-intensiteit, ten opzichte van de controle (=100%) (---), voor 3kDa
dextraanfluoresceïne, 10kDa dextraan-Texas Red en 70kDa FITC-albumine in formamide. De fluorescentie werd
bekomen door het hersenweefsel van muizen, behandeld met LPS en, 3, 6 of 24 uur later, geïnjecteerd met één
van de fluorescente probes, overnacht in formamide te incuberen. Hierdoor wordt er een beeld gecreëerd van de
BHB permeabiliteit voor de fluorescente kleurstoffen op verschillende tijdstippen na LPS injectie.
RESULTATEN
32
Alternatief werd de fluorescentie-intensiteit voor de fluorescente kleurstoffen in de hersenen
van de LPS-behandelde muizen gemeten aan de hand van cryosecties. Er werden coronale
coupes gemaakt, met een dikte van 50µm, waarvan vervolgens beeldjes werden opgenomen
door middel van de BD Pathway 435, met een 10x objectief. De fluorescentie-intensiteit werd
vervolgens geanalyseerd ter hoogte van 20 punten in de corticale regio (10 in de linker- en 10
in de rechterhemisfeer), gebruik makende van ImageJ (Figuur 8). Hier werd een stijging
gezien van de fluorescentie-intensiteit voor elk van de kleurstoffen, zowel 3, 6 als 24 uur na
de LPS injectie. Deze stijging van de BHB permeabiliteit kent een tijdsafhankelijk verloop, en
is significant voor de 3kDa en 10kDa kleurstoffen, 6 en 24 uur na injectie van LPS (Figuur 9).
Figuur 8: Overzichtsbeelden van fluorescentie-intensiteit in hersencoupes. Op de overzichtsbeelden van de
hersencoupes is, na de injectie van LPS, een tijdsafhankelijke stijging van de fluorescentie-intensiteit voor de
verschillende fluorescent-gelabelde probes te zien.
Figuur 9: Cryosecties: analyse van BHB permeabiliteit voor fluorescent-gelabelde probes na LPS injectie.
Overzicht van de relatieve fluorescentie-intensiteit in de hersencoupes voor de fluorescente kleurstoffen, 3, 6 en
24 uur na LPS injectie. * = statistische significantie ten opzichte van de controle conditie (=100%) (---). De
getallen in de bars stellen het aantal experimenten (n) voor.
RESULTATEN
33
De LPS-geïnduceerde BHB disruptie, die werd gezien in het kleurstofextravasatie experiment,
wordt deels bevestigd via een gestegen albuminegehalte in hersenlysaten van LPS-behandelde
FVB muizen, aangetoond door middel van western blot. Aangezien albumine een eiwit is dat
zich in normale omstandigheden enkel in het bloedplasma bevindt, wijst extravasatie van dit
serumproteïne in het hersenweefsel op een gestegen permeabiliteit van de BHB [50]. Op het
3h en 24h tijdspunt werd er inderdaad een stijging gezien in de extravasatie van albumine,
terwijl het albuminegehalte in de hersenlysaten 6h na LPS-injectie lager was dan dat van de
controle. (Figuur 10).
Figuur 10: LPS-geïnduceerde extravasatie van albumine. Western blot analyse van het albuminegehalte in
hersenlysaten van LPS-behandelde FVB muizen resulteerde in een niet-significante stijging, ten opzichte van de
controle conditie (=100%) (---), 3h en 24h na injectie van LPS, en een niet-significante daling op het 6h tijdspunt.
GAPDH werd gebruikt als ladingscontrole. De getallen in de bars stellen het aantal experimenten (n) voor.
Alternatief werd systemische inflammatie geïnduceerd door een mix van pro-inflammatoire
cytokines, waarvan eerder onderzoek aantoonde dat de serumconcentratie gestegen is na LPS
injectie (IL-1β, IFNγ en TNFα; 40µg/kg elk), in de staartvene te injecteren. Op alle tijdstippen
werd een significante stijging gezien van de fluorescentie-intensiteit, en bijgevolg de BHB
permeabiliteit, voor 3kDa dextraanfluoresceïne in de corticale regio van cryosecties van de
muizenhersenen (Figuur 11).
Figuur 11: BHB permeabiliteit na injectie van pro-inflammatoire cytokines. De injectie van IL-1β, IFNγ en
TNFα zorgde op alle tijdstippen voor een significante stijging van de fluorescentie-intensiteit in de hersencoupes
voor 3kDa dextraanfluoresceïne. * = statistische significantie ten opzichte van de controle conditie (=100%) (---).
Het experiment werd 3 maal uitgevoerd (n=3).
RESULTATEN
34
3.3 Astrogliale activatie
Om na te gaan of de LPS injectie, naast een stijging van de BHB permeabiliteit, ook gepaard
gaat met de activatie van astrocyten, werd een immuunkleuring uitgevoerd tegen GFAP, een
merker voor astrogliose, de inflammatoire respons van astrocyten [43]. De GFAP expressie
was gestegen op alle tijdspunten, zowel 3, 6 als 24 uur na de injectie van LPS. Deze stijging
was beperkt op het 3h tijdspunt, het hoogst op het 6h tijdspunt en 24h na injectie weer gedaald,
doch op geen enkel tijdspunt significant (Figuur 12).
Figuur 12: Nagaan van LPS-geïnduceerde astrogliale activatie, door middel van immunohistochemie. Er
werd een immunohistochemische evaluatie uitgevoerd van de astrocytaire merker GFAP in cryosecties van
muizenhersenen. Links: montages van hersencoupes van FVB muizen die op verschillende tijdstippen behandeld
werden met LPS, waarop de FITC-afkomstige fluorescentie gecorreleerd is met de GFAP expressie. Rechts:
analyse van de relatieve GFAP expressie, ten opzichte van de controle conditie (=100%) (---), gebaseerd op
evaluatie van de fluorescentie-intensiteit ter hoogte van 20 punten in de corticale regio (10 in de linker- en 10 in
de rechterhemisfeer). Stijging van de GFAP-expressie was op geen enkel tijdspunt significant. Het experiment
werd 2 maal uitgevoerd (n=2).
Astrogliale activatie werd eveneens nagegaan in hersenlysaten van LPS-behandelde muizen,
door middel van western blot. De data komen in grote lijnen overeen met de data die werden
bekomen aan de hand van immunohistochemie: op het 3h tijdspunt is de GFAP expressie nog
niet gestegen ten opzichte van de controle conditie, maar 6h na LPS injectie wordt er wel een
stijging waargenomen. Op het 24h tijdspunt is de GFAP expressie weer gedaald (Figuur 13).
Figuur 13: Nagaan van LPS-geïnduceerde astrogliale activatie, door middel van western blot. De GFAP
expressie in hersenlysaten van FVB muizen, die op verschillende tijdstippen behandeld werden met LPS, werd
geanalyseerd door middel van western blot. Ten opzichte van de controle conditie (=100%) (---), was deze het
hoogst op het 6h tijdspunt en beperkt gestegen 24h na LPS injectie. β-Tubuline werd gebruikt als ladingscontrole.
Het experiment werd 1 maal uitgevoerd (n=1).
RESULTATEN
35
3.4 In vitro endotheliale activatie
Om na te gaan of LPS effectief leidt tot activatie van endotheelcellen, wordt de aanwezigheid
van een aantal inflammatoire merkers in een endotheelcellijn, behandeld met LPS (1µg/ml),
gecontroleerd. Een eerste inflammatoire merker is de translocatie van NF-κB van het cytosol
naar de nucleus, om daar te zorgen voor de transcriptie van bepaalde pro-inflammatoire genen
[51]. Dit werd nagegaan in een geïmmortaliseerde (b.End3) en primaire endotheelcelcultuur,
door middel van western blotting van de NF-κB p65 subunit, die in het cytosol geblokkeerd
wordt door een inhibitor van κB (IκB), maar bij activatie transloceert naar de nucleus, en
gefosforyleerd wordt om transcriptionele activiteit te promoten. In de b.End3 cellysaten werd
een significante stijging van vrije p-NF-κB p65 subunit gevonden op het 3h en 24h tijdspunt,
samen met een niet-significante daling 6h na toediening van LPS, terwijl er in de primaire
endotheelcellysaten op alle tijdspunten een zeer sterke stijging was van de vrije p-NF-κB p65
subunit, die echter op geen enkel tijdspunt statistisch significant was (Figuur 14).
Figuur 14: Immunodetectie van de p-NF-κB p65 subunit in endotheelcellysaten. Na het uitvoeren van een
western blot met twee endotheelcelculturen, werd de hoeveelheid p-NF-κB p65, ten opzichte van de controle
conditie (=100%) (---), op verschillende tijdspunten nagegaan. Voor p-NF-κB p65 was er een bandje zichtbaar
op 62kDa, terwijl de ladingscontrole, β-tubuline, een moleculaire massa van 49kDa heeft. De getallen in de bars
stellen het aantal experimenten (n) voor. Links: in de b.End3 cellysaten werd een significante stijging gevonden
op het 3h en 24h tijdspunt, en een niet-significante daling op het 6h tijdspunt. * = statistische significantie ten
opzichte van de controle conditie. Rechts: in de primaire endotheelcellysaten werd op alle tijdspunten een nietsignificante, doch sterke stijging van de vrije p-NF-κB p65 subunit gevonden.
Een tweede endotheliale, inflammatoire merker is de productie van MMP’s. Deze enzymen
leiden namelijk tot afbraak van de basale membraan, waardoor ze, tijdens neuroinflammatie,
de migratie van inflammatoire celtypes in het centrale zenuwstelsel zullen faciliteren. Om de
productie van MMP’s door endotheelcellen van de BHB in vitro na te gaan, werd er gebruik
gemaakt van cellysaten en geconditioneerd medium van LPS-behandelde b.End3 cellen, in
RESULTATEN
36
een gelatine zymografie experiment. In de cellysaten werd enkel een bandje bekomen op het
3h tijdspunt, rond 98 kDa, wat mogelijk overeenkomt met MMP-9, terwijl de gel met het
geconditioneerd medium dit bandje op alle tijdspunten vertoonde (Figuur 15).
Figuur 15: MMP detectie in een geïmmortaliseerde, cerebrale endotheelcelcultuur. Links: in de cellysaten
werd enkel op het 3h tijdspunt een bandje bekomen, ter hoogte van 98kDa. Dit bandje representeert mogelijk de
expressie van MMP-9, dat een moleculaire massa heeft van 92kDa. Rechts: Voor het geconditioneerd medium
werd er in alle slotjes een bandje gevonden ter hoogte van 98kDa.
3.5 De rol van connexine kanalen
3.5.1 Endotheliale connexine expressie
De rol van connexines in de inflammatoire, endothelio-gliale communicatie wordt in vitro
onderzocht door, via western blot, de expressie van endotheliale connexines (Cx37, Cx40 en
Cx43) in een geïmmortaliseerde (b.End3) en primaire endotheelcelcultuur op verschillende
tijdstippen na LPS (1µg/ml) incubatie na te gaan. De Cx43 expressie kende na 3 en 6 uur, in
beide celtypes, een beperkte stijging, terwijl er op het 24h tijdspunt een daling was in b.End3
cellysaten, tegenover een aanzienlijke stijging in de primaire endotheelcelcultuur (Figuur 16).
Figuur 16: Cx43 expressie in endotheliale celculturen. De Cx43 expressie werd, via western blot, nagegaan in
de lysaten van twee endotheelcelculturen, en wordt uitgedrukt als een percentage ten opzichte van de controle
conditie (=100%) (---). Voor Cx43 was er op de gel een bandje zichtbaar van 38kDa, terwijl de ladingscontrole,
β-tubuline, aanwezig was in een 49kDa bandje. De getallen in de bars stellen het aantal experimenten (n) voor.
Links: in de b.End3 lysaten werd een beperkte, niet-significante stijging van de Cx43 expressie gezien op het 3h
en 6h tijdspunt, terwijl de expressie, op een niet-significante wijze, onder het niveau van de controle daalde, 24h
na LPS incubatie. Rechts: in de primaire endotheelcellysaten werd een gelijkaardig patroon gezien voor het 3h
en 6h tijdspunt als bij de b.End3 cellysaten, terwijl er op het 24h tijdspunt een aanzienlijke stijging was.
RESULTATEN
37
De expressie van Cx40 en Cx37 in b.End3 endotheelcellysaten daalde op alle tijdspunten na
LPS incubatie, en dit eveneens op niet-significante wijze (Figuur 17).
Figuur 17: Cx40 en Cx37 expressie in b.End3 endotheelcelcultuur. De expressie van Cx40 en Cx37 werd, via
western blot, nagegaan in endotheliale b.End3 cellysaten, en wordt percentueel uitgedrukt ten opzichte van de
controle conditie (=100%) (---). β-Tubuline werd gebruikt als ladingscontrole. Links: de Cx40 expressie daalde,
op niet-significante wijze, op alle tijdspunten. De getallen in de bars stellen het aantal experimenten (n) voor.
Rechts: ook de Cx37 expressie kende op alle tijdspunten een daling in de LPS-behandelde b.End3 cellysaten. Dit
experiment werd 1 maal uitgevoerd (n=1).
3.5.2 Invloed van inhibitie van connexine kanalen op BHB permeabiliteit
Het belang van gap juncties en hemikanalen in inflammatoire, endothelio-gliale communicatie
werd in vivo onderzocht met behulp van de connexine mimetische peptiden Gap27 en Gap19.
Gap27 interageert met de extracellulaire domeinen van Cx37 en Cx43, en blokkeert zowel
gap juncties als hemikanalen, terwijl Gap19 selectief Cx43 hemikanalen inhibeert, op basis
van interactie met intracellulaire domeinen van Cx43 [45-47]. De peptiden werden in de
staartvene van FVB muizen geïnjecteerd (25mg/kg), waarna de muizen onmiddellijk daarna
een IP injectie kregen van LPS (25mg/kg) en 3, 6 of 24 uur later, na een IV injectie van
fluorescent-gelabelde kleurstoffen (3kDa dextraanfluoresceïne, 10kDa dextraan-Texas Red en
70kDa FITC-albumine), werden geëuthanaseerd. De hersenen werden vervolgens geïsoleerd,
er werden cryosecties gemaakt (50µm) en de fluorescentie-intensiteit voor de verschillende
probes werd bepaald en vergeleken met die van de controle conditie, waarbij 0,9% NaCl werd
geïnjecteerd in plaats van LPS. Door hetzelfde te doen met muizen die IV geïnjecteerd
werden met 0,9% NaCl in plaats van Gap27 of TAT-Gap19, kon er een beeld gegenereerd
worden van de bijdrage van signalisatie via gap juncties en/of hemikanalen in de regulatie van
de BHB permeabiliteit, en de inflammatoire endothelio-gliale communicatie in het algemeen.
Gap27 injectie zorgde voor een daling van de LPS-geïnduceerde BHB permeabiliteit, op elk
tijdspunt, voor elke kleurstof, door zowel gap juncties als hemikanalen te blokkeren. De enige
uitzondering hierop was de BHB permeabiliteit voor de 70kDa probe, 24h na LPS injectie, die
steeg onder invloed van Gap27. Het connexine mimetisch peptide slaagde er in om de BHB
permeabiliteit voor de verschillende fluorescente kleurstoffen, 3h en 6h na LPS injectie, tot
RESULTATEN
38
onder de controle conditie te doen dalen. Op het 24h tijdspunt slaagde Gap27 hier echter niet
meer in. Er werd enkel statistische significantie ten opzichte van de controle conditie bereikt
op de 6h en 24h tijdspunten, voor de 3kDa en 10kDa kleurstoffen, in muizen die geen Gap27
injectie kregen (Figuur 18).
Ook de selectieve Cx43 hemikanaal blokker TAT-Gap19 leidde tot een daling van de BHB
permeabiliteit voor de fluorescent-gelabelde probes, maar enkel 6h na de injectie van LPS. Op
de andere tijdspunten leidde de TAT-Gap19 injectie tot een stijging van de LPS-geïnduceerde
BHB disruptie. Statistische significantie ten opzichte van de controle conditie werd bereikt op
de 24h tijdspunten, 6h na de injectie van LPS in muizen die niet behandeld werden met TATGap19 en op het 3h tijdspunt voor de 3kDa probe, na TAT-Gap19 injectie (Figuur 18).
Figuur 18: Invloed van connexine mimetische peptiden op BHB permeabiliteit. Overzicht van de relatieve
fluorescentie-intensiteit voor fluorescent-gelabelde probes in hersencoupes van muizen die 3, 6 of 24h behandeld
werden met LPS, na IV injectie van een connexine mimetisch peptide (Gap27 of TAT-Gap19) of 0,9% NaCl.
* = statistische significantie ten opzichte van de controle conditie (=100%) (---). Boven: injectie van Gap27, net
voor LPS injectie, zorgde voor een daling van de fluorescentie-intensiteit, en dus de BHB permeabiliteit, op elk
tijdspunt, voor elke kleurstof, door zowel gap juncties als hemikanalen te blokkeren. De enige uitzondering
hierop was de BHB permeabiliteit voor de 70kDa probe, 24h na LPS injectie, die steeg onder invloed van Gap27.
Onder: Ook de selectieve Cx43 hemikanaal blokker TAT-Gap19 leidde tot een daling van de BHB permeabiliteit
voor de fluorescent-gelabelde probes, maar enkel 6h na de injectie van LPS. Op de andere tijdspunten leidde de
TAT-Gap19 injectie tot een stijging van de LPS-geïnduceerde BHB disruptie.
RESULTATEN
39
3.6 De rol van Ca2+-signalisatie
3.6.1 Inflammatoire, endotheliale en astrogliale Ca2+-signalisatie
De rol van Ca2+-signalisatie in inflammatoire, endothelio-gliale communicatie werd in vitro
onderzocht door visualisatie van zowel de endotheliale als de astrogliale Ca2+-signalisatie, na
incubatie van de celculturen in een inflammatoire stimulus (1µg/ml). Endotheliale b.End3
cellen werden geïncubeerd in LPS of TNFα, terwijl glioma C6Cx43 cellen in IL-1β, TNFα of
IFNγ werden geïncubeerd. De visualisatie gebeurde aan de hand van fluo3-AM, dat bindt aan
intracellulair Ca2+, en waarmee de cellen vooraf werden geladen. De cellen werden eerst
gedurende één minuut in HBSS-Hepes geïncubeerd, alvorens ze 10min geïncubeerd werden
met een inflammatoire stimulus. De Ca2+-signalisatie werd gevisualiseerd door elke seconde,
onder een omgekeerde fluorescentiemicroscoop, een beeld op te nemen van de fluorescentieintensiteit van fluo3, en vervolgens de intracellulaire Ca2+-concentratie van individuele cellen
te analyseren, door gebruik te maken van QuantEMframes sofware. Hieruit bleek dat zowel
geïmmortaliseerde endotheelcellen als astrocyten gebruik maken van Ca2+-signalisatie, tijdens
incubatie met een inflammatoire stimulus (Figuur 19).
Figuur 19: Inflammatoire, endotheliale en astrogliale Ca2+-signalisatie. Links: Voorbeeld van de LPS- en
TNFα-geïnduceerde intracellulaire Ca2+-concentratiewijzigingen in één enkele endotheliale b.End3 cel, waarbij
de pieken overeenkomen met een gestegen Ca2+-concentratie. Rechts: Voorbeeld van IL-1β-, TNFα- en IFNγgeïnduceerde intracellulaire Ca2+-concentratiewijzigingen in één enkele astrogliale C6Cx43 cel. Pieken komen
overeen met een stijging van de Ca2+-concentratie.
3.6.2 Invloed van intracellulaire Ca2+ chelator op BHB permeabiliteit
De rol van interastrogliale Ca2+-signalisatie in inflammatoire, endothelio-gliale communicatie
werd in vivo onderzocht door, na het uitvoeren van een craniotomie, BAPTA-AM (2mM) op
het hersenoppervlak van FVB muizen te incuberen. Deze Ca2+ chelator verhindert namelijk de
stijging van de astrocytaire Ca2+-concentratie, waardoor er geen gebruik gemaakt kan worden
van Ca2+-signalisatie tijdens inflammatoire, endothelio-gliale interacties. Het hersenoppervlak
werd eveneens geïncubeerd met sulforhodamine 101, opdat de locatie van de craniotomie
RESULTATEN
40
nadien eenvoudig zou kunnen teruggevonden worden. Een uur later werd de BAPTA-AM
weggespoeld, en werden de muizen IP geïnjecteerd met LPS (25mg/kg). De muizen werden
6h of 24h later IV geïnjecteerd met fluorescent gelabelde probes (3kDa dextraanfluoresceïne
en 10kDa dextraan-Texas Red), de hersenen werden geïsoleerd, en er werden cryosecties
(50µm) gemaakt van de hersenen. De fluorescentie-intensiteit voor de fluorescente probes
werd bepaald en vergeleken tussen de behandelde en de contralaterale hersenhelft, aangezien
BAPTA-AM niet naar de contralaterale hersenhelft bleek te diffunderen. De preparatie van
het craniaal venster leidt op zich niet tot een verhoogde BHB permeabiliteit. Extravasatie van
3kDa dextraanfluoresceïne in de behandelde hersenhelft is niet significant verschillend van
extravastie in de contralaterale zijde, zowel in controle omstandigheden als in aanwezigheid
van LPS (respectievelijk 100% ± 7% contralateraal en 84,4% ± 8,1% in de zone, en 100% ±
5,4% contralateraal en 112,5% ± 5% in de zone). Eveneens belangrijk om te vermelden is dat
de aanwezigheid van sulforhodamine 101 geen invloed heeft op de extravasatie van 3kDa
dextraanfluoresceïne, en dat deze zowel in aan- als afwezigheid van de probe significant
verhoogd is in aanwezigheid van LPS (respectievelijk 118% ± 3.3% en 123% ± 5.5%).
Inhibitie van de interastrocytaire Ca2+-signalisatie zorgde wel voor een gedaalde extravasatie
van de fluorescente probes, 6h en 24h na LPS injectie. Enkel de gedaalde extravasatie van
3kDa dextraanfluoresceïne op het 24h tijdspunt was statistisch niet significant (Figuur 20).
Figuur 20: Invloed van BAPTA-AM op de extravasatie van fluorescente kleurstoffen. Na craniotomie, werd
er BAPTA-AM (2mM) op het hersenoppervlak van de rechterhemisfeer gepipetteerd. Na een incubatie van 1 uur,
werden de muizen geïnjecteerd met LPS (25mg/kg) en werden de hersenen 6h of 24h later geïsoleerd, na injectie
van fluorescente kleurstoffen. De extravasatie van deze kleurstoffen was gedaald in de behandelde hersenhelft.
* = statistische significantie ten opzichte van de contralaterale hersenhelft (=100%) (---).
RESULTATEN
41
4. DISCUSSIE
4.1 Doel van het onderzoek
In een groot aantal pathologische omstandigheden treedt er modulatie op van verschillende
eigenschappen van de BHB, waaronder de paracellulaire permeabiliteit en de expressie en
activiteit van bepaalde transporters en enzymen [3-4,6]. Verschillende neuropathologieën,
zoals multiple sclerose, de ziekte van Alzheimer, epilepsie en verschillende hersentumoren,
gaan inderdaad gepaard met een verstoord functioneren van de BHB, meestal onder invloed
van modulerende endothelio-gliale interacties [4]. Een ander kenmerk dat deze neurale
aandoeningen vaak gemeenschappelijk hebben is dat het ontstaan en/of verloop ervan gepaard
gaat met inflammatie [30-33]. Hoe deze inflammatoire, endothelio-gliale communicatie ter
hoogte van de BHB precies verloopt, werd onderzocht aan de hand van een aantal in vivo
experimenten, waarbij gebruik werd gemaakt van FVB muizen, enerzijds, en door middel van
in vitro experimenten, waarbij zowel endotheliale als astrocytaire celculturen gebruikt werden,
anderzijds.
4.2 Inflammatie
4.2.1 Systemische inflammatie
In de FVB muizen werd systemische inflammatie geïnduceerd door middel van LPS, en ook
de gebruikte celculturen werden, voor het uitvoeren van de eigenlijke in vitro experimenten,
steeds behandeld met LPS. Dit endotoxine, afkomstig uit de buitenste membraan van gramnegatieve bacteriën, zorgt voor een sterke ‘innate’ of aangeboren immuunrespons [52-53].
Deze wordt geïnduceerd door de productie en vrijstelling van pro-inflammatoire cytokines
door LPS-gestimuleerde leukocyten, en leidt onder andere tot veranderingen in bloeddruk,
osmolariteit, zuurstofverbruik, pijngevoel, energiemetabolisme en bepaalde hormoonspiegels
[54]. In de in vivo experimenten werden externe ziektekarakteristieken geobserveerd bij de
LPS-behandelde muizen, die de geïnflammeerde toestand van het lichaam bevestigden. Deze
ziektekarakteristieken werden zichtbaar 3h na de injectie (verminderde mobiliteit), en werden
duidelijker naarmate het 24h tijdspunt naderde (diarree, etterende ogen en matte vacht). In de
bloedcirculatie bindt LPS aan LPS-bindend proteïne (LBP), dat het endotoxine transporteert
naar cellen die zowel CD14, TLR4 als MD2 expresseren. Deze eiwitten komen niet enkel tot
expressie op de celmembraan van leukocyten, maar worden ook geëxpresseerd door onder
andere epitheel-, endotheel- en gladde spiercellen. De interactie van LPS en LBP met TLR4,
CD14 en MD2 leidt tot de activatie van een aantal signaalcascades, die gebaseerd zijn op de
adaptoreiwitten TRAM/TRIF of MAL/MyD88 [52]. Deze signaalcascades zullen, via IκB
DISCUSSIE
42
fosforylatie, leiden tot activatie van de transcriptiefactor NF-κB, waardoor deze transloceert
van het cytosol naar de nucleus, en daar zorgt voor de transcriptie van pro-inflammatoire
cytokines, waaronder bepaalde interleukines en TNFα [54]. De TRAM/TRIF pathway zal, via
interferon regulatie factor 3 (IRF3), ook zorgen voor de productie van interferonen [52]. Niet
getoonde data van het lab van de promotor bevestigen de gestegen bloedserumconcentratie
van deze pro-inflammatoire cytokines. In het bloedplasma van de LPS-behandelde muizen
werd ook een gestegen MMP-2 en MMP-9 concentratie gedetecteerd, wat de inflammatoire
status van het lichaam verder bevestigt. Afbraak van de extracellulaire matrix is namelijk een
typisch inflammatoir proces. Tot op heden is men nog niet volledig zeker of de productie van
MMP’s als functie heeft de inflammatie te verergeren of deze juist tegen te gaan, laat staan
wat de exacte rol is van de meeste MMP’s in neuroinflammatoire omstandigheden. Naast
afbraak van de extracellulaire matrix, zijn deze proteïnasen immers ook betrokken bij onder
andere endotheliaal herstel, het doden van bacteriën en de modulatie van de activiteit van
bepaalde cytokines en chemokines [55].
4.2.2 Neuroinflammatie
Dat de injectie van LPS leidt tot neuroinflammatie wordt door een aantal van de bekomen
resultaten van dit onderzoek bevestigd. In vivo werd een stijging van de BHB permeabiliteit
gezien na LPS injectie, die zich manifesteerde als een in ernst toenemende BHB disruptie, in
functie van de tijd. BHB disruptie is een typisch inflammatoir verschijnsel in de hersenen [49].
Na western blotting van LPS-behandelde hersenlysaten werd een verhoogde extravasatie van
albumine gedetecteerd, wat de geobserveerde BHB disruptie verder bevestigt [50]. Ook de
astrocyten verkeerden in geïnflammeerde toestand, 6h en 24h na LPS injectie. Dit werd
aangetoond door middel van zowel een immunohistochemische kleuring, als immunodetectie
na western blotting voor GFAP. Deze merker voor astrogliale activatie kent inderdaad een
verhoogde expressie in LPS-behandeld hersenweefsel [42]. Op het 3h tijdspunt werd echter
nog geen astrogliose gedetecteerd, wat kan betekenen dat bij systemische inflammatie een
milde BHB opening anticipeert op astrogliose, welke vervolgens bijdraagt tot een sterkere
BHB dysfunctie. De LPS-geïnduceerde activatie van BHB endotheel of de influx van kleine
moleculen in het hersenweefsel die volgt op BHB disruptie kan dus een eerste aanleiding zijn
voor astrogliose. Deze neuroinflammatoire toestand van het centrale zenuwstelsel zou op
verschillende manieren tot stand kunnen worden gebracht. Zoals reeds eerder vermeld, leidt
de interactie van LPS met TLR4, CD14 en MD2 tot activatie van een aantal signaalcascades
die zorgen voor translocatie van NF-κB, dat instaat voor de transcriptie van een groot aantal
DISCUSSIE
43
pro-inflammatoire genen [52]. Of het endotheel van de BHB het benodigde receptorcomplex
bevat, en dus op directe wijze zou kunnen bijdragen tot de inductie van neuroinflammatie,
werd na western blotting nagegaan in endotheliale cellysaten, via immunodetectie voor de
geactiveerde vorm van NF-κB. Deze transcriptiefactor werd weldegelijk geactiveerd onder
invloed van LPS, wat een indicatie zou kunnen zijn dat het BHB endotheel zelf actief
bijdraagt tot de inductie van neuroinflammatie. Dat LPS in staat is het endotheel van de BHB
rechtstreeks te activeren werd ook bevestigd, via gelatine zymografie van LPS-behandelde
cerebrale endotheelcellysaten en geconditioneerd medium, aan de hand van een gestegen
MMP-9. Deze endotheliale MMP-9 productie leidt, via de afbraak van β-dystroglycaan, tot
degradatie van de basale membraan. Dit zorgt ervoor dat inflammatoire cellen gemakkelijker
in het centrale zenuwstelsel migreren tijdens neuroinflammatie [56]. Aangezien LPS in staat
is om het BHB endotheel rechtstreeks te activeren, en deze activatie gepaard gaat met de
productie van pro-inflammatoire cytokines, zou het cerebraal capillair endotheel op directe
wijze kunnen bijdragen tot de inductie van neuroinflammatie. In een in vivo experiment werd
gezien dat IV injectie van pro-inflammatoire cytokines met een gestegen serumconcentratie
na de injectie van LPS (IL-1β, IFNγ en TNFα) ook leidt tot significante disruptie van de BHB.
Dit geeft aan dat de activatie van het BHB endotheel, die neuroinflammatie vooraf gaat, ook
veroorzaakt kan worden door pro-inflammatoire cytokines, geproduceerd tijdens systemische
inflammatie. Zo werd tijdens in vitro metingen van de Ca2+-signalisatie vastgesteld dat zowel
LPS als TNFα in staat zijn om cerebrale endotheelcellen te activeren, wat gepaard gaat met
een stijging van de intracellulaire Ca2+-concentratie. Bovendien geven pro-inflammatoire
cytokines die in vivo geproduceerd worden door het BHB endotheel ook aanleiding tot Ca2+signalisatie in gliale cellen. Een andere mogelijkheid is dat pro-inflammatoire cytokines en
LPS het hersenweefsel bereiken vanuit de bloedcirculatie via de circumventriculaire organen
(CVO’s). Deze structuren hebben namelijk een onvolledige BHB. Neuroinflammatie kan dan
bekomen worden via LPS signalisatie en transcriptie van pro-inflammatoire cytokines, eerst
in de CVO’s en vervolgens in het hersenparenchym. De inductie van neuroinflammatie in de
CVO’s is voornamelijk gebaseerd op LPS-gestimuleerde microglia, die de geïnflammeerde
zone uitbreiden via autocriene en paracriene TNFα signalisatie [53]. Er is echter ook evidentie
dat andere celtypes van de NVE, zoals astrocyten, neuronen en pericyten, een belangrijke rol
kunnen spelen in het ontstaan van inflammatie in het centrale zenuwstelsel [57-59]. Van zodra
de neuroinflammatoire signalisatie leidt tot BHB disruptie, kunnen LPS en pro-inflammatoire
cytokines uit de bloedcirculatie passief in het hersenweefsel diffunderen, en deelnemen aan
het inflammatoire proces. Deze LPS signalisatie gaat gepaard met een stijging van de CD14
DISCUSSIE
44
expressie, maar een daling van de expressie van TLR4 in het hersenparenchym. Hierdoor is
LPS niet langer in staat reeds eerder geactiveerde cellen opnieuw te activeren, waardoor er
LPS tolerantie wordt opgebouwd in het hersenweefsel [53]. LPS zal dus voornamelijk zorgen
voor de inductie van de cerebrale ‘innate’ immuunrespons, terwijl het verdere verloop van de
neuroinflammatoire signalisatie eerder gebaseerd zal zijn op pro-inflammatoire cytokines.
4.3 Inflammatoire, endothelio-gliale interacties
4.3.1 De rol van connexine kanalen
Connexines zijn eiwitten waarvan er 21 weefselspecifieke isovormen bestaan, en waarvan de
naam overeenkomt met de moleculaire massa van het eiwit. Zo heeft Cx43 bijvoorbeeld een
moleculaire massa van 43kDa. Deze eiwitten vormen gap juncties, die ontstaan via verbinding
van twee connexonen of hemikanalen, die op hun beurt zijn opgebouwd uit zes connexineeiwitten. Op deze manier wordt een rechtstreekse verbinding gemaakt tussen het cytoplasma
van twee naburige cellen, wat efficiënte communicatie tussen deze cellen mogelijk maakt.
Wanneer hemikanalen geen deel uitmaken van gap juncties, vormen ze een strikt gereguleerde
verbinding tussen het cytosol en de extracellulaire ruimte, die door verschillende factoren
geopend kan worden. Hierdoor zouden ze een rol kunnen hebben in autocriene en paracriene
signalisatie [60-61]. Zowel gap juncties als hemikanalen zouden dus een regulerende rol
kunnen spelen in de inflammatoire endothelio-gliale communicatie. Door middel van western
blotting werd in vitro de expressie van de endotheliale connexines (Cx37, Cx40 en Cx43) in
LPS-behandelde cerebrale endotheelcellen nagegaan. De expressie van Cx37 en Cx40 daalde
onder invloed van LPS, terwijl de Cx43 expressie toenam, en in de primaire endotheelcellen
zelfs aanzienlijk gestegen was, 24 uur na toediening van LPS. Dat de connexine kanalen een
rol spelen in inflammatoire, endothelio-gliale interacties, werd bevestigd via in vivo analyse
van de BHB permeabiliteit, na de injectie van LPS en connexine mimetische peptiden. Het
blokkeren van Cx43 hemikanalen, met behulp van Gap19, had zowel op het 3h als het 24h
tijdspunt geen invloed op de LPS-geïnduceerde stijging van de BHB permeabiliteit. Op het 6h
tijdspunt zorgde Gap19 injectie wel voor inhibitie van de LPS-geïnduceerde BHB disruptie,
waaruit blijkt dat Cx43 hemikanalen in een bepaald tijdsvenster toch een rol kunnen spelen in
inflammatoire, endothelio-gliale communicatie. Zowel endotheelcellen als astrocyten stellen
een groot aantal modulerende agentia die kunnen leiden tot een gestegen BHB permeabiliteit
vrij [3-4]. Verschillende van deze agentia worden vrijgesteld door middel van hemikanalen,
waaronder ATP en glutamaat [61-62]. Purinerge signalisatie leidt onder andere tot activatie
van fosfolipase C en productie van IP3, wat leidt tot Ca2+-vrijstelling uit het endoplasmatisch
DISCUSSIE
45
reticulum [61]. Zowel het endotheel van de BHB als de perivasculaire astrocyten zouden in
inflammatoire omstandigheden gebruik kunnen maken van autocriene en/of paracriene ATP
signalisatie, aangezien beide celtypes hemikanalen hebben, ATP vrijstellen en purinerge ATP
receptoren bevatten [4,37]. We merken eveneens op dat het tijdspunt waarop Gap19 BHB
permeabiliteitswijzigingen tegengaat correleert met de inductie van astrogliose, maar verdere
studies zijn nodig om Cx43 hemikanaal activiteit in endotheel en/of astrocyten te linken aan
de activatie van astrocyten. Dat gap juncties eveneens betrokken zijn bij de endothelio-gliale
communicatie, en meer bepaald de regulatie van de BHB permeabiliteit, in inflammatoire
omstandigheden, blijkt uit het feit dat Gap27, in tegenstelling tot Gap19, wel in staat was om
BHB disruptie, 3h en 6h na de injectie van LPS, te inhiberen, en de BHB permeabiliteit op het
24h tijdspunt te verlagen. Aangezien de Cx43 hemikanalen op de 3h en 24h tijdspunten niet
lijken bij te dragen tot de disruptie van de BHB, moet de gedaalde BHB permeabiliteit, onder
invloed van Gap27, te wijten zijn aan een blokkade van Cx37 hemikanalen en/of gap juncties
opgebouwd uit Cx37 en Cx43. De gap juncties zorgen in neuroinflammatoire omstandigheden
waarschijnlijk voornamelijk voor de bidirectionele propagatie van intercellulaire Ca2+-golven
in zowel het BHB endotheel als in de perivasculaire astrocyten. Dit gebeurt door middel van
gap junctionele diffusie van IP3 [60-61].
4.3.2 De rol van Ca2+-signalisatie
In vitro stimulatie van een endotheliale en een glioma cellijn met LPS en pro-inflammatoire
cytokines leidde in dit onderzoek steeds tot een gestegen intracellulaire Ca2+-concentratie. Dit
geeft aan dat de inflammatoire, endothelio-gliale communicatie voor een deel gebaseerd kan
zijn op Ca2+-signalisatie, wat in vivo bevestigd werd aan de hand van een daling van de LPSgeïnduceerde BHB permeabiliteit in de hersenhelft die, na craniotomie, blootgesteld werd aan
BAPTA-AM. Deze Ca2+-chelator zorgde ervoor dat astrocyten geen gebruik konden maken
van Ca2+-signalisatie tijdens de inflammatoire, endothelio-gliale interacties. Interactie van een
aantal inflammatoire mediatoren met hun overeenkomstige receptor op de plasmamembraan
van BHB endotheel of perivasculaire astrocyten, leidt tot een stijging van de intracellulaire
Ca2+-concentratie. Dit leidt onder andere tot opening van de hemikanalen, dat enerzijds kan
bijdragen aan een Ca2+-geïnduceerde toename van de Ca2+-concentratie, en anderzijds zorgt
voor de vrijstelling van een aantal modulerende agentia, waaronder ATP en glutamaat [61].
De verspreiding van dit Ca2+-signaal gebeurt enerzijds via gap junctionele diffusie van IP3,
dat in de naburige cel Ca2+ vrijstelling uit het endoplasmatisch reticulum zal veroorzaken, en
anderzijds paracriene ATP signalisatie. Aangezien het cytoplasma van het BHB endotheel en
DISCUSSIE
46
naburige perivasculaire astrocyten niet met elkaar verbonden is door middel van gap juncties,
dient de endothelio-gliale Ca2+-signalisatie op een paracriene wijze te verlopen. Vrijstelling
van ATP uit astrocyten kan zowel via hemikanalen als vesikels gebeuren. ATP interageert
met purinerge receptoren op de plasmamembraan van naburige cellen, waaronder dus ook
endotheelcellen van de BHB, wat aanleiding geeft tot een stijging van de intracellulaire Ca2+concentratie in deze endotheelcellen, die gelinkt is aan een verstoring van de BHB [45,63-64].
Verdere studies zullen moeten aantonen welke boodschappermolecule verantwoordelijk is
voor de communicatie tussen astrocyten en BHB endotheel.
4.4 Conclusie/Toekomstperspectieven
Het doel van dit onderzoek was een beter beeld te creëren van de endothelio-gliale interacties
die optreden in inflammatoire omstandigheden. LPS veroorzaakt een ‘innate’ immuunrespons
in het hersenweefsel, die gepaard gaat met productie van pro-inflammatoire cytokines. Deze
inflammatoire mediatoren zorgen voor een activatie van het BHB endotheel, een stijging van
de BHB permeabiliteit en activatie van perivasculaire astrocyten. Deze activatie gaat gepaard
met een gestegen intracellulaire Ca2+-concentratie, die zal leiden tot de vrijstelling van een
aantal modulerende agentia. De propagatie van interendotheliale, interastrocytaire en mogelijk
ook endothelio-gliale Ca2+-golven gebeurt door middel van connexine kanalen. Enerzijds
zorgen gap juncties voor de intercellulaire diffusie van IP3, en anderzijds zullen geopende
hemikanalen paracriene ATP signalisatie mogelijk maken. Beide signalisatiewegen leiden tot
een stijging van de intracellulaire Ca2+-concentratie van naburige cellen, wat zorgt voor
verdere uitbreiding van de neuroinflammatoire toestand. Dit onderzoek toonde aan dat het
verloop van de LPS-geïnduceerde neuroinflammatie inderdaad afhankelijk is van bepaalde
endothelio-gliale interacties. De resultaten waren echter niet altijd even eenduidig, en soms
voor interpretatie vatbaar. Bijkomend onderzoek is bijgevolg noodzakelijk om de getrokken
conclusies te kunnen valideren. Het verloop van neuroinflammatie is bovendien een uiterst
complex gebeuren, waaraan veel verschillende celtypes deelnemen. Daarom dient ook de rol
van andere celtypes van de NVE, zoals pericyten en microglia, in neuroinflammatie verder te
worden bestudeerd, opdat de bekomen resultaten in een iets bredere context zouden kunnen
worden geplaatst.
DISCUSSIE
47
REFERENTIES
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
de Vries HE, Kuiper J, de Boer AG, Van Berkel TJ, Breimer DD (1997). The blood-brain barrier in
neuroinflammatory diseases. Pharmacological Reviews 49(2):143-155.
Hawkins BT, Davis TP (2005). The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease.
Pharmacological Reviews 57(2):173-185.
Abbott NJ (2002). Astrocyte-endothelial interactions and blood-brain barrier permeability. Journal of
Anatomy 200(6):629-638.
Abbott NJ, Rönnbäck L, Hansson E (2006). Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.
Nature Reviews Neuroscience 7(1):41–53.
Butt AM, Jones HC, Abbott NJ (1990). Electrical resistance across the blood-brain barrier in anaesthetized
rats: a developmental study. The Journal of Physiology 429:47-62.
Abbott NJ, Patabendige AA, Dolman DE, Yusof SR, Begley DJ (2010). Structure and function of the bloodbrain barrier. Neurobiology of disease 37(1):13-25.
Schinkel AH (1999). P-Glycoprotein, a gatekeeper in the blood-brain barrier. Advanced Drug Delivery
Reviews 36(2-3):179-194.
O'Kane RL, Hawkins RA (2003). Na+-dependent transport of large neutral amino acids occurs at the
abluminal membrane of the blood-brain barrier. American Journal of Physiology - Endocrinology and
Metabolism 285(6):E1167-E1173.
Dyrna F, Hanske S, Krueger M, Bechmann I (2013). The blood-brain barrier. Journal of Neuroimmune
Pharmacology 8(4):763-773.
Wolburg H, Lippoldt A (2002). Tight junctions of the blood-brain barrier: development, composition and
regulation. Vascular Pharmacology 38(6):323-337.
Rao R (2009). Occludin phosphorylation in regulation of epithelial tight junctions. Annals of the New York
Academy of Sciences 1165:62-68.
Saitou M, Furuse M, Sasaki H, Schulzke JD, Fromm M, Takano H, Noda T, Tsukita S (2000). Complex
phenotype of mice lacking occludin, a component of tight junction strands. Molecular Biology of the Cell
11(12):4131-4142.
Ballabh P, Braun A, Nedergaard M (2004). The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and
clinical implications. Neurobiology of Disease 16(1):1-13.
Bernacki J, Dobrowolska A, Nierwińska K, Małecki A (2008). Physiology and pharmacological role of the
blood-brain barrier. Pharmacological Reports 60(5):600-622.
Ebnet K, Suzuki A, Ohno S, Vestweber D (2004). Junctional adhesion molecules (JAMs): more molecules
with dual functions? Journal of Cell Science 117(Pt 1):19-29.
Liu WY, Wang ZB, Zhang LC, Wei X, Li L (2012). Tight junction in blood-brain barrier: an overview of
structure, regulation, and regulator substances. CNS Neuroscience & Therapeutics 18(8):609-615.
Taddei A, Giampietro C, Conti A, Orsenigo F, Breviario F, Pirazzoli V, Potente M, Daly C, Dimmeler S,
Dejana E (2008). Endothelial adherens junctions control tight junctions by VE-cadherin-mediated
upregulation of claudin-5. Nature Cell Biology 10(8):923-934.
Wong AD, Ye M, Levy AF, Rothstein JD, Bergles DE, Searson PC (2013). The blood-brain barrier: an
engineering perspective. Frontiers in Neuroengineering 6:7.
Hori S, Ohtsuki S, Hosoya K, Nakashima E, Terasaki T (2004). A pericyte-derived angiopoietin-1
multimeric complex induces occludin gene expression in brain capillary endothelial cells through Tie-2
activation in vitro. Journal of Neurochemistry 89(2):503-513.
Tilling T, Korte D, Hoheisel D, Galla HJ (1998). Basement membrane proteins influence brain capillary
endothelial barrier function in vitro. Journal of Neurochemistry 71(3):1151-1157.
Saunders NR, Knott GW, Dziegielewska KM (2000). Barriers in the immature brain. Cellular and
Molecular Neurobiology 20(1):29-40.
Daneman R, Zhou L, Kebede AA, Barres BA (2010). Pericytes are required for blood-brain barrier integrity
during embryogenesis. Nature 468(7323):562-566.
Abbott NJ (2005). Dynamics of CNS barriers: evolution, differentiation and modulation. Cellular and
Molecular Neurobiology 25(1):5-23.
Abbott NJ (2000). Inflammatory mediators and modulation of blood-brain barrier permeability. Cellular and
Molecular Neurobiology 20(2):131-147.
Huber JD, Egleton RD, Davis TP (2001). Molecular physiology and pathophysiology of tight junctions in
the blood-brain barrier. Trends in Neurosciences 24(12):719-725.
Brown RC, Davis TP (2002). Calcium modulation of adherens and tight junction function: a potential
mechanism for blood-brain barrier disruption after stroke. Stroke 33(6):1706-1711.
Hopkins AM, Li D, Mrsny RJ, Walsh SV, Nusrat A (2000). Modulation of tight junction function by G
protein-coupled events. Advanced Drug Delivery Reviews 41(3):329-340.
REFERENTIES
48
28. Mann GE, Yudilevich DL, Sobrevia L (2003). Regulation of amino acid and glucose transporters in
endothelial and smooth muscle cells. Physiological Reviews 83(1):183-252.
29. Leybaert L (2005). Neurobarrier coupling in the brain: a partner of neurovascular and neurometabolic
coupling? Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism 25(1):2-16.
30. Akiyama H, Barger S, Barnum S, Bradt B, Bauer J, Cole GM, Cooper NR, Eikelenboom P, Emmerling M,
Fiebich BL, Finch CE, Frautschy S, Griffin WS, Hampel H, Hull M, Landreth G, Lue L, Mrak R,
Mackenzie IR, McGeer PL, O'Banion MK, Pachter J, Pasinetti G, Plata-Salaman C, Rogers J, Rydel R, Shen
Y, Streit W, Strohmeyer R, Tooyoma I, Van Muiswinkel FL, Veerhuis R, Walker D, Webster S,
Wegrzyniak B, Wenk G, Wyss-Coray T (2000). Inflammation and Alzheimer's disease. Neurobiology of
Aging 21(3):383-421.
31. Aggarwal BB, Shishodia S, Sandur SK, Pandey MK, Sethi G (2006). Inflammation and cancer: how hot is
the link? Biochemical Pharmacology 72(11):1605-1621.
32. Walker L, Sills GJ (2012). Inflammation and epilepsy: the foundations for a new therapeutic approach in
epilepsy? Epilepsy Currents 12(1):8-12.
33. Frischer JM, Bramow S, Dal-Bianco A, Lucchinetti CF, Rauschka H, Schmidbauer M, Laursen H, Sorensen
PS, Lassmann H (2009). The relation between inflammation and neurodegeneration in multiple sclerosis
brains. Brain 132(Pt 5):1175-1189.
34. Minagar A, Shapshak P, Fujimura R, Ownby R, Heyes M, Eisdorfer C (2002). The role of
macrophage/microglia and astrocytes in the pathogenesis of three neurologic disorders: HIV-associated
dementia, Alzheimer disease, and multiple sclerosis. Journal of the Neurological Sciences 202(1-2):13-23.
35. Pasti L, Volterra A, Pozzan T, Carmignoto G (1997). Intracellular calcium oscillations in astrocytes: a
highly plastic, bidirectional form of communication between neurons and astrocytes in situ. The Journal of
Neuroscience 17(20):7817-7830.
36. Sneyd J, Charles AC, Sanderson MJ (1994). A model for the propagation of intercellular calcium waves.
The American Journal of Physiology 266(1 Pt 1):C293-C302.
37. Cotrina ML, Lin JH, Alves-Rodrigues A, Liu S, Li J, Azmi-Ghadimi H, Kang J, Naus CC, Nedergaard M
(1998). Connexins regulate calcium signaling by controlling ATP release. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America 95(26):15735-15740.
38. Stamatovic SM, Keep RF, Andjelkovic AV (2008). Brain endothelial cell-cell junctions: how to "open" the
blood brain barrier. Current Neuropharmacology 6(3):179-192.
39. Qin L, Wu X, Block ML, Liu Y, Breese GR, Hong JS, Knapp DJ, Crews FT (2007). Systemic LPS causes
chronic neuroinflammation and progressive neurodegeneration. Glia 55(5):453-462.
40. Singh AK, Jiang Y (2004). How does peripheral lipopolysaccharide induce gene expression in the brain of
rats? Toxicology 201(1-3):197-207.
41. Wilson AC, Clemente L, Liu T, Bowen RL, Meethal SV, Atwood CS (2008). Reproductive hormones
regulate the selective permeability of the blood-brain barrier. Biochimica et Biophysica Acta 1782(6):401407.
42. Radu M, Chernoff J (2013). An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized
Experiments (73):e50062.
43. Brahmachari S, Fung YK, Pahan K (2006). Induction of glial fibrillary acidic protein expression in
astrocytes by nitric oxide. The Journal of Neuroscience 26(18):4930-4939.
44. Evans WH, De Vuyst E, Leybaert L (2006). The gap junction cellular internet: connexin hemichannels enter
the signalling limelight. The Biochemical Journal 397(1):1-14.
45. De Bock M, Culot M, Wang N, Bol M, Decrock E, De Vuyst E, da Costa A, Dauwe I, Vinken M, Simon
AM, Rogiers V, De Ley G, Evans WH, Bultynck G, Dupont G, Cecchelli R, Leybaert L (2011). Connexin
channels provide a target to manipulate brain endothelial calcium dynamics and blood-brain barrier
permeability. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism 31(9):1942-1957.
46. Wang N, De Bock M, Antoons G, Gadicherla AK, Bol M, Decrock E, Evans WH, Sipido KR, Bukauskas
FF, Leybaert L (2012). Connexin mimetic peptides inhibit Cx43 hemichannel opening triggered by voltage
and intracellular Ca2+ elevation. Basic Research in Cardiology 107(6):304.
47. Wang N, De Vuyst E, Ponsaerts R, Boengler K, Palacios-Prado N, Wauman J, Lai CP, De Bock M, Decrock
E, Bol M, Vinken M, Rogiers V, Tavernier J, Evans WH, Naus CC, Bukauskas FF, Sipido KR, Heusch G,
Schulz R, Bultynck G, Leybaert L (2013). Selective inhibition of Cx43 hemichannels by Gap19 and its
impact on myocardial ischemia/reperfusion injury. Basic Research in Cardiology 108(1):309.
48. Wang Z, Tymianski M, Jones OT, Nedergaard M (1997). Impact of cytoplasmic calcium buffering on the
spatial and temporal characteristics of intercellular calcium signals in astrocytes. The Journal of
Neuroscience 17(19):7359-7371.
49. Webb AA, Muir GD (2000). The blood-brain barrier and its role in inflammation. Journal of Veterinary
Internal Medicine 14(4):399-411.
REFERENTIES
49
50. Friedman A, Kaufer D, Heinemann U (2009). Blood-brain barrier breakdown-inducing astrocytic
transformation: novel targets for the prevention of epilepsy. Epilepsy Research 85(2-3):142-149.
51. Stanimirovic D, Satoh K (2000). Inflammatory mediators of cerebral endothelium: a role in ischemic brain
inflammation. Brain Pathology 10(1):113-126.
52. Bryant CE, Spring DR, Gangloff M, Gay NJ (2010). The molecular basis of the host response to
lipopolysaccharide. Nature Reviews Microbiology 8(1):8-14.
53. Laflamme N, Rivest S (2001). Toll-like receptor 4: the missing link of the cerebral innate immune response
triggered by circulating gram-negative bacterial cell wall components. FASEB Journal 15(1):155-163.
54. Lacroix S1, Feinstein D, Rivest S (1998). The bacterial endotoxin lipopolysaccharide has the ability to target
the brain in upregulating its membrane CD14 receptor within specific cellular populations. Brain Pathology
8(4):625-640.
55. Parks WC, Wilson CL, López-Boado YS (2004). Matrix metalloproteinases as modulators of inflammation
and innate immunity. Nature Reviews Immunology 4(8):617-629.
56. Agrawal S, Anderson P, Durbeej M, van Rooijen N, Ivars F, Opdenakker G, Sorokin LM (2006).
Dystroglycan is selectively cleaved at the parenchymal basement membrane at sites of leukocyte
extravasation in experimental autoimmune encephalomyelitis. The Journal of Experimental Medicine
203(4):1007-10019.
57. Gorina R, Font-Nieves M, Márquez-Kisinousky L, Santalucia T, Planas AM (2011). Astrocyte TLR4
activation induces a proinflammatory environment through the interplay between MyD88-dependent NFκB
signaling, MAPK, and Jak1/Stat1 pathways. Glia 59(2):242-255.
58. Leow-Dyke S, Allen C, Denes A, Nilsson O, Maysami S, Bowie AG, Rothwell NJ, Pinteaux E (2012).
Neuronal Toll-like receptor 4 signaling induces brain endothelial activation and neutrophil transmigration in
vitro. Journal of Neuroinflammation 9:230.
59. Guijarro-Muñoz I, Compte M, Álvarez-Cienfuegos A, Álvarez-Vallina L, Sanz L (2014).
Lipopolysaccharide activates Toll-like receptor 4 (TLR4)-mediated NF-κB signaling pathway and
proinflammatory response in human pericytes. The Journal of Biological Chemistry 289(4):2457-2468.
60. Orellana JA, Sáez PJ, Shoji KF, Schalper KA, Palacios-Prado N, Velarde V, Giaume C, Bennett MV, Sáez
JC (2009). Modulation of brain hemichannels and gap junction channels by pro-inflammatory agents and
their possible role in neurodegeneration. Antioxidants & Redox Signaling 11(2):369-399.
61. De Bock M, Vandenbroucke RE, Decrock E, Culot M, Cecchelli R, Leybaert L (2014). A new angle on
blood-CNS interfaces: A role for connexins? FEBS Letters 588(8):1259-1270.
62. Chandrasekhar A, Bera AK (2012). Hemichannels: permeants and their effect on development, physiology
and death. Cell Biochemistry and Function 30(2):89-100.
63. Braet K, Cabooter L, Paemeleire K, Leybaert L (2004). Calcium signal communication in the central
nervous system. Biology of the Cell 96(1):79-91.
64. Leybaert L, Cabooter L, Braet K (2004). Calcium signal communication between glial and vascular brain
cells. Acta Neurologica Belgica 104(2):51-56.
REFERENTIES
50
ADDENDUM
Tabel 2: Samenstelling van HBSS-Hepes.
CaCl2.2H2O
MgSO4.7H2O
NaCl
Na2HPO4.2H2O
KCl
KH2PO4
D-glucose
Hepes
Gedestilleerd water (dH2O)
0,95mM
0,81mM
137mM
0,18mM
5,36mM
0,44mM
5,55mM
25mM
VWR International
VWR International
VWR International
VWR International
Merck
Merck
VWR International
Sigma-Aldrich
Tabel 3: Samenstelling van PBS.
5% 2,0M fosfaatbuffer (pH 7,4)
- 190ml monobasische oplossing: 24g/l NaH2PO4 (AppliChem GmbH) in dH2O
- 810ml dibasische oplossing: 28,4g/l Na2HPO4 (VWR International) in dH2O
- Indien pH > 7,4: extra monobasische oplossing toevoegen
- Indien pH < 7,4: extra dibasische oplossing toevoegen
95% dH2O
9g/l NaCl (VWR International)
Tabel 4: Samenstelling van aCSF.
NaCl
KCl
NaH2PO4.H2O
MgCl2.6H2O
CaCl2.2H2O
D-Glucose
NaHCO3
Hepes
dH2O
126mM
2,5mM
1,25mM
2mM
1mM
10mM
26mM
25mM
VWR International
Merck
AppliChem GmbH
Vel
VWR International
VWR International
Sigma-Aldrich
Sigma-Aldrich
Tabel 5: Samenstelling van de gebruikte celmedia.
bEnd.3 medium:
450ml ‘Dulbecco's Modified Eagle Medium’ (DMEM)
50ml ‘Fetal Bovine Serum’ (FBS)
5ml Natriumpyruvaat
C6Cx43 medium:
450ml DMEM
225ml Ham’s F10
100ml FBS
10ml Penicilline-Streptomycine-Glutamine
10ml Fungizone
10ml Natriumpyruvaat
Gibco®, Life Technologies™
Gibco®, Life Technologies™
Gibco®, Life Technologies™
Gibco®, Life Technologies™
Gibco®, Life Technologies™
Gibco®, Life Technologies™
Gibco®, Life Technologies™
Gibco®, Life Technologies™
Gibco®, Life Technologies™
Tabel 6: Buffers, oplossingen en coating, gebruikt bij het opstarten van een primaire, capillaire
endotheelcelcultuur.
Washing Buffer A (WBA):
- 500ml HBSS (Sigma-Aldrich)
- 5,05ml Hepes (1M stockoplossing; Sigma-Aldrich)
Washing Buffer B (WBB):
- 6,67ml van de WBA vervangen door 6,67ml 7,5% ‘Bovine Serum Albumin’ (BSA; Sigma-Aldrich)
30% dextraan oplossing:
- 90g dextraan (Sigma-Aldrich) oplossen in 300ml WBA
- 30min autoclaveren bij 110ºC
- Afkoelen bij kamertemperatuur en bewaren bij 4ºC
- 1 dag voor het experiment: 0,1% BSA (1,3ml/100ml) toevoegen, en schudden om dextraan oplossing te coaten
TLCK (Tosyl Lysin Chloromethyl Ketone) oplossing:
- 16mg TLCK (Sigma-Aldrich) oplossen in 10,88ml WBA
- Filteren doorheen een 0,22 spuitfilter
- 10x verdunnen door 1ml van de oplossing toe te voegen aan 9ml WBA, en bewaren bij -4ºC
DNase I oplossing:
- 100mg DNase I (Roche) oplossen in 10ml dH2O
- 300µl aliquots maken, en bewaren bij -20ºC
Collagenase dispase oplossing:
- 100mg Collagenase dispase (Roche) toevoegen aan 1ml dH 2O
- 10x verdunnen door op te lossen in 9ml PBS
- Filteren doorheen een 0,22 spuitfilter
- 300µl aliquots maken, en bewaren bij -20ºC
Enzymoplossing:
- 3µl TLCK oplossing
- 3µl DNase I oplossing
- 2,7ml WBB
- Opwarmen bij 37ºC
- 300µl Collagenase dispase oplossing
Glutamine oplossing (200mM):
- 1,46g glutamine (Merck) oplossen in 50ml voorverwarmd dH 2O
- Opwarmen in warmwaterbad, bij 37ºC, tot glutamine volledig is opgelost
- Steriliseren door oplossing doorheen 0,22µm membraan te filteren
- 5ml aliquots maken, en bewaren in steriele polypropyleen tubes, bij -20ºC
Celmedium:
- 20% ‘Newborn Calf Serum’ (Sigma-Aldrich)
- 1% glutamine oplossing (200mM)
- 0,5% gentamycine (10mg/ml; Biochrom AG)
- 1% vitamines (100x; Sigma-Aldrich)
- 2% aminozuren (50x Sigma-Aldrich)
- Oplossen in DMEM (met laag glucosegehalte; Sigma-Aldrich) met 2g/l natriumbicarbonaat (Biochrom AG)
- Het celmedium kan gedurende 1 week bewaard worden bij 4ºC
Coating van de petrischaaltjes:
- Ontdooien van matrigel stockoplossing (BD Biocoat) op ijs
- Een 1/48 oplossing maken, door de matrigel op te lossen in DMEM
- De petrischaaltjes coaten met 500µl van de 1/48 matrigel oplossing
- De petrischaaltjes minstens 1h bij kamertemperatuur bewaren
- Voorzichtig spoelen met op kamertemperatuur gebrachte DMEM
- Celmedium toevoegen
bFGF (200ng/ml stockoplossing):
- 7,5% BSA 15x verdunnen in koude DMEM
- 25µg bFGF (Sigma-Aldrich) toevoegen aan 1,25µl DMEM met 0,5% BSA
- 1ml van deze 20µg/ml oplossing toevoegen aan 99ml DMEM met 0,5% BSA
- Steriliseren door oplossing doorheen 0,22µl membraan te filteren
- 1ml aliquots maken, en bewaren in steriele tubes, bij -20ºC
Tabel 7: Samenstelling van PBSD+.
CaCl2.2H2O
MgSO4.7H2O
NaCl
Na2HPO4.2H2O
KCl
KH2PO4
dH2O
0,9mM
0,334mM
137mM
6,46mM
2,68mM
1,47mM
VWR International
VWR International
VWR International
VWR International
Merck
Merck
Tabel 8: Samenstelling van Laemmli en RIPA buffer.
Laemmli buffer:
Tris (pH 6,8)
125mM
Sigma-Aldrich
Glycerol
10%
Sigma-Aldrich
SDS
2,3%
Sigma-Aldrich
+ 10µl/ml fosfatase inhibitor cocktail 2 (Sigma-Aldrich)
+ 10µl/ml fosfatase inhibitor cocktail 3 (Sigma-Aldrich)
+ 10µl/ml protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich)
+ 20µl/ml mini-EDTA free protease tablet (Roche), opgelost in 1,5ml dH 2O
RIPA buffer:
Tris (pH 8,2)
25mM
Sigma-Aldrich
NaCl
50mM
VWR International
NP40
0,5%
Sigma-Aldrich
Deoxycholaat
0,5%
Sigma-Aldrich
SDS
0,1%
Sigma-Aldrich
+ 0,055g/ml β-glycerolfosfaat (Sigma-Aldrich)
+ 10µl/ml fosfatase inhibitor cocktail 2 (Sigma-Aldrich)
+ 10µl/ml fosfatase inhibitor cocktail 3 (Sigma-Aldrich)
+ 10µl/ml protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich)
+ 1µl/ml DTT (1M; Sigma-Aldrich)
+ 20µl/ml mini-EDTA free protease tablet (Roche), opgelost in 1,5ml dH2O
Tabel 9: Samenstelling van 1l blokbuffer.
- 100ml Tris buffered saline (TBS; 10x), bestaande uit:
- 50mM Tris (Sigma-Aldrich)
- 150mM NaCl (VWR International)
- 900ml dH2O
Albumine:
+ 10g caseïne (1%; Sigma-Aldrich) 1ml Tween20 (0,1%; Sigma-Aldrich)
Cx37:
+ 25g melkpoeder (2,5%; Nestlé)
0,5 ml Tween20 (0,05%)
Cx40:
+ 20g BSA (2%; Sigma-Aldrich)
1ml Tween20 (0,1%)
Cx43:
+ 50g melkpoeder (5%)
1ml Tween20 (0,1%)
GFAP:
+ 50g melkpoeder (5%)
1ml Tween20 (0,1%)
NF-κB:
+ 20g BSA (2%)
1ml Tween20 (0,1%)
β-Tubuline:
+ 50g melkpoeder (5%)
1ml Tween20 (0,1%)
GADPH:
+ 50g melkpoeder (5%)
1ml Tween20 (0,1%)
Tabel 10: Lijst van gebruikte primaire en secundaire antilichamen.
Albumine:
Cx37:
Cx40:
Cx43:
GFAP:
NF-κB:
β-Tubuline:
GAPDH:
Primair antilichaam:
Secundair antilichaam:
Primair antilichaam:
Secundair antilichaam:
Primair antilichaam:
Secundair antilichaam:
Primair antilichaam:
Secundair antilichaam:
Primair antilichaam:
Secundair antilichaam:
Primair antilichaam:
Secundair antilichaam:
Primair antilichaam:
Secundair antilichaam:
Primair antilichaam:
Secundair antilichaam:
Anti-albumine (kip; abcam®)
Anti-kip IgY-alkalisch fosfatase (konijn; abcam®)
Anti-Cx37 (konijn; Novex®, Invitrogen)
Anti-konijn IgG-alkalisch fosfatase (geit; Sigma-Aldrich)
Anti-Cx40 (konijn; Alpha Diagnostic International)
Anti-konijn IgG-alkalisch fosfatase (geit; Sigma-Aldrich)
Anti-Cx43 (konijn; Sigma-Aldrich)
Anti-konijn IgG-alkalisch fosfatase (geit; Sigma-Aldrich)
Anti-GFAP (konijn; abcam®)
Anti-konijn IgG-alkalisch fosfatase (geit; Sigma-Aldrich)
Anti-p-NF-κB p65 (konijn; Santa Cruz Biotechnology)
Anti-konijn IgG-alkalisch fosfatase (geit; Sigma-Aldrich)
Anti-beta tubuline (konijn; abcam®)
Anti-konijn IgG-alkalisch fosfatase (geit; Sigma-Aldrich)
Anti-GAPDH (muis; abcam®)
Anti-muis IgG-alkalisch fosfatase (geit; Sigma-Aldrich)
Tabel 11: Samenstelling van running en stacking gel voor gelatine zymografie.
Running gel (20ml):
dH2O
30% Acrylamide/Bis-acrylamide
1,5M Tris (pH 8,8)
10% SDS
10% Ammoniumpersulfaat
TEMED
10mg/ml gelatine
Stacking gel (5ml):
dH2O
30% Acrylamide/Bis-acrylamide
1,5M Tris (pH 6,8)
10% SDS
10% Ammoniumpersulfaat
TEMED
7,9ml
6,7ml
5,0ml
0,2ml
0,2ml
0,008ml
2,0ml
Bio-Rad
Invitrogen
Bio-Rad
Bio-Rad
Bio-Rad
Sigma-Aldrich
3,4ml
0,83ml
0,63ml
0,05ml
0,05ml
0,005ml
Bio-Rad
Invitrogen
Bio-Rad
Bio-Rad
Bio-Rad
Tabel 12: Samenstelling van 1l ontwikkelingsbuffer (10x).
Tris
Tris-HCl
NaCl
CaCl2.2H2O
Brij 35
dH2O
12,1g
63g
117g
7,4g
0,2%
1l
Sigma-Aldrich
Sigma-Aldrich
VWR International
VWR International
Sigma-Aldrich
1/500
1/8000
1/500
1/2000
1/500
1/2000
1/1000
1/8000
1/5000
1/8000
1/500
1/4000
1/5000
1/8000
1/10000
1/4000

Rit 4 Derny 1 - Zesdaagse van Amsterdam

DELPRO FARM MANAGER DELAVAL

Rit 30 Madison 2 - Zesdaagse van Amsterdam

EM InSITErapport maart 07032014 DIGITAAL.indd

Hobart waterbehandeling en osmose

Jet-dry®gel - Van Meerbeek nv

NEBIDO® (TESTOSTERONUNDECANOAAT) 1000 mg/4 ml

Technical Datasheet MC-Fastpack 2700

RF CapInject