Screeningstest antibacteriële stoffen in dierenvoeders -7 platen

Federaal Agentschap
voor de Veiligheid
van de Voedselketen
Bestuur Laboratoria
I-MET-FLVVT-058
I-MET-FLVVT-058
SCREENINGSTEST ANTIBACTERIËLE STOFFEN IN
DIERENVOEDERS
(7-PLATEN BIOAUTOGRAFISCH SYSTEEM)
Versie
04
Datum van toepassing
2014-02-27
Opgesteld door :
Nele Maris, Laborant
Nazicht door :
Mieke Vanbrabant; Sectiehoofd; 2014-02-27
Goedkeuring vrijgave door :
Mandy Lekens; Laboratoriummanager; 2014-02-27
Beheer & locatie geldende versie :
FLVVT; M:\DOCUMENTEN\QAM\Kwaliteitsysteem
Bestemmelingen :
Medewerkers FLVVT
Trefwoorden :
Toevoegingsmiddelen
LAB 25 I-MET-FLVVT-058 - Screeningstest Antibacteriële Stoffen (7 platen bioautografisch systeem) v.04 1/19
SCREENINGSTEST ANTIBACTERIËLE STOFFEN IN DIERENVOEDERS (7-PLATEN
BIOAUTOGRAFISCH SYSTEEM)
Overzicht wijzigingen
Herziening
*
door/datum
A. Voets,
10/2007
QAM,
12/2008
M. Vanbrabant,
08/2012
M. Vanbrabant,
06/2013
N. Maris,
02/2014
Reden van de herziening
Opsteller van initiële versie
Tekstdeel/draagwijdte
van de herziening
Volledige tekst
Nummering FoodLIMS  geen wijziging versie
Blz 1 + 2
Update documentbeheer
Volledige tekst
 Omwille van de omvang van de wijzigingen,
wordt de tekst door gebruik van markering van
wijzigingen niet meer bruikbaar. Vandaar is
besloten om de markering van wijzigingen weg
te laten in versie 02.
Opmerkingen tijdens externe BELAC audit Volledige tekst
12/2012 + algemene update
 Omwille van de omvang van de wijzigingen,
wordt de tekst door gebruik van markering van
wijzigingen niet meer bruikbaar. Vandaar is
besloten om de markering van wijzigingen weg
te laten in versie 03.
Opmerkingen tijdens externe BELAC audit B- Paragraaf 10 en 12
014 4 2TU module E2 (ANC1 en BNC1 en 3)
*
Het verschil tussen de huidige datum en de laatste herziening mag niet meer dan 5 jaar
bedragen.
Wijzigingen ten opzichte van de vorige versie worden gemarkeerd in rood.
Indien omwille van de omvang van de wijzigingen, de tekst door gebruik van markeringen niet
meer leesbaar wordt, wordt de markering van wijzigingen weggelaten in de nieuwe versie. Dit
wordt vermeld in de historiek van het document.
LAB 25 I-MET-FLVVT-058 - Screeningstest Antibacteriële Stoffen (7 platen bioautografisch systeem) v.04 2/19
SCREENINGSTEST ANTIBACTERIËLE STOFFEN IN DIERENVOEDERS (7-PLATEN
BIOAUTOGRAFISCH SYSTEEM)
INHOUDSTABEL
1
DOEL .................................................................................................................................. 4
2
TOEPASSINGSGEBIED .................................................................................................... 4
3
WETTELIJKE EN NORMATIEVE DOCUMENTEN........................................................... 4
4
DEFINITIES EN AFKORTINGEN ...................................................................................... 5
5
PRINCIPE........................................................................................................................... 5
6
PRESTATIEKENMERKEN ................................................................................................ 5
7
VEILIGHEIDSVOORSCHRIFTEN EN BIJZONDERE MAATREGELEN .......................... 5
8
REAGENTIA EN HULPSTOFFEN..................................................................................... 6
9
8.1
REAGENTIA..................................................................................................................... 6
8.2
HULPSTOFFEN ................................................................................................................ 7
8.2.1
Standaarden ........................................................................................................ 7
8.2.2
Micro-organismen ................................................................................................ 8
8.2.3
Voedingsbodems ............................................................................................... 10
TOESTELLEN .................................................................................................................. 10
9.1
ALGEMEEN ................................................................................................................... 10
9.2
SPECIFICATIES VOOR DEZE METHODE ............................................................................ 10
10 WERKWIJZE.................................................................................................................... 11
10.1
10.1.1
10.2
VOORBEHANDELING VAN DE MONSTERS ..................................................................... 11
Dierenvoeders .................................................................................................... 11
BEREIDING DIFFUSIEAGARPLATEN.............................................................................. 11
10.2.1
Algemeen ........................................................................................................... 11
10.2.2
Bereiding van de platen van het bioautografisch systeem ............................... 11
10.3
INZETTEN VAN DE PLATENTEST .................................................................................. 12
10.4
BEBROEDING VAN DE DIFFUSIEAGARPLATEN............................................................... 13
10.5
AFLEZEN VAN DE PLATENTEST ................................................................................... 13
10.5.1
Voorafgaande beschouwingen .......................................................................... 13
10.5.2
Meting remzones ............................................................................................... 13
10.6
VOORLOPIGE IDENTIFICATIE VAN DE BACTERIËLE STOF ............................................... 13
11 KWALITEITSCONTROLE ............................................................................................... 14
12 BEREKENING EN RAPPORTERING ............................................................................. 14
13 VERWIJZING NAAR BIJHORENDE PROCEDURES, INSTRUCTIES, DOCUMENTEN,
FORMULIEREN OF LIJSTEN ................................................................................................ 16
LAB 25 I-MET-FLVVT-058 - Screeningstest Antibacteriële Stoffen (7 platen bioautografisch systeem) v.04 3/19
SCREENINGSTEST ANTIBACTERIËLE STOFFEN IN DIERENVOEDERS (7-PLATEN
BIOAUTOGRAFISCH SYSTEEM)
1 Doel
Aantonen en/of bepalen van antibacteriële activiteit in dierenvoeders.
2 Toepassingsgebied
De methode is geschikt voor het aantonen en/of bepalen van antimicrobiële activiteit in
dierenvoeders. Voor bacterieel sterk verontreinigde monsters is deze methode niet bruikbaar.
Aantoonbaarheidsgrenzen (minimale remmende concentraties) zijn terug te vinden in bijlage
1.
3 Wettelijke en normatieve documenten
Een overzicht van de wettelijke en normatieve documenten wordt gegeven in LAB 25-L 18
OVERZICHT WETGEVING FLVVT.
Gezien de verregaande aanpassingen aan de referentiemethode en uitbreiding van deze
methode van 5 naar 7 platen, wordt een gedetailleerde vergelijking van de twee methoden te
omslachtig. Om deze reden wordt er hier slechts een beknopt overzicht van de belangrijkste
afwijkingen ten opzichte van de referentiemethode gegeven.
Referentiemethode (CCL, Veghel)

Extractie 10 % suspensie methanol/H20
(50/50)
I-MET-FLVVT-058
 Extractie 40 % suspensie methanol/H20
(70/30)

Standaard II Nahragar
 Antibiotic medium nr. 1

TMP oplossing 50 µg/ml
 TMP oplossing 200 µg/ml

Controlestandaarden tylosine en natrium-  Controlestandaarden tylosine en
sulfadimidine

5 platen
tetracycline
 7 platen
M. luteus pH 6 en pH 8
M. luteus ATCC 9341 pH 6 en pH 8
B. subtilis BGA pH 6 en pH 8
M. luteus ATCC 10240
B. subtilis BGA + TMP pH 7,2
B. subtilis BGA pH 6 en pH 8
B. subtilis BGA + TMP pH 7,2
B. cereus tetracycline resistent
LAB 25 I-MET-FLVVT-058 - Screeningstest Antibacteriële Stoffen (7 platen bioautografisch systeem) v.04 4/19
SCREENINGSTEST ANTIBACTERIËLE STOFFEN IN DIERENVOEDERS (7-PLATEN
BIOAUTOGRAFISCH SYSTEEM)
4 Definities en afkortingen
Term
Antibacteriële activiteit
Definitie
De aanwezigheid van minstens één stof in een monster, die in
staat is de groei van minstens één testorganisme te remmen.
Deze remming wordt waargenomen als remzones.
cfu
Colony forming units
MIC
Minimum inhibitory concentration
5 Principe
Het monster wordt, na bereiden van een geschikte oplossing, op de 7 platen van het
bioautografisch systeem gebracht. De platen worden bij geschikte temperaturen bebroed
gedurende 18 à 24 uur. Bij aanwezigheid van antibacteriële activiteit worden remzones
zichtbaar op één of meerdere platen. Het remmingspatroon kan een eerste indicatie geven
voor de identiteit van de aanwezige antibacteriële stoffen. Een eenduidige identificatie van de
aanwezige stoffen is met deze methode echter niet mogelijk.
6 Prestatiekenmerken
De relevante meetonzekerheden zijn terug te vinden in LAB 25-L 22 OVERZICHT
MEETONZEKERHEDEN FLVVT.
De
waarden
voor
de
reproduceerbaarheid
(RSDR%)
zijn
terug
te
vinden
in
M:\DOCUMENTEN\QAM\Tweedelijn\Beoordeling tweedelijn.xlsx.
7 Veiligheidsvoorschriften en bijzondere maatregelen
De scheikundige producten die bij deze analysemethode gebruikt worden, zijn ondergebracht
bij de potentieel gevaarlijke stoffen. Dit maakt het noodzakelijk de voorziene maatregelen in
het laboratorium toe te passen om blootstelling aan of contact met deze producten tot een
minimum te herleiden. Richtlijnen in verband met werken in het microbiologisch labo worden
beschreven in LAB 25-I 15 HANDELINGEN MICROBIOLOGISCH LABO. De risicoklasse waartoe de
gebruikte stam behoort, is terug te vinden in LAB 25-L 23 LIJSTEN ANTIBIOTICA.
Algemene en specifieke veiligheidsvoorschriften zijn opgenomen in LAB 25-P 07
VEILIGHEIDSINSTRUCTIES FLVVT.
LAB 25 I-MET-FLVVT-058 - Screeningstest Antibacteriële Stoffen (7 platen bioautografisch systeem) v.04 5/19
SCREENINGSTEST ANTIBACTERIËLE STOFFEN IN DIERENVOEDERS (7-PLATEN
BIOAUTOGRAFISCH SYSTEEM)
8 Reagentia en hulpstoffen
8.1
Reagentia
Alle reagentia dienen van ‘pro analyse ‘-kwaliteit te zijn of van hogere kwaliteit indien vermeld.
Reagentia
Labonr.
8.1.1
Water, gedemineraliseerd (demi)
R1004
8.1.2
Methanol, HPLC-kwaliteit (CH3OH)
R0183
8.1.3
Natriumhydroxide pellets (NaOH)
R0206
8.1.4
Zoutzuur, 37% (HCl)
R0304
8.1.5
Kaliumdiwaterstoffosfaat (KH2PO4)
R0719
8.1.6
Di-kaliumwaterstoffosfaat (K2HPO4)
R0120
Natriumhydroxide oplossing (NaOH) 6N:
8.1.7
W0111
Los 240 g NaOH (R0206) op in 1000 ml water (R1004)
Natriumhydroxide oplossing (NaOH) 3N:
8.1.8
W0580
Los 120 g NaOH (R0206) op in 1000 ml water (R1004)
Natriumhydroxide (NaOH) 1N:
8.1.9
Los 40 g NaOH (R0206) op in 1000 ml water (R1004)
8.1.10
8.1.11
W0110
Zoutzuur (HCl) 1N:
Voeg bij 50 ml geconcentreerde HCl (R0304) 250 ml water (R1004)
Zoutzuuroplossing (HCl) 6N:
Voeg bij 50 ml geconcentreerde HCl (R0304) 50 ml water (R1004)
W0009
W0117
8.1.12
Zoutzuuroplossing 0,1N
R0191
8.1.13
Natriumchloride (NaCl)
R0200
Steriele fysiologische zoutoplossing (0,85 %) (m/v):
8.1.14
Los 8,5 g natriumchloride (R0200) op in water (R1004) en verdun tot 1000 W0115
ml en autoclaveer.
Trimethoprim oplossing (TMP 200 µg/ml), Sigma T7882
Los 10 mg TMP (S0573) op in methanol p.a. (R0183) in een maatkolf van
8.1.15
50 ml en vul aan tot de maatstreep met methanol (R0183). De
W1175
concentratie van de oplossing is 200 µg TMP/ml. Houdbaarheid 1 maand
bij 2-8°C.
Fosfaatbuffer pH 7,0:
8.1.16
Kaliumdiwaterstoffosfaat KH2PO4
(R0719)
5,5 g
Dikaliumwaterstoffosfaat K2HPO4
(R0120)
13,6 g
Gedestilleerd water tot
(R1004)
1000 ml
W0161
Breng op pH 7,0 ± 0,1
8.1.17
Fosfaatbuffer pH 8,0:
W0174
LAB 25 I-MET-FLVVT-058 - Screeningstest Antibacteriële Stoffen (7 platen bioautografisch systeem) v.04 6/19
SCREENINGSTEST ANTIBACTERIËLE STOFFEN IN DIERENVOEDERS (7-PLATEN
BIOAUTOGRAFISCH SYSTEEM)
Kaliumdiwaterstoffosfaat KH2PO4
(R0719)
0,523 g
Dikaliumwaterstoffosfaat K2HPO4
(R0120)
16,73 g
Gedestilleerd water tot
(R1004)
1000 ml
Breng op pH 8,0 ± 0,1
8.1.18
Fosfaatbuffer pH 8,0/Methanol (W0174/R0183) (80/20, v/v)
W0080
Fosfaatbuffer pH 5,5:
8.1.19
Kaliumdiwaterstoffosfaat KH2PO4
(R0719)
130,86 g
Dikaliumwaterstoffosfaat K2HPO4
(R0120)
6,947 g
Gedestilleerd water tot
(R1004)
1000 ml
W0172
Breng op pH 5,5 ± 0,1
8.1.20
Fosfaatbuffer pH 5,5: 1/10 verdund met H2O
W0173
8.1.21
Methanol/Water (R0183/R1004) (70/30, v/v)
W0060
8.1.22
Penicillinase (Penase)
R2030
8.1.23
-Lactamase (Breed spectrum, Bacillus cereus)
R2031
8.1.24
Oxoid Antibiotic Medium nr. 1 (CM0327) of gelijkwaardig
R0072
8.1.25
Oxoid Nutriënt Agar (CM0003) of gelijkwaardig
R0589
8.1.26
Entsuspensie Micrococcus luteus (Sarcina) (ATCC 9341)
W0186
8.1.27
Entsuspensie Micrococcus luteus (flavus) (ATCC 10240)
W0187
8.1.28
Entsuspensie Bacillus subtilis (BGA)
W0905
8.1.29
Entsuspensie Bacillus cereus Tetracycline (TC) resistent (LMG 18365)
W0906
8.2
Hulpstoffen
8.2.1
Standaarden
Tylosine standaardstof met gegarandeerde zuiverheid
(S0109)
Tetracycline standaardstof met gegarandeerde zuiverheid
(S0108)
Trimethoprim standaardstof met gegarandeerde zuiverheid
(S0573)
8.2.1.1
Tylosine standaard stockoplossing, 200 µg/ml (W0129)
Weeg, rekening houdend met de zuiverheid, X mg tylosine (S0109) tot op 0,1 mg nauwkeurig
af in een maatkolf van 50 ml en registreer de afgewogen hoeveelheid X op LAB 25-F 04
ANTIBIOTICA REGISTRATIE OERSTANDAARDOPLOSSING. Los op in 5 ml methanol (R0183) en leng
vervolgens aan tot de maatstreep met fosfaatbuffer pH 7,0 (W0161) zodat de concentratie
200 µg/ml bedraagt. Deze oplossing is 1 maand houdbaar bij een temperatuur van 4 ± 4°C.
LAB 25 I-MET-FLVVT-058 - Screeningstest Antibacteriële Stoffen (7 platen bioautografisch systeem) v.04 7/19
SCREENINGSTEST ANTIBACTERIËLE STOFFEN IN DIERENVOEDERS (7-PLATEN
BIOAUTOGRAFISCH SYSTEEM)
Tylosine standaard werkoplossing, 2 μg/ml
8.2.1.2
Pipetteer 0,5 ml van de standaard stockoplossing (W0129) in een maatkolf van 50 ml. Leng
aan tot de maatstreep met fosfaatbuffer pH 8,0/methanol (80/20) (W0080) en meng. Deze
controleoplossing wordt bereid op de dag van de analyse.
8.2.1.3
Tetracycline standaard stockoplossing, 200 µg/ml (W0128)
Weeg, rekening houdend met de zuiverheid, X mg tetracycline (S0108) tot op 0,1 mg
nauwkeurig af in een maatkolf van 50 ml en registreer de afgewogen hoeveelheid X op LAB
25-F 04 ANTIBIOTICA REGISTRATIE OERSTANDAARDOPLOSSING. Los op in zoutzuur 0,1N (R0191)
en leng vervolgens aan tot de maatstreep zodat de concentratie 200 µg/ml bedraagt. Deze
oplossing is 1 maand houdbaar bij een temperatuur van 4 ± 4°C.
Tetracycline standaard werkoplossing, 1 μg/ml
8.2.1.4
Pipetteer 0,5 ml van de standaard stockoplossing (W0128) in een maatkolf van 100 ml. Leng
aan tot de maatstreep met fosfaatbuffer pH 5,5 1/10 verdund (W0173). Deze
controleoplossing wordt bereid op de dag van de analyse.
Algemene richtlijnen met betrekking tot aanmaak en beheer van standaarden worden
weergegeven in LAB 25-D 40 ANTIBIOTICA OVERZICHT STANDAARDOPLOSSINGEN en LAB 25-I 19
BEHEER STANDAARDEN TOEVOEGINGSMIDDELEN.
8.2.2
Micro-organismen
Algemene richtlijnen m.b.t. de overenting en het gebruik van stamculturen worden
weergegeven in LAB 25-L 23 LIJSTEN ANTIBIOTICA.
8.2.2.1
8.2.2.1.1
Micrococcus luteus (Sarcina) ATCC 9341 (M0102)
Bewaren van de stam
Buizen met schuin gestolde agarvoedingsbodem (8.2.3.1) worden op de vereiste pH
gebracht, geënt (1 naaldoog) met het micro-organisme en geïncubeerd zoals weergegeven in
LAB 25-L 23 LIJSTEN ANTIBIOTICA.
Deze cultuur wordt in de koelkast bewaard bij een
temperatuur van 4 ± 4°C en wordt maandelijks overgeënt.
LAB 25 I-MET-FLVVT-058 - Screeningstest Antibacteriële Stoffen (7 platen bioautografisch systeem) v.04 8/19
SCREENINGSTEST ANTIBACTERIËLE STOFFEN IN DIERENVOEDERS (7-PLATEN
BIOAUTOGRAFISCH SYSTEEM)
8.2.2.1.2
Bereiding van de bacteriesuspensie (W0186)
Een vers bereide cultuur op schuin gestolde agarvoedingsbodem (8.2.3.1) wordt
gesuspendeerd in 4 ml steriele fysiologische zoutoplossing (W0115). Deze entsuspensie is 1
maand houdbaar bij een temperatuur van 4 ± 4°C.
8.2.2.1.3
Controle entsuspensie
Indien de absorptie van een 1/10 verdunning van de bekomen suspensie (gemeten bij 650
7
8
nm t.o.v. fysiologische zoutoplossing) 0,3 à 0,6 bedraagt, bevat de entsuspensie 5.10 - 10
cfu/ml en kan ze gebruikt worden om de agarvoedingsbodem voor de screeningstest te
enten. Indien de gemeten absorptie buiten de gestelde grenzen valt, kan de entsuspensie
verdund worden (bij te hoge absorptie) of dient een nieuwe suspensie te worden bereid (bij te
lage absorptie).
8.2.2.2
8.2.2.2.1
Micrococcus luteus (flavus) ATCC 10240 (M0105)
Bewaren van de stam en bereiding van de bacteriesuspensie (W0187)
Zie 8.2.2.1.1 en 8.2.2.1.2
8.2.2.2.2
Controle entsuspensie
Zie 8.2.2.1.3. De absorptie mag nu echter 0,25 à 0,5 bedragen.
8.2.2.3
7
Bacillus subtilis (BGA), Merck BGA sporensuspensie 10 CFU/ ml (M0114)
Houdbaarheid ampul maximaal 1 jaar bij een temperatuur van 4 ± 4°C.
8.2.2.3.1
Bereiding van de bacteriesuspensie (W0905)
De inhoud van 1 ampul Bacillus subtilis (BGA) sporensuspensie (M0114) wordt
gesuspendeerd in 4 ml steriele fysiologische zoutoplossing (W0115). Deze suspensie is 1
maand houdbaar bij een temperatuur van 4 ± 4°C.
8.2.2.4
8.2.2.4.1
Bacillus cereus tetracycline (TC) resistent (LMG 18365) (M0111)
Bewaren van de stam en bereiding van de bacteriesuspensie (W0906)
Zie 8.2.2.1.1 en 8.2.2.1.2
LAB 25 I-MET-FLVVT-058 - Screeningstest Antibacteriële Stoffen (7 platen bioautografisch systeem) v.04 9/19
SCREENINGSTEST ANTIBACTERIËLE STOFFEN IN DIERENVOEDERS (7-PLATEN
BIOAUTOGRAFISCH SYSTEEM)
8.2.2.4.2
Controle entsuspensie
Zie 8.2.2.1.3. De absorptie mag nu echter 0,25 à 0,5 bedragen.
8.2.3
Voedingsbodems
8.2.3.1
Antibiotic medium nr. 1 (A1) (CM0327), Oxoid (R0072)
Samenstelling volgens fabrikant:
8.2.3.2
Vleesextract
1,5 g
Gist
3,0 g
Pepton uit caseïne
4,0 g
Vleespepton
6,0 g
Glucose
1,0 g
Agar
15,0 g
Water
1000 ml
Nutriënt Agar (CM0003), Oxoid (R0589)
De bovengenoemde media kunnen vervangen worden door artikelen van een andere
leverancier, mits werd vastgesteld dat deze van dezelfde of betere kwaliteit zijn. Voor de
bereiding wordt in dit geval verwezen naar de specificaties van de fabrikant.
9 Toestellen
9.1
Algemeen
Een overzicht van gebruikte apparatuur wordt gegeven in LAB 25-L 21 APPARATUUR GEBRUIKT
VOOR ANALYSEN FLVVT.
9.2
Specificaties voor deze methode
De absorptiemetingen bij 650 nm gebeuren m.b.v. de Multiscan Ascent (1638).
LAB 25 I-MET-FLVVT-058 - Screeningstest Antibacteriële Stoffen (7 platen bioautografisch systeem) v.04 10/19
SCREENINGSTEST ANTIBACTERIËLE STOFFEN IN DIERENVOEDERS (7-PLATEN
BIOAUTOGRAFISCH SYSTEEM)
10 Werkwijze
10.1 Voorbehandeling van de monsters
10.1.1 Dierenvoeders
Van het (gemalen) monster wordt 20 g afgewogen, waarna 50 ml methanol/water (70/30,
W0060) wordt toegevoegd en het geheel 30 minuten wordt geschud. Afhankelijk van de te
verwachten
concentratie
kan
het
extract
eventueel
verder
verdund
worden
met
methanol/water (W0060).
De pH wordt bijgesteld tot 4 < pH < 8 met een natriumhydroxide- of zoutzuuroplossing indien
nodig.
10.2 Bereiding diffusieagarplaten
10.2.1 Algemeen
Plaats een glasplaat met kunststof ring op een nivelleertafel.
Na enten en mengen van de voedingsbodem (zie 10.2.2 ) wordt hiervan zo snel mogelijk 50
ml in de ring uitgegoten. Voor het uitgieten van de beënte agar wordt de glasplaat vluchtig
opgewarmd met een gasbrander, waarna men de agar gelijkmatig kan uitgieten. Plaats de
platen op een horizontaal oppervlak om de agar te laten afkoelen.
10.2.2 Bereiding van de platen van het bioautografisch systeem
Algemene richtlijnen m.b.t. gebruik van entsuspensies worden weergegeven in LAB 25-P 01
RESULTAATVALIDATIE ANTIBIOTICA. Op pH brengen van de voedingsbodems gebeurt met NaOH
en HCl.
10.2.2.1 Micrococcus luteus ATCC 9341 plaat – pH 6
Stel de pH van het tot ± 50°C afgekoelde medium A1 (8.2.3.1) zodanig in dat deze 6,0 ± 0,1
is. Voeg 0,1 ml M. luteus entsuspensie (W0186) toe per 100 ml en meng. De concentratie
5
6
bedraagt dan 10 - 10 cellen per ml voedingsbodem.
10.2.2.2 Micrococcus luteus ATCC 9341 plaat – pH 8
Stel de pH van het tot ± 50°C afgekoelde medium A1 (8.2.3.1) zodanig in dat deze 8,0 ± 0,1
is. Voeg 0,1 ml M. luteus entsuspensie (W0186) toe per 100 ml voedingsbodem en meng. De
5
6
concentratie bedraagt dan 10 -10 cellen per ml voedingsbodem.
LAB 25 I-MET-FLVVT-058 - Screeningstest Antibacteriële Stoffen (7 platen bioautografisch systeem) v.04 11/19
SCREENINGSTEST ANTIBACTERIËLE STOFFEN IN DIERENVOEDERS (7-PLATEN
BIOAUTOGRAFISCH SYSTEEM)
10.2.2.3 Micrococcus luteus ATCC 10240 plaat – pH 6,5
Stel de pH van de tot ± 50° C afgekoelde nutriënt agar (8.2.3.2) zodanig in dat deze 6,5 ± 0,1
is. Voeg 0,1 ml M. luteus entsuspensie (W0187) toe per 100 ml voedingsbodem en meng. De
5
6
concentratie bedraagt dan 10 - 10 cellen per ml voedingsbodem.
10.2.2.4 Bacillus subtilis BGA plaat – pH 6
Stel de pH van het tot ± 50°C afgekoelde medium A1 (8.2.3.1) zodanig in dat deze 6,0 ± 0,1
is. Voeg aseptisch 0,3 ml B.subtilis BGA sporensuspensie (W0905) toe per 100 ml medium.
4
5
De concentratie bedraagt dan 10 -10 sporen/ml voedingsbodem.
10.2.2.5 Bacillus subtilis BGA plaat – pH 8
Stel de pH van het tot ± 50°C afgekoelde medium A1 (8.2.3.1) zodanig in dat deze 8,0 ± 0,1
is. Voeg aseptisch 0,3 ml B.subtilis BGA sporensuspensie (W0905) toe per 100 ml medium.
4
5
De concentratie bedraagt dan 10 -10 sporen/ml voedingsbodem.
10.2.2.6 Bacillus subtilis BGA plaat – pH 7,2 met trimethoprim
Stel de pH van het tot ± 50°C afgekoelde medium A1 (8.2.3.1) zodanig in dat deze 7,2 ± 0,1
is. Voeg per 100 ml voedingsbodem aseptisch 0,3 ml van de B. subtilis BGA sporensuspensie
4
(W0905) en 100 µl TMP oplossing (W1175) toe en meng. De concentratie bedraagt dan 10 5
10 sporen en 0,20 µg TMP/ml voedingsbodem.
10.2.2.7 Bacillus cereus TC resistent plaat pH 6,5
Stel de pH van het tot ± 50° C afgekoelde medium A1 (8.2.3.1) zodanig in dat deze 6,5 ± 0,1
is. Voeg 0,2 ml entsuspensie (W0906) toe per 100 ml voedingsbodem en meng. De
5
6
concentratie is dan 10 - 10 cellen per ml voedingsbodem.
10.3 Inzetten van de platentest
De verschillende monsters en controleoplossingen worden op de agar gebracht zodanig dat
er voldoende afstand tussen de monsters is. Voor suspensies, verdunningen en/of vloeibare
producten worden gaatjes (uitwendige diameter 13,3 mm) in de diffusieagarplaten geponst,
waarna 150 µl vloeistof in de ponsgaatjes wordt gepipetteerd.
LAB 25 I-MET-FLVVT-058 - Screeningstest Antibacteriële Stoffen (7 platen bioautografisch systeem) v.04 12/19
SCREENINGSTEST ANTIBACTERIËLE STOFFEN IN DIERENVOEDERS (7-PLATEN
BIOAUTOGRAFISCH SYSTEEM)
10.4 Bebroeding van de diffusieagarplaten
Na het afdekken van de afzonderlijke platen met een schone glasplaat, worden de platen
gedurende 18 tot 24 uur bebroed bij 37 ± 2°C.
10.5 Aflezen van de platentest
10.5.1 Voorafgaande beschouwingen
Onder remzone wordt bij ponsgaten verstaan de diameter van rand tot overliggende rand van
de heldere zone om het ponsgat.
Een remzone met onregelmatige vorm, die ontstaan is door de aanwezigheid van
bacteriekolonies op de plaat die groeiremmende stoffen produceren, kan niet worden
beoordeeld.
10.5.2 Meting remzones
Na de bebroeding van de platen worden de remzones m.b.v. vergrotingsapparatuur met een
nauwkeurigheid van 0,1 mm opgemeten. De aflezing gebeurt met behulp van apparatuur die
± 7,5 maal vergroot. Een ponsgaatje met een uitwendige diameter van 13,3 mm geeft
bijgevolg als aflezing ‘100’.
10.6 Voorlopige identificatie van de bacteriële stof
De plaat waarop de grootste remzone zichtbaar is, kan een indicatie geven voor de klasse
van het mogelijk aanwezig antibioticum (zie paragraaf 12).
Penicillinasegevoelige penicillines en cephalopsporines kunnen aangetoond worden
door aan 150 µl monsterextract in het ponsgaatje op plaat M.luteus ATCC 9341 pH 6 150 µl
-lactamase (R2031) of penicillinase (R2030) toe te voegen. Indien er penicillines of
cephalosporines aanwezig zijn zal de remzone beduidend kleiner worden of verdwijnen na
toevoeging van -lactamase (breed spectrum). Bij penicillines zal de remzone beduidend
kleiner worden of verdwijnen na toevoeging van penicillinase (specifiek), bij cephalosporines
blijft de remzone gelijkaardig.
Tetracyclines kunnen aangetoond worden indien de remzone, die aanwezig is op plaat B.
subtilis BGA pH 6, verdwijnt op de plaat geënt met B.cereus TC resistent. Het gebruik van
deze plaat dient enkel ter indicatie van de aanwezigheid van tetracyclines.
LAB 25 I-MET-FLVVT-058 - Screeningstest Antibacteriële Stoffen (7 platen bioautografisch systeem) v.04 13/19
SCREENINGSTEST ANTIBACTERIËLE STOFFEN IN DIERENVOEDERS (7-PLATEN
BIOAUTOGRAFISCH SYSTEEM)
11 Kwaliteitscontrole
Zie LAB 25-P 01 RESULTAATVALIDATIE ANTIBIOTICA
Om de kwaliteit van de testplaten te controleren worden op elke plaat een blanco (150 µl
methanol/water, W0060) en 150 µl controleoplossing van tylosine (8.2.1.2) meegenomen. Op
de platen beënt met B. subtilis BGA pH 6 en met B. cereus TC resistent wordt tevens 150 µl
controleoplossing van tetracycline (8.2.1.4) aangebracht.
De analyse moet worden herhaald indien de blanco een remzone geeft  115mm Ø op één
van de platen of indien een remzone voor één van de controleoplossingen buiten het
vastgestelde criterium van ± 10 % valt van zijn vastgestelde waarde. De opgemeten waarden
voor blanco en controleoplossingen worden genoteerd op het uitvoeringsverslag.
12 Berekening en rapportering
Het resultaat van een monster wordt gebaseerd op de grootte van de gemeten remzones.
Indien de remzones op een plaat op zo’n manier met elkaar interfereren dat diameter van de
zone niet correct kan gemeten worden, dient de analyse herhaald te worden met aangepaste
extractverdunningen.
Een remzone wordt beoordeeld volgens onderstaande richtlijn**.
Waarneming
remzone < 120
150
Beoordeling
negatief
Notering
-
+/+
remzone > 120
150
positief
Resultaatweergave
++
+++
++++
+++++
Geen antimicrobiële activiteit
zone 120-140*
zone 140150170*
zone 170-200*
Activiteit op…(betreffende plaat met
zone 200-230
micro-organisme)
zone 230-260
zone > 260
* Voor remzones < 200 dient op basis van het remmingspatroon te worden nagegaan of
verder onderzoek noodzakelijk is.
** Remzones uitgedrukt in mm (de werkelijke zones 7,5 maal vergroot)
Bij de rapportering van resultaten wordt de vermelding 'Activiteit op…' steeds gevolgd door de
vermelding 'niet noodzakelijk afkomstig van antibiotica'. Met deze methode wordt immers
enkel een groeiremmende activiteit van een monster vastgesteld en niet de aanwezigheid van
een antibioticum als dusdanig. Zie bijlage 2 voor een overzicht van de resultaatrapportering.
LAB 25 I-MET-FLVVT-058 - Screeningstest Antibacteriële Stoffen (7 platen bioautografisch systeem) v.04 14/19
SCREENINGSTEST ANTIBACTERIËLE STOFFEN IN DIERENVOEDERS (7-PLATEN
BIOAUTOGRAFISCH SYSTEEM)
Bepaalde sporenelementen kunnen ook groeiremming veroorzaken:

Ijzer : mogelijk zones op plaat B. subtilis BGA pH 6

Zink : mogelijk zones op plaat M. luteus ATCC 10240

Mangaan kan zones van groeibevordering doen ontstaan
Het laboratorium kan een beoordeling geven van het analyseresultaat. Deze beoordeling
Het analyseresultaat wordt als volgt geformuleerd :

‘Afwezig’:
Monster vertoont geen antimicrobiële activiteit

‘Aanwezig’:
Monster vertoont antimicrobiële activiteit, waarbij vermeld wordt op
welke plaat of platen er antimicrobiële activiteit werd waargenomen
, waarbij vervolgens een onderscheid gemaakt wordt tussen:
o
‘Conform; aanwezigheid van achtergrondcontaminatie’: monster vertoont
activiteit, waarschijnlijk te wijten aan achtergrondinhibitie
o
‘Verdacht; verder onderzoek noodzakelijk’: monster vertoont activiteit die
mogelijk wijst op aanwezigheid van additieven) (remzone > 200); als
commentaar kan vermeld worden welke bijkomende analyse best wordt
uitgevoerd.
Op basis van het remmingspatroon van een monster (testplaat/platen waarop grootste
remming wordt waargenomen) kan men vermoeden welk type antibioticum zou kunnen
aanwezig zijn in het monster.
Product of ~ klasse
Virginiamycine
Penicillines
Gevoeligste plaat
M. luteus ATCC 9341 pH 6
Macroliden
Vb. Tylosine
Lincomycine
M. luteus ATCC 9341 pH 8
Spiramycine
….
Tetracyclines
Avoparcine
Salinomycine
B. subtilis BGA pH 6
Monensin
Flavomycine (maar zéér beperkt)
Sulfonamides
Bacitracine
Avilamycine
B. subtilis BGA pH 8
B. subtilis BGA pH 7,2 + TMP
B. subtilis BGA pH 7,2 + TMP
M. luteus ATCC 10240
Deze tabel dient enkel als richtlijn als hulp bij interpretatie van het analyseresultaat. Een meer
gespecialiseerde test ter identificatie van mogelijk aanwezige antibiotica blijft onontbeerlijk.
LAB 25 I-MET-FLVVT-058 - Screeningstest Antibacteriële Stoffen (7 platen bioautografisch systeem) v.04 15/19
SCREENINGSTEST ANTIBACTERIËLE STOFFEN IN DIERENVOEDERS (7-PLATEN
BIOAUTOGRAFISCH SYSTEEM)
13 Verwijzing naar bijhorende procedures, instructies,
documenten, formulieren of lijsten
LAB 25-D 40
ANTIBIOTICA: OVERZICHT STANDAARDOPLOSSINGEN
LAB 25-D 55
W ERKWIJZE ANTIMICROBIËLE ACTIVITEIT (7 PLATEN)
LAB 25-F 04
ANTIBIOTICA REGISTRATIE OERSTANDAARDOPLOSSING
LAB 25-I 15
HANDELINGEN MICROBIOLOGISCH LABO
LAB 25-I 19
BEHEER STANDAARDEN TOEVOEGINGSMIDDELEN
LAB 25-L 18
OVERZICHT WETGEVING FLVVT
LAB 25-L 21
APPARATUUR GEBRUIKT VOOR ANALYSEN FLVVT
LAB 25-L 22
OVERZICHT MEETONZEKERHEDEN FLVVT
LAB 25-L 23
LIJSTEN ANTIBIOTICA
LAB 25-P 01
RESULTAATVALIDATIE ANTIBIOTICA
LAB 25-P 07
VEILIGHEIDSINSTRUCTIES FLVVT
LAB 25 I-MET-FLVVT-058 - Screeningstest Antibacteriële Stoffen (7 platen bioautografisch systeem) v.04 16/19
SCREENINGSTEST ANTIBACTERIËLE STOFFEN IN DIERENVOEDERS (7-PLATEN BIOAUTOGRAFISCH SYSTEEM)
Molmassa’s, testplaat en minimale remmende concentratie (MIC) van enkele antibiotica en chemotherapeutica
Bijlage 1
Antibiotica afgeleid van
Type
Aminozuren
Mono
Chlooramfenicol
Aminozuren
Di
Penicilline G
Aminozuren
Poly
Aminoglucosiden
Macroliden
Gevoeligste
(g/mol)
testorganisme
pH
MIC
(µg/ml)
445,2/540-847
M. luteus
6
4-5
Toevoegingen en hun effect op de activiteit
Penicillinase
1% NaCl
Literatuur
0,2% KH2PO4
+
14/8
334,4/356
M. luteus
6
0,01
+
14/8
349,4
M. luteus
6
0,06
+
14
Bacitracine
1422,7
M. luteus
6
0,6
-
14
Polymyxine
1203,5
M. luteus
6
Virginiamycine
525,6-823,9
M. luteus
6
0,1-0,2
-
Streptomycine
581,6
B. subtilis BGA
8
0,2
Avoparcine
1500
B. subtilis BGA
6
0,2
Neomycine
322,4/616
B. subtilis BGA
8
0,1
Kanamycine
484,5/600
B. subtilis BGA
8
0,9
Gentamycine
477,6
Spectinomycine
332,4
B. subtilis BGA
8
30
Flavomycine
1592
M. luteus
8
Lincomycine
406,5
M. luteus
8
Tylosine
-
TMP
Ampicilline
14
+
18
-
-
14
-
-
16
-
-
14/8
-
-
14/8
-
-
14
-
-
-
14
0,4
-
-
-
19
0,3
+
-
-
14
+
904
M. luteus
8
0,2
+
17
843,1/800-900
M. luteus
8
0,4
+
17/8
Oleandomycine
687,9
M. luteus
8
0,05
+
14
Erythromycine
733,9/733
M. luteus
8
0,05
+
14/8
Tetracycline
Spiramycine
Tetracyclines
Molmassa
-
444,4/444
B. subtilis BGA
6
0,5
Chloortetracycline
478,9
B. subtilis BGA
6
0,06
Oxytetracycline
460,4
B. subtilis BGA
6
0,1
-
14
225
B. subtilis BGA
6
0,4
+
20
172-588
B. subtilis BGA
6
40
++
7,2
0,3
Nitrofuranen
Nitro furazolidone
Sulfonamides
Sulfadimidine
B. subtilis BGA + TMP
-
14/8
14
-
8
+: remzone wordt groter
-: remzone wordt kleiner of verdwijnt geheel (penicillinase)
LAB 25 I-MET-FLVVT-058 - Screeningstest Antibacteriële Stoffen (7 platen bioautografisch systeem) v.04 17/19
SCREENINGSTEST ANTIBACTERIËLE STOFFEN IN DIERENVOEDERS (7-PLATEN BIOAUTOGRAFISCH SYSTEEM)
Bijlage 2
Overzicht rapportering
Keuze in LIMS
Tekst op rapport
Afwezig
Geen antimicrobiële activiteit
Aanwezig
Aanwezig
A op BS
Activiteit op Bacillus subtilis (niet noodzakelijk afkomstig van antibiotica).
A op ML,BS
Activiteit op Micrococcus luteus en Bacillus subtilis (niet noodzakelijk afkomstig van antibiotica).
A op ML
Activiteit op Micrococcus luteus (niet noodzakelijk afkomstig van antibiotica).
A op ML(flav),BS
Activiteit op Micrococcus luteus (flavus) en Bacillus subtilis (niet noodzakelijk afkomstig van antibiotica).
A op ML(flav)
Activiteit op Micrococcus luteus (flavus) (niet noodzakelijk afkomstig van antibiotica).
A op ML,ML(flav),BS
Activiteit op Micrococcus luteus, Micrococcus luteus (flavus) en Bacillus subtilis (niet noodzakelijk afkomstig van antibiotica).
A op ML,ML(flav)
Activiteit op Micrococcus luteus en Micrococcus luteus (flavus) (niet noodzakelijk afkomstig van antibiotica).
A op BS: conform
A op BS: verdacht
A op ML,BS: conform
A op ML,BS: verdacht
A op ML: conform
A op ML: verdacht
A op ML(flav),BS: conform
Activiteit op Bacillus subtilis (niet noodzakelijk afkomstig van antibiotica).
Beoordeling: conform; aanwezigheid van achtergrondcontaminatie
Activiteit op Bacillus subtilis (niet noodzakelijk afkomstig van antibiotica).
Beoordeling: verdacht; verder onderzoek noodzakelijk (monster vertoont activiteit die mogelijk wijst op aanwezigheid van additieven)
Activiteit op Micrococcus luteus en Bacillus subtilis (niet noodzakelijk afkomstig van antibiotica).
Beoordeling: conform; aanwezigheid van achtergrondcontaminatie
Activiteit op Micrococcus luteus en Bacillus subtilis (niet noodzakelijk afkomstig van antibiotica).
Beoordeling: verdacht; verder onderzoek noodzakelijk (monster vertoont activiteit die mogelijk wijst op aanwezigheid van additieven)
Activiteit op Micrococcus luteus (niet noodzakelijk afkomstig van antibiotica).
Beoordeling: conform; aanwezigheid van achtergrondcontaminatie
Activiteit op Micrococcus luteus (niet noodzakelijk afkomstig van antibiotica).
Beoordeling: verdacht; verder onderzoek noodzakelijk (monster vertoont activiteit die mogelijk wijst op aanwezigheid van additieven)
Activiteit op Micrococcus luteus (flavus) en Bacillus subtilis (niet noodzakelijk afkomstig van antibiotica).
Beoordeling: conform; aanwezigheid van achtergrondcontaminatie
LAB 25 I-MET-FLVVT-058 - Screeningstest Antibacteriële Stoffen (7 platen bioautografisch systeem) v.04 18/19
SCREENINGSTEST ANTIBACTERIËLE STOFFEN IN DIERENVOEDERS (7-PLATEN BIOAUTOGRAFISCH SYSTEEM)
A op ML(flav),BS: verdacht
A op ML(flav): conform
A op ML(flav): verdacht
A op ML,ML(flav),BS: conform
A op ML,ML(flav),BS: verdacht
A op ML,ML(flav): conform
A op ML,ML(flav): verdacht
Activiteit op Micrococcus luteus (flavus) en Bacillus subtilis (niet noodzakelijk afkomstig van antibiotica).
Beoordeling: verdacht; verder onderzoek noodzakelijk (monster vertoont activiteit die mogelijk wijst op aanwezigheid van additieven)
Activiteit op Micrococcus luteus (flavus) (niet noodzakelijk afkomstig van antibiotica).
Beoordeling: conform; aanwezigheid van achtergrondcontaminatie
Activiteit op Micrococcus luteus (flavus) (niet noodzakelijk afkomstig van antibiotica).
Beoordeling: verdacht; verder onderzoek noodzakelijk (monster vertoont activiteit die mogelijk wijst op aanwezigheid van additieven)
Activiteit op Micrococcus luteus, Micrococcus luteus (flavus) en Bacillus subtilis (niet noodzakelijk afkomstig van antibiotica).
Beoordeling: conform; aanwezigheid van achtergrondcontaminatie
Activiteit op Micrococcus luteus, Micrococcus luteus (flavus) en Bacillus subtilis (niet noodzakelijk afkomstig van antibiotica).
Beoordeling: verdacht; verder onderzoek noodzakelijk (monster vertoont activiteit die mogelijk wijst op aanwezigheid van additieven)
Activiteit op Micrococcus luteus en Micrococcus luteus (flavus) (niet noodzakelijk afkomstig van antibiotica).
Beoordeling: conform; aanwezigheid van achtergrondcontaminatie
Activiteit op Micrococcus luteus en Micrococcus luteus (flavus) (niet noodzakelijk afkomstig van antibiotica).
Beoordeling: verdacht; verder onderzoek noodzakelijk (monster vertoont activiteit die mogelijk wijst op aanwezigheid van additieven)
LAB 25 I-MET-FLVVT-058 - Screeningstest Antibacteriële Stoffen (7 platen bioautografisch systeem) v.04 19/19

Download Report